Method Article

Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten KCNJ10 (Kir4.1)

DOI:

10.3791/52406

⸱

September 26th, 2015

 , 
1Department of Cell Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-methylatie is in staat om stabiele niveaus van genregulatie te handhaven, evenals dynamische veranderingen in genregulatie mogelijk te maken als reactie op verschillende stimuli. We beschrijven technieken die het mogelijk maken om gen-specifieke veranderingen in DNA-methylatie en de invloed van deze veranderingen op genregulatie te bestuderen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-methylatie dient om genexpressie te reguleren door de covalente binding van een methylgroep op de C5-positie van een cytosine in een cytosine-guanine-dinucleotide. Hoewel DNA-methylatie langdurige en stabiele veranderingen in genexpressie veroorzaakt, zijn patronen en niveaus van DNA-methylatie ook onderhevig aan verandering op basis van een verscheidenheid aan signalen en stimuli. Als zodanig functioneert DNA-methylatie als een krachtige en dynamische regulator van genexpressie. De studie van neuro-epigenetica heeft een verscheidenheid aan fysiologische en pathologische toestanden onthuld die geassocieerd zijn met zowel globale als gen-specifieke veranderingen in DNA-methylatie. Specifiek bestaan er opvallende correlaties tussen veranderingen in genexpressie en DNA-methylatie bij neuropsychiatrische en neurodegeneratieve aandoeningen, tijdens synaptische plasticiteit en na een CZS-letsel. Echter, naarmate het veld van neuro-epigenetica zijn begrip van de rol van DNA-methylatie in de CZS-fysiologie blijft uitbreiden, zijn causale relaties in verband met veranderingen in genexpressie en DNA-methylatie essentieel. Bovendien, met betrekking tot het grotere veld van de neurowetenschappen, vereisen de aanwezigheid van uitgebreide regio- en celspecifieke verschillen technieken die deze variaties aanpakken bij het bestuderen van het transcriptoom, proteoom en epigenoom. Hier beschrijven we FACS-sortering van corticale astrocyten die een vervolgonderzoek mogelijk maakt van zowel RNA-transcriptie als DNA-methylatie. Verder beschrijven we een techniek om DNA-methylatie te onderzoeken, methylatie-gevoelige hoge resolutie smeltanalyse (MS-HRMA) evenals een luciferase promotor-assay. Door het gebruik van deze gecombineerde technieken is men niet alleen in staat om correlatieve veranderingen tussen DNA-methylatie en genexpressie te onderzoeken, maar ook om direct te beoordelen of veranderingen in de DNA-methylatiestatus van een bepaald gengebied voldoende zijn om transcriptionele activiteit te beïnvloeden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetics is de studie van chemische modificaties die de transcriptionele activiteit van het genoom kunnen beïnvloeden. Essentieel, zonder een verandering in de DNA-sequentie, zijn epigenetische modificaties zoals DNA-methylatie, histon-acetylatie en histon-methylatie voldoende om patronen van genexpressie 1omkeerbaar te veranderen. DNA-methylatie, een krachtige regulator van genexpressie, is de meest goed gekarakteriseerde epigenetische modificatie. DNA-methylatie is de covalente binding van methylgroepen op de C5-positie van een cytosine, meestal de cytosine van een cytosine-guanine dinucleotide, ook bekend als een CpG-site. Gebieden met een hoge dichtheid aan CpG-sites staan bekend als CpG-eilanden (CGI's). CGI's worden vaak geassocieerd met transcriptionele startplaatsen (TSS) en genpromotors 1-3. Dus, terwijl veranderingen in DNA-methylatie bij CGI's niet altijd samengaan met veranderingen in cellulaire expressie of functie, kunnen veranderingen in DNA-methylatie bij CGI's krachtige regulatie uitoefenen op transcriptionele activiteit 2.

