Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren

Samenvatting

Bevruchte kippeneieren worden veel gebruikt om grote hoeveelheden humaan influenza A-virus te produceren, omdat ze een handig en kosteneffectief systeem bieden om hoge opbrengsten van het virus te bewijzen.

Samenvatting

Influenza infectie is geassocieerd met ongeveer 36.000 doden en meer dan 200.000 ziekenhuisopnames per jaar in de Verenigde Staten. De continue opkomst van nieuwe influenzavirusstammen door mutatie en recombinatie bemoeilijkt de controle van het virus en vereist de permanente ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en vaccins. Het laboratoriumonderzoek van influenza is een betrouwbare en kosteneffectieve werkwijze voor de vermeerdering van het virus. Hier wordt een uitgebreid protocol waarin influenza A virus propagatie in vruchtbare kippeneieren, die consequent levert hoge titer virale voorraden. Kortom, zijn serum pathogeenvrije (SPF) bevruchte kippeneieren geïncubeerd bij 37 ° C en 55-60% luchtvochtigheid gedurende 10 - 11 dagen. Gedurende deze periode, kan ontwikkeling van het embryo gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van een ei candler. Virusinoculatie wordt uitgevoerd door injectie van het virus voorraad verricht naar de allantoïsholte behulp van een naald. Na 2 dagen incubatie bij 37 ° C, de eierengekoeld gedurende ten minste 4 uur bij 4 ° C. De eierschaal boven de luchtzak en het chorioallantoïsmembraan worden vervolgens voorzichtig geopend en de allantoïsvloeistof met het virus geoogst. De vloeistof wordt uit afval door centrifugatie geklaard porties verdeeld en overgebracht naar -80 ° C voor langdurige opslag. De grote hoeveelheid (5-10 ml virus bevattende vloeistof per ei) en hoge virustiter die meestal bereikt met dit protocol is het gebruik van eieren voor viruspreparaat voordelige wijze gemaakt, met name voor in vitro studies die grote hoeveelheden nodig virus waarbij hoge doseringen van hetzelfde virus voorraad nodig.

Inleiding

Influenza A blijft een belangrijke bedreiging voor de menselijke gezondheid. Het is een potentieel verwoestende ziekte van de luchtwegen met een grote globale last veroorzaken tot 500.000 doden wereldwijd per jaar ^1. Influenza virussen zijn in de familie Orthomyxoviridae en uitvoeren 8 negatieve-sense enkelstrengs RNA in hun genoom ^1,2. De hoge veranderlijkheid (dwz antigene "drift") van het virale genoom voorkomt langdurige immuniteit. Bovendien influenza steeds resistent tegen antivirale geneesmiddelen ^3.

De 2009 H1N1-grieppandemie gemarkeerd alle uitdagende kwesties in verband met influenza ziekte (pandemische stam, anti-virale resistentie, vertraagde de productie van vaccins). De formulering vaccin wordt jaarlijks vastgesteld door de World Health Organization voor de meest waarschijnlijke pathogene influenza stammen (een voor elk van H1N1, H3N2 en influenza B) ^4. Omdat deze methode is gebaseerd op de voorspelde influenzastams, pathogene stammen worden soms ten onrechte geïdentificeerd en effectiviteit van het vaccin daalt dramatisch. Bovendien kan de verschijning van nieuwe influenzastammen deze preventieve programma's veroorzaken pandemische ziekte ² te omzeilen.

De creatie van een universeel griepvaccin is ongrijpbaar ⁵ geweest. Daarom moet het onderzoek voort te zetten naar het begrijpen van de pathogenese van longschade. Om faciliteit laboratoriumonderzoek zijn verscheidene werkwijzen ontwikkeld voor virale isolatie en vermeerdering ^6. Menselijke influenzavirussen kan worden geamplificeerd in verschillende zoogdiercel substraten. Echter, zijn het genereren van hoge titer virussen in grote hoeveelheden best bereikt in bebroede eieren. Het volgende protocol beschrijft een techniek voor influenza A virus verspreiding en opslag van bestaand virus voorraden.

