Het doel van dit protocol is om de principes en technieken te demonstreren voor het meten en berekenen van glomerulaire filtratiesnelheid, urinestroomsnelheid en uitscheiding van natrium en kalium bij een rat. Deze demonstratie kan worden gebruikt om studenten een algemeen conceptueel begrip te geven van hoe nierfunctie kan worden gemeten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Physiology Lab Demonstratie: glomerulaire filtratiesnelheid in een Rat
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Metingen van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) en de fractionele excretie van natrium (Na) en kalium (K) zijn cruciaal bij het beoordelen van de nierfunctie bij gezondheid en ziekte. GFR wordt gemeten als de steady-state renale klaring van inuline, dat wordt gefilterd in het glomerulus, maar niet wordt uitgescheiden of gereabsorbeerd langs het nefroon. De fractionele excretie van Na en K kan worden bepaald uit de concentratie van Na en K in plasma en urine. De renale klaring van inuline kan worden gedemonstreerd in een geanesthetiseerd dier dat katheters heeft in de femorale slagader, femorale ader en blaas. De apparatuur en benodigdheden die voor deze procedure worden gebruikt, zijn die welke gewoonlijk beschikbaar zijn in een onderzoekskernfaciliteit, en maken deze procedure dus tot een praktische methode voor het meten van de nierfunctie. Het doel van deze video is om de procedures te demonstreren die nodig zijn om een labdemonstratie uit te voeren waarin de nierfunctie wordt beoordeeld vóór en na een diureticum. De gepresenteerde techniek kan worden gebruikt om de nierfunctie te beoordelen bij rattenmodellen van nierziekte.
Inleiding
De belangrijkste functie van de nier is de homeostatische regulatie van extracellulair water en elektrolytgehalte. De nieren reguleren extracellulair water, natrium (Na) en kalium (K) nauwkeurig om normale fysiologische niveaus te handhaven. Stoornissen in de nierfunctie kunnen leiden tot ernstige metabole stoornissen die fataal kunnen zijn. Het basale nierproces vindt plaats in het nefron en begint met de filtratie van plasma in het glomerulus en eindigt met de uitscheiding van urine. Andere processen die de uiteindelijke concentratie van water, Na en K in de urine bepalen, zijn secretie en reabsorptie binnen het nefron. Metingen van glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) en de fractionele uitscheiding van Na en K zijn cruciaal voor het beoordelen van de nierfunctie bij gezondheid en ziekte. De lezer wordt verwezen naar eerder gepubliceerde reviewartikelen en leerboeken voor een meer diepgaande bespreking van de nierfunctie1-4.
GFR kan worden gemeten als de steady state renale klaring van inuline die wordt gefilterd in het glomerulus, maar niet wordt uitgescheiden of gereabsorbeerd langs het nefron5. Hoewel deze techniek anesthesie, chirurgische voorbereiding en een terminaal experiment vereist, wordt het beschouwd als de gouden standaard voor GFR-meting. Door gebruik van inuline dat is gelabeld met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), kunnen de plasma- en urineconcentratie van FITC-inuline eenvoudig worden gemeten in kleine volumes en worden gebruikt om GFR te berekenen tijdens meerdere tijdstippen van een experiment. De fractionele uitscheiding van Na en K kan worden bepaald uit de concentratie van Na en K in plasma en urine.
Het conceptuele begrip van hoe de nierfunctie kan worden gemeten, kan eenvoudig worden gedemonstreerd in een korte lab die is ontworpen om studenten actief te laten deelnemen aan sommige aspecten van het experiment. Deze video toont de voorbereiding vóór het lab, de demonstratie van de nierfunctie en de evaluatie van de resultaten na het lab. De chirurgische technieken die nodig zijn voor het meten van GFR worden gedemonstreerd in een anesthetische rat. Bovendien worden voorbeeldberekeningen voor GFR en de fractionele uitscheiding van Na en K getoond vóór en na toediening van een diuretisch medicijn.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Voorafgaand aan elk dier procedure moet de institutionele dierlijke zorg en gebruik Comite (IACUC) het protocol goed te keuren. Dit protocol werd goedgekeurd door de Michigan State University IACUC.
1. Pre-lab Bereiding van FITC-inuline Solution
- Warm 20 ml zoutoplossing tot 70 ° C en langzaam roeren in 100 mg FITC-inuline (5 mg / ml FITC-inuline) totdat inuline opgelost.
- Koel oplossing tot kamertemperatuur en voeg 800 mg bovine serum albumine (40 mg / ml BSA, gelyofiliseerd poeder, in hoofdzaak globuline, lage endotoxine, ≥98% zuiverheid agarose gelelektroforese).
- Filter de inuline-BSA-oplossing met filter papier (graad 1). Plaats de gefilterde oplossing in een 20 ml spuit met een spuit-tip filter (0,2 micrometer) en dek af met folie te beschermen tegen licht.