Histologisch werd DNA-methylatie gezien als essentieel in embryogenese, imprinting en ontwikkeling, met weinig veranderingen in de niveaus van DNA-methylatie die plaatsvinden in post-mitotische cellen (met uitzondering van veranderingen in kanker-gerelateerde genen) 4,5. Echter, het veld van neuro-epigenetica heeft een belangrijke niet-ontwikkelingsrol voor DNA-methylatie benadrukt. Specifiek heeft cognitieve epigenetica DNA-methylatie herdefinieerd als een zeer plastisch mechanisme dat integraal is in het mediëren van zowel de transcriptionele activering als repressie van genen die essentieel zijn voor het proces van leren en geheugen 6. Afgezien van cognitieve epigenetica, karakteriseren studies die ischemische schade en neuropathische pijn modelleren DNA-methylatie als een labieel mechanisme dat snel reageert op een verscheidenheid aan CNS-letsels 7-9. Wat betreft astrocyten, suggereren verschillende bewijslijnen dat DNA-methylatie een belangrijke rol speelt in astrogliogenese. Fan et al., vonden dat conditionele KO van DNMT1 in neurale progenitorcellen (NPC's) resulteerde in vroegtijdige ontwikkeling van astrocyten, in overeenstemming met een globale toestand van hypomethylatie 10. Bovendien concludeerden Perisic et al., dat differentiële niveaus van DNA-methylatie van de GLT-1 promotor differentiële niveaus van expressie van de glutamaattransporter in de cortex en cerebellum medieerden, wat een rol benadrukt van DNA-methylatie in het vestigen van hersengebied-specifieke patronen van astrocytaire genexpressie 11. Al met al onderstrepen talrijke studies de dynamische en labiele aard van DNA-methylatie in het CNS aangezien omgeving, medicijnen en letsel allemaal zijn aangetoond DNA-methylatie te veranderen en vaak, genexpressie 4,9. Samen wijzen deze neuro-epigenetische studies op DNA-methylatie als een haalbaar therapeutisch doelwit met het potentieel om een verscheidenheid aan CNS-pathologieën te mitigeren.

Naarmate het veld van epigenetica zijn begrip van de rol van DNA-methylatie in neuro-ontwikkeling en ziekte uitbreidt, is de uitdaging om DNA-methylatie naar een therapeutisch doelwit te verplaatsen het uitvoeren van niet alleen correlatieve, maar oorzakelijke studies die specifieke gendoelwitten en -plaatsen definiëren. Bovendien blijft het onderzoeken van veranderingen in DNA-methylatie specifiek voor hersengebied en celtype een doorlopende en tijd waardige uitdaging die uniek is voor het veld van neuro-epigenetica. Dit protocol gebruikt een verscheidenheid aan technieken, inclusief fluorescentie-geactiveerd celsorteren (FACS) van astrocyten, methylatie-gevoelige hoog-resolutie smeltanalyse (MS-HRM) en een methylatie luciferase-assay om de DNA-methylatiestatus van KCNJ10 te onderzoeken, een gen dat codeert voor Kir4.1. Kir4.1 is een gliac-specifiek kaliumkanaal dat zowel hersengebied als cel-specifieke patronen van expressie in het CNS aantoont 12-16. Kir4.1 expressie neemt toe bij het bewegen van rostrale naar caudale CNS-gebieden, met de hoogste expressie in het ruggenmerg 15. Hoewel het kanaal wordt uitgedrukt in ependymale cellen, oligodendrocyten en hun precursorcellen, wordt Kir4.1 voornamelijk tot expressie gebracht in astrocyten en wordt gedacht essentieel te zijn voor het handhaven van homeostatische niveaus van kalium, evenals het ondersteunen van glutamaat-opname door het astrocyten rustmembraanpotentiaal op een gehyperpolariseerde -80mV te stellen 12,16-19. Belangrijk is dat de expressie van Kir4.1 niet-statisch is zowel tijdens ontwikkeling als na meerdere vormen van CNS-letsel 20-25. We wilden de epigenetische regulatie van dit kanaal onderzoeken, specifiek in astrocyten tijdens ontwikkeling. De gebruikte technieken bieden gen-specifieke en gerichte CpG-site analyses die causaal bewijs leveren voor een rol van DNA-methylatie in het reguleren van KCNJ10 genexpressie. Deze technieken kunnen op andere genen worden toegepast.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dieren werden behandeld volgens de National Institutes of Health richtlijnen. De Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Alabama in Birmingham goedgekeurde gebruik van dieren.