Protocol

OPMERKING: Algemene opmerkingen: Voer alle procedures waarbij manipulatie van het ei onder steriele omstandigheden, en steriele techniek moet dienovereenkomstig worden gebruikt. Pre-clean alle apparatuur met 70% ethanol voor gebruik. In het algemeen moeten influenza virus inoculatie en oogst worden uitgevoerd in een BSL-2 laboratorium. Echter, als dit protocol wordt gebruikt om zich te verspreiden veel meer pathogene influenza virussen (bv pandemie en pre-pandemische stammen, stammen die een gevaar voor pluimvee en vee, hoogpathogene aviaire influenza stammen, de 1918 H1N1-stam vormen), hogere bioveiligheid niveaus en in sommige gevallen, zijn biosecurity voorzorgsmaatregelen en vergunningen vereist. De lokale institutionele bioveiligheid comité moet al het onderzoek met het influenzavirus te keuren.

1. Voorbereiding van Eieren voor Inenting

1. Verkrijgen serum-pathogeen vrij (SPF) vers bevruchte vogeleieren van een geschikte leverancier. Gewoonlijk worden kippeneieren gebruikt. Eieren moeten onsed direct na aankomst.
2. Bij aankomst plaats eieren in een bevochtigde ei incubator met een automatische ei turner om eieren regelmatig draaien. Als een automatische ei turner niet beschikbaar is, handmatig draaien eieren minstens 2-3 keer per dag (zorg ervoor om handschoenen te dragen en houden alles zo steriel mogelijk).
3. Incubeer eieren bij 37 ° C en 55-60% vochtigheid 10-11 dagen.

2. schouwinrichtingen

1. Gebruik een ei candler het ei tegen een helder licht onderzoeken in een donkere kamer om eieren onvruchtbaarheid checken schouwen na ongeveer 7 of 8 dagen incubatie.
   1. Veeg het ei candler met 70% ethanol. Verander handschoenen vaak en desinfecteren met 70% ethanol om het risico op besmetting door ziekteverwekkers minimaliseren.
   2. Haal de eieren uit de broedmachine en plaats ze in lege eierdozen.
   3. Uitschakelen van de verlichting in de kamer.
   4. Houd het brede uiteinde van elk ei een voor een tegen candler.
   5. Observeer het ei te determine als het vruchtbaar of onvruchtbaar.
      OPMERKING: Dunne bloedvaten leidt tot een boonvormige embryo moet duidelijk zichtbaar zijn. Onbevruchte eieren zal verschijnen als een kleine bloedvlek met een zichtbare eigeel.
2. Gooi eieren die onbevrucht zijn, en de terugkeer van de levensvatbare eieren naar de incubator. Eieren niet verlaten buiten de incubator gedurende meer dan 30 min. Als de status van een ei niet kan worden bevestigd, markeren, en observeer het later.

3. Bereiding van virusinoculum

1. Verdun influenza virus stock tot ¹⁰ maart ^- 10 april pfu / ml in steriel PBS bevattende 10 mM HEPES (pH 7,4). Kritische stap: Verdun het virus voorraad direct voor gebruik en bewaar het verdunde virus op het ijs de hele tijd.

4. Influenza virusinoculatie via de allantoïs Route

1. Op de dag van virus inoculatie (dag 10 of 11), kaars de eieren opnieuw en dode embryo elimineren. Onderscheiden levend embryo's doorzoekt beweging in het ei.
2. Verwijder drie eieren uit de incubator, en leg de eieren in een aparte houder met de luchtzak up.
3. Markeren het luchtruim van de eieren met een permanent marker.
4. Was de eierschaal boven het luchtruim met 70% ethanol.
5. Doe de eieren met de luchtruimte in een eierdoos en in een bioveiligheid kap (BSL-2).
6. Gebruik een steriele 18G naald om een ​​klein gaatje te slaan in de shell over de luchtzak van elk ei. Wees voorzichtig dat u de naald te diep in te voegen om te voorkomen steken het embryo of de dooier.
7. Het opstellen van de verdunde influenzavirus in een steriele 1 ml spuit en bevestig een 22G naald.
8. Vooraf zorgvuldig de spuit met naald in een hoek van 45 ° in de allantoïsholte.
9. Injecteer 0,2 ml van de verdunde influenzavirus.
10. Herhaal de injectie met de andere twee eieren, en vervolgens de spuit en naald weg te gooien.
11. Dicht het gat met een druppel lijm uit een lijmpistool (of gesmolten paraffine). Be oppassen dat de lijm niet in het ei lekt.
12. Leg de eieren terug in het ei incubator met de luchtruimte omhoog gericht.
13. Herhaal stap 4,2-4,12 totdat alle eieren geïnoculeerd.