1. Het verkrijgen van RNA en DNA van een verrijkte astrocyten Bevolking met behulp van TL Activated Cell Sorting (FACS) van Astrocyten van Whole Brain Tissue

  1. Bezadigd dier met CO 2 gedurende 1 minuut en vervolgens snel onthoofden. Ontleden cortex zoals beschreven in Albuquerque et al, 26.; Het is niet noodzakelijk hersenvliezen verwijderd.
    Opmerking: Transgene ratten uitdrukken eGFP onder de S100β (een astrocyten marker) promotor werden gegenereerd door Itakura et al 27 en gebruikt voor FACS sorteren van astrocyten..
  2. Bereid hele hersenhomogenaat met een papaïne dissociatie kit onder niet-steriele omstandigheden volgens het protocol van de fabrikant. Heat activeren papaïne bij 37 ° C in een waterbad gedurende 10 min. Let op:Papaïne oplossing wordt geleverd door fabrikant en bevat L-cysteïne en EDTA (Zie tabel van Materialen).
    1. Snij of dremel een opening in de top van een 50 ml conische buis te laten uitvoeren buizenstelsel 95% O2: 5% CO 2 wordt toegevoerd aan een gesloten conische buis (figuur 1A). Plaats ontleed cortex in 10 mm kweekschaal met dissociatie medium (MEM gesupplementeerd met 20 mM glucose en penicilline / streptomycine (500 U / ml) en geëquilibreerd met 95% O2: 5% CO 2) en gebruik een schoon scheermesje om weefsel te vermalen in 1 x 1 mm 2 stuks.
  3. Overdracht weefsel met behulp van 10 ml handmatige pipetman met 50 ml conische buis met papaïne oplossing. Sta weefsel om zich te vestigen op bodem van transferpipet alvorens af te voeren om de hoeveelheid dissociatie media overgedragen minimaliseren. Houd papaïne oplossing geëquilibreerd met 95% O2: 5% CO 2 via oppervlakte gasuitwisseling voor de duur van de incubatie. Niet bubble papaine solutiop. Incubeer weefsel voor 20 min in 37 ° C waterbad.
  4. Na incubatie in papaïne oplossing, vermaal weefsel 10 keer met een 10 ml transferpipet bij lage snelheid. Centrifuge bewolkte celsuspensie bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    1. Equilibreer DNase / albumine-remmer oplossing (geleverd door de fabrikant) via oppervlak gasuitwisseling en resuspendeer gepelleteerde cellen in 3 ml DNase / albumine-remmer oplossing. Bereid commerciële gradiënt discontinue dichtheid volgende instructies van de fabrikant.
  5. Spin discontinue gradiënt dichtheid bij 1000 xg gedurende 6 min. Isoleer gedissocieerde cellen van de bodem van de buis zuigen bodem pellet met behulp van een pipet.
  6. Resuspendeer gedissocieerde cellen in 2-3 ml van DPBS met 0,02% runderserumalbumine en 1 mg / ml DNase of gewenste HEPES gebufferd kweekmedium. Passeren 40 urn filter vóór FACS (Figuur 2A). Houd cellen op ijs tot het sorteren.
    1. Voeren FACS 28.
    2. Pellet cellen in 1,5 ml centrifugebuizen bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
      Opmerking: Gepelleteerd astrocyten kan onmiddellijk worden gebruikt of -80 ° C bewaard totdat DNA-extractie.
  7. Extract RNA en DNA met aangewezen isolatie methode 29 30. Beoordelen RNA en DNA-concentratie en kwaliteit via de spectrofotometer en bioanalyzer 31.
    Opmerking: Gebruik alleen hoge kwaliteit RNA en DNA in de daaropvolgende stappen, 260/280 = 2,0-2,2 en 1,8-1,9, respectievelijk. Bioanalyzer analyse is essentieel om na afbraak van RNA of DNA fragmentatie. RNA of DNA kan direct worden gebruikt of opgeslagen in -80 ° C of -20 ° C, respectievelijk latere studies.

2. Het beoordelen van DNA methylatie status van een gen met methylatie-gevoelige met hoge resolutie Melt Analyse (MS-HRMA)

  1. Voer gen sequentie van belang in de voorkeur online methylatie mapping software om elke CpG eilanden in gen te identificerenvan belang 32.
    1. Ontwerp van primers tegen bisulfiet omgezet DNA-sequentie 33 en versterken met behulp van geprefereerde DNA polymerase volgens het protocol van de fabrikant. Controleer Amplified productgrootte worden uitgevoerd door een 1% agarose gel van DNA bij 100 V gedurende 45 min. WINKEL primers op voorraad concentratie van 20 uM bij -20 ° C.
  2. Bisulfiet omgezet 500-1000 ng DNA van elk monster en gemethyleerd DNA standaarden variërend van 0-100% van dezelfde diersoort 34. Elueer monsters tot een concentratie van 20 ng / ul verschaffen. Controleer de concentratie van bisulfiet geconverteerde DNA via spectrofotometer 31.
  3. Setup 20 gl reacties voor MS-HRM amplificatie met gewenste DNA polymerase en primers aan 5 uM concentratie overeenkomstig tabel 1 en 2. Uitvoeren alle monsters, inclusief FACS DNA en gemethyleerde standaarden in drievoud.
  4. Afhankelijk analysesoftware, vastgesteld voor en na de start en stop parametersrond de overgangen van de smelt curve. Set pre-melt start en pre-smelt stop parameters, zodat het verschil tussen beide is 0,2-0,5 ° C. Set post-smelt start en post-smelt stoppen op vergelijkbare wijze. Extract piek temperatuurverschil gegevens voor elk monster.
  5. Met behulp procent gemethyleerde standaarden (y-waarde) en de bijbehorende gemiddelde piek temperatuurverschillen (x-value) genereren van een lineaire regressievergelijking (figuur 3A-B, tabel 3-4). Gebruik deze lineaire regressie vergelijking om methylatie status van onbekende monsters 35 schatten.