5. incubatietijd

1. Incubeer de besmette eieren zonder te draaien bij 37 ° C en ~ 60% vochtigheid.
2. Kies optimale incubatietijd afhankelijk van het influenzavirus. Incubeer influenza A gedurende 48 uur; incubeer influenza B en C voor 72 uur.

6. Influenza Virus Harvest

1. Na incubatie, koel de eieren bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur (of O / N) om de embryo te doden en de bloedvaten vernauwen om het risico van besmetting van de geïnfecteerde allantoïsvloeistof met bloed. Doe dit om te voorkomen dat rode bloedcellen absorberen het virus, die de opbrengst vermindert. Alternatief chill eieren gedurende 30 minuten bij -20 ° C; maar dit verhoogt het risico op besmetting bloed.
2. Nadat de eieren voldoende gekoeld zijn geweest, de overdracht van de eieren naar een bioveiligheid kap. Leg het ei in een stevige houder met de luchtzak naar boven. Reinig het ei oppervlak met 70% ethanol.
3. Gebruik steriele schaar om de eierschaal boven de luchtzak te openen. Verwijder de schil rond de luchtzak terwijl dat evenwel niet tot de chorioallantoïsmembraan vernietigen.
4. Open de chorioallantoïsmembraan met steriele stompe pincet. Beweeg terzijde het embryo en de dooierzak met een kleine spatel of lepel. Verzorgen de dooier niet te scheuren.
5. Met behulp van een 1 ml Eppendorf pipet voorzichtig het verzamelen van de allantoïsvloeistof. Indien nodig, kantel het ei een beetje naar de zijkant om zo veel vocht als mogelijk te verzamelen.
6. Combineer de allantoïsvloeistof van de eieren in een 50 ml plastic conische buis. Houd buizen op ijs te allen tijde tijdens virus oogst. Een ei opbrengsten 5-10 ml van een licht geelachtige vloeistof.
7. Spin de virus bevattende allantoïsvloeistof bij 1000 xg gedurende 10 min bij 46, C vuil pelleteren. Breng de heldere vloeistof in een nieuwe 50 ml buis op ijs bewaard. Gooi de eieren in een BSL-2 afvalcontainer.

7. Opslag

1. Onmiddellijk aliquot de geklaarde allantoïsvocht (bijvoorbeeld 50, 100 of 500 ul aliquots) en module bevriezen in vloeibare stikstof. Transfer bevroren virusvoorraden tot -80 ° C vriezer voor langdurige opslag.

Resultaten

Meerdere methoden ontwikkeld om influenzavirus titreren. Een overweging bij het ​​kiezen van een geschikte methode is dat sommige bepalen totale deeltjes onafhankelijk van de levensvatbaarheid (bijv hemagglutinine-test), terwijl anderen zijn gebaseerd op de besmettelijkheid, die levensvatbaar virusdeeltjes zal beoordelen (bijvoorbeeld plaque assay) ^6. Hier, de virale titer van allantoïsvloeistof vanuit kippeneieren geënt met een muis-aangepaste influenzavirus (A / PR / 8/34) werd bepaald doo...

Discussie

Influenza veroorzaakt een grote wereldwijde ziektelast, en werk gaat in het begrijpen van de pathogenese van longbeschadiging ^7. Om vergemakkelijkt onderzoek op dit dodelijke ziekte, zijn verschillende methoden ontwikkeld om het influenzavirus ⁶ propageren. Hier beschrijven we een techniek om influenzavirus produceren kippeneieren. Het voordeel van deze methode is dat het zeer reproduceerbaar en resulteert in grote hoeveelheden hoge titer influenzavirus bestanden, die vaak nodig is voor in vitr...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Phosphate buffered saline (PBS)	Cellgro	21-040-CV
serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs	VALO BioMedia
humidified egg incubator	FARM iNNOVATORS	Model 2100
automatic egg turner	FARM iNNOVATORS	Model 3200
egg candler	FARM iNNOVATORS	Model 3300
1 ml syringe	BD Bioscience	309659
18G needle	BD Bioscience	305196
20G / 22G needle	BD Bioscience	305176 / 305156
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Ethanol>99.5%	Sigma-Aldrich	459844	verdund tot 70% met water
glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro"	Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.	Model 1105
glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"	Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.	220-34ZIP30
MDCK cells	ATCC	CRL-2935
Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10%	Lampire Biological Laboratories	724908