3. Het beoordelen van Hyper-gemethyleerd promotor activiteit via Gebruik van Luciferase Assay

  1. Identificeer CpG eilanden van target-gen (Stap 2.1). PCR versterken regio's van belang 36 en kloon stroomopwaarts van de luc2 Firefly luciferasereportergen om CpG-eiland-luc2 plasmiden 37 te produceren.
  2. Lineariseren 30 ug CpG-eiland-luc2 plasmide via beperkingenzymdigestie 38. Controleer voor restrictie digest en voorkoming van dubbele sneden met favoriete mes software 38. Heat-enzymen inactiveren bij geschikte temperatuur en tijdsduur na digestie volgens het protocol van de fabrikant. Minimaal verlies van DNA optreedt tijdens de linearisatie stap.
  3. Methylaat gelineariseerde plasmiden met CpG methylase (M.Sssl) O / N bij 30 ° C of laat onbehandeld volgende fabrikant protocol, behalve voor de volgende aanpassingen.
  4. Voer 50 pi reacties.
  5. Gebruik 5 eenheden van CpG methylase tot 700 ng gelineariseerde plasmide methyleren.
  6. Run reacties O / N voor 13-19 uur.
  7. Na CpG methylase reactie uitgevoerd met behulp van standaard DNA opruimen handel verkrijgbare silicagel membraan schoonmaken kit volgens protocol van de fabrikant. Aanzienlijke verliezen van DNA optreden na CpG methylase reactie, 30-60% verlies.
  8. Controleer methylering van plasmiden via een Hpa II restrictiedigest.
  9. Neem 1 ug van gemethyleerd of niet-gemethyleerd DNA en restrictie digest met Hpa II gedurende 1 uur bij 37 ° C. Gebruik 5-10 eenheden van Hpa II voor elk ug DNA. Na Hpa II vertering uitvoeren DNA opruimen behulp voorkeur, in de handel verkrijgbaar silicagel membraan schoonmaken kit. Run zowel CpG gemethyleerd en niet-gemethyleerd plasmiden op 1% agarose gel in TAE-DNA of TBE buffer bij 100 V gedurende 45 min voor het zichtbaar (Figuur 4B).
  10. Betreft zowel gemethyleerde en niet-gemethyleerde plasmiden dubbele digestie met geschikte restrictie-enzymen om full-length luc 2 (vector) en CpG eiland (insert) fragmenten 38 vrijgeven. Voeren dubbele ontsluiting O / N op de juiste temperatuur en warmte-inactiveren enzymen volgende spijsvertering volgens het protocol van de fabrikant. Minimaal verlies van DNA-concentratie optreedt tijdens dubbele restrictiedigest.
  11. Run double verteerd plasmiden op 1% DNA agarosegel bij 100 V gedurende 1 uur toe te staan ​​voor de scheiding of vector en plaats (Figuur 4C). Voorzichtigheid. Het dragen van beschermende UV-gezichtsbescherming, plaatsen DNA-gel op een tafelblad zwart licht aan banden te visualiseren. Op basis van grootte, accijnzen gemethyleerde en niet-gemethyleerde insert en niet-gemethyleerde vector met een schone chirurgische mes.
  12. Gel extract DNA met verzadigd fenol, pH 6,6. In het kort, wegen DNA gel met vector of insert. Gebruik 100 ul fenol per 0,1 gram DNA gel. Homogeniseren DNA gel in fenol met behulp van glas Dounce homogenisator.
  13. Chloroform (met 1/5 van fenol volume) toe en schud monsters voor 20 sec. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 2-3 min. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij maximale snelheid (16,1 x 1.000 x g) bij 4 ° C.
  14. Verwijder waterige oplossing en voeg 0,1X volume van 3 M natriumacetaat en 2,5 maal volume ethanol. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij -80 ° C. Na incubatie verwijderen ethanol en resuspendeer DNA in 30 ui buffer voorkeur. Aanzienlijk verlies van DNA optreedt na isolatie van inserts en vectoren, 30-50% loss.
  15. Opnieuw Ligeer gemethyleerde en niet-gemethyleerde inzetstukken voor niet-gemethyleerd vector met behulp van T4 DNA-ligase 38. Met een 1: 4 verhouding van vector in te voegen voor ligatiereacties. Setup reactie volgens instructies van de fabrikant. Gebruik een totaal volume van 50 pi voor reacties en geïncubeerd O / N bij -20 ° C of op ijs met deksel over ijs emmer.
  16. Na ligatie uitgevoerd DNA opruimen behulp voorkeur, in de handel verkrijgbaar silicagel membraan schoonmaken kit. Aanzienlijk verlies van DNA optreden na ligatiereactie, bij benadering 30-50% verlies van DNA. Controleer opnieuw ligatie door lopen op 1% agarose gel van DNA bij 100 V gedurende 45 minuten en evalueren concentratie van het opnieuw geligeerde plasmiden (figuur 4D).
  17. Transfecteren gemethyleerd of niet-gemethyleerd plasmiden in D54-cellen onder toepassing van een commercieel transfectie reagens volgens het protocol van de fabrikant. Seed D54 cellen op 12-well plaat op een 0,14 x 10 6 cellen / well.
  18. Na 24 uur, transfecteren cellen with gelijke concentraties van ofwel (1) niet methyated CpG-luc2 plasmide + Renilla of andere controle-luciferase vector of (2) gemethyleerde CpG-luc2 plasmide + Renilla of andere controle-luciferase vector.
  19. Laat cellen te transfecteren voor 24 uur voordat duale luciferasetest. Voer bepaling volgens instructies van de fabrikant. Voer metingen met behulp van een luminometer. Lees elk putje in drievoud.
  20. Bereken verhouding firefly luciferase activiteit Renilla of andere controle-luciferaseactiviteit. Normaliseren gemethyleerde Firefly: controle luciferase activiteit niet-gemethyleerd Firefly: controle luciferase activiteit met gemethyleerd luciferasewerkzaamheid delen door niet-gemethyleerd luciferaseactiviteit

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een verrijkte populatie van astrocyten werd verworven via FACS sortering van eGFP-S100β transgene dieren 27. Door afnemende kwaliteit van cellen en moleculair molecules die uit dieren ouder dan postnatale dag 50 (p50), dieren p0-p40 ouder zijn optimaal voor dergelijke experimenten. Corticaal weefsel werd gebruikt voor deze experimenten. Cortex vanaf 2 om 6 dieren werden samengevoegd. FACS werd uitgevoerd bij UAB Comprehensive flowcytometrie Core faciliteit. Sorteren werd uitgevoerd op Becton Dickinson FACSAri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de isolatie van een verrijkte populatie van astrocyten via FACS, evenals een verscheidenheid aan technieken die zowel correlatieve als causale studies mogelijk maken tussen DNA-methylatie en genexpressie. Deze technieken, gebruikt in isolatie of in combinatie, zijn bijzonder nuttig voor laboratoria die werken met weefsel van hoge cellulaire heterogeniteit of die geïnteresseerd zijn in de DNA-methylatiestatus van een bepaald gen of gengebied versus globale DNA-methyleringsveranderingen. Een relatie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen openbaarmakingen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door R01NS075062-01A1. FACS-sortering uitgevoerd in de UAB Comprehensive Flow Cytometry Core-faciliteit (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips van de UAB Neurobiology Core-faciliteit en Dr. Susan Nozell van de UAB CDIB hebben geassisteerd met technische aspecten van de luciferase-assay.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150
AllPrep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
Methyl PrimerApplied Biosystemsonlinesoftware om CpG-eilanden te lokaliseren
EZ DNA methylation KitZymo ResearchD5001
Rat Premixed Calibration StandardEpiGenDx80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAquick Gel Extraction QIagen28704Gebruikt voor gelextractie en DNA-opruiming
Restriction enzymesNew England BioLabs
NEB cutterNew England BioLabsonlineverificatie van restrictie-digestieplaatsen
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Luc2 vector, pGL4.10PromegaE6651
renilla vector, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometerTurner Designs
Lipofectamine LTX and Plus ReagentLife TechnologiesA12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c SpectrophtometerThermoScientific
MeltDoctor Master MixLife Technologies4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0Life Technologies4397808
AB SDS software v2.3Life Technologiesonline
AB High Resolution Melting Getting Started Guide Life Technologiesonline
AB 7900HT Fast Real-Time SystemLife Technologies

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
  4. Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
  5. Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
  6. Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
  7. Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
  8. Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
  9. Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
  10. Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
  11. Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
  12. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  13. Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
  14. Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
  15. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  16. Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
  17. Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
  18. Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
  19. Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
  20. MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
  21. Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
  22. Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
  23. Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
  24. Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
  25. Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
  26. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
  27. Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
  28. Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
  29. Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
  31. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
  32. Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
  33. Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
  34. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
  35. Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
  37. Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
  38. Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
  39. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
  40. Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
  41. Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
  42. Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
  43. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  44. Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
  45. Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  46. Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
  47. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  48. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
  49. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
  50. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA MethylationGene ExpressionAstrocyte IsolationFACS SortingMS HRMALuciferase AssayKCNJ10 PromoterTranscriptional ActivityMethylation Sensitive High Resolution Melt AnalysisCortical Astrocytes

Related Articles