2. Anesthesie en chirurgie
- Plaats de rat in een inductie kamer gevuld met 5% isofluraan anesthesie induceren. Record bodgewichtspercenten (250-350 g) en plaats de rat op een verwarmde chirurgische platform ontworpen om 37 ° C lichaamstemperatuur gedurende het experiment te handhaven. Voorzichtig zet de rat om het platform met laboratorium tape over de poten. Handhaving van anesthesie met 1-2% isofluraan met medische kwaliteit 100% O 2 op de luchtstroom snelheid van 0,8-1,0 l / min.
- Plaats een taps toelopende katheter (intravasculaire tip OD, 2.7F) in de femorale slagader voor de bloeddruk en hartslag, en bloedafname.
- Plaats een katheter (PE-50) in de femorale ader voor inuline infusie. Bevestig de katheter naar de omliggende weefsel met 5-O gevlochten zijde chirurgisch hechtdraad 6.
- Bevestig de arteriële katheter naar een spanningsmeter drukomzetter. Record bloeddruk en hartslag met behulp van data-acquisitie software en weergave op een computerscherm in real-time. Deze techniek wordt gedemonstreerd in detail op video 6.
- Expose de blaas via een suprapubische incisie. Snijd een kleingat in het uiteinde van de blaas en plaats een canule (PE-190) met een warmte uitlopende uiteinde binnenin de blaas urine inzameling. Bevestig de canule naar de blaas met een beurs-string hechtdraad.
3. Urine en bloedafname
- Plaats de spuit van FITC-inuline in een spuitpomp met een debiet ingesteld van 1 ml / uur per 100 g lichaamsgewicht (3 ml / uur gedurende een rat met een gewicht 300 g). Bevestig de spuit aan de dijader katheter. Start de inuline infusie en maken een 1-2 hr evenwicht periode. Houd spuit bedekt met een folie ter bescherming tegen licht.
- Bepaal of urinestroom stabiel en voldoende voor monsteranalyse (20 pl / min) door het verzamelen van een urinemonster in een vooraf gewogen collectie flesje gedurende 10 min. Bepaal urine volume gravimetrisch met een digitale weegschaal. Een adequate urine volume voor een 10 min collectie periode is 0,2 ml. Doorgaan met urinemonsters te verzamelen totdat twee opeenvolgende collecties geven een urine debiet van 20 ul / min of meer.
- Pre-Drug Samples
- Verzamel een urinemonster tijdens een 20 minuten periode. Neem een bloedmonster (0,5 ml) van de arteriële catheter in het midden van de urine verzamelperiode. Wees voorzichtig om helemaal duidelijk de arteriële catheter van zout voor het verzamelen van een bloedmonster in een verzameling flacon met 1 U heparine. Gebruik collectie flesjes met volume markeringen aan de collectie van 0,5 ml van arterieel bloed te vergemakkelijken.
- Spoel de arteriële catheter met heparine-zoutoplossing (20 U / ml) aan de katheter van bloed (ong. 0,1 ml) te wissen. De lengte van de arteriële katheter moet zo kort mogelijk het volume van heparine-zoutoplossing moeten spoelen beperken.
Opmerking: Verwaterde bloedmonsters produceren onjuiste berekeningen van de GFR en fractionele uitscheiding van Na en K. - Wacht 10 min, en herhaal de collectie van een tweede pre-drug urine en bloed monster.
- Na het verzamelen van twee pre-drug monsters, beheren een diureticum drug furosemide (10 mg / kg) via de arteriële catheter. Spoel de arteriële katheter met gehepariniseerde zoutoplossing om de catheter geneesmiddel te verwijderen. Zorg ervoor dat de injectie van lucht te voorkomen door de arteriële catheter. Noteer het tijdstip van de injectie furosemide.
- Post-drug monsters: Voor elk van de 3 tijdstippen hieronder verzamelt een urine monster gedurende een 10 min verzamelperiode en een bloedmonster (0,5 ml) in het midden van de urine verzamelperiode.
- Voor Post-Drug Monster 1 - verzamel vijf minuten na furosemide.
- Voor Post-Drug Sample 2 - verzamelen tien minuten na furosemide.
- Voor Post-Drug Monster 3 - verzamelen vijftien minuten na furosemide.
- Nadat alle monsters zijn verzameld, euthanaseren de rat in overeenstemming met de institutionele procedures door thoracotomie en verwijdering van het hart. Verwijder beide nieren. Decapsulate (verwijder de omliggende membraan) en dep de nieren om overtollig bloed te verwijderen. Weeg de nieren.
4. Sample Analysis
- Meet alle urinemonster volumes gravimetrisch met een digitale weegschaal, en opnemen gewichten.
- Centrifuge volbloedmonsters met een table-top centrifuge (1800 xg) aan plasma te scheiden. Breng plasmamonsters kleine gemerkte flesjes.
- Analyseer Na en K concentraties in urine en plasma monsters met een natrium / kalium analyzer.
- Meting van FITC-inuline in plasma en urine
- Verdun pre-drugurine (van 1: 200-1: 400), en post-drug urine (01:10) met HEPES buffer (500 mM, pH 7,4).
- Voeg 40 ul van standaard of monster en 60 ul HEPES buffer in een 96 well plaat (één monster per putje) en laat meng gedurende 10 minuten onder afgedekt met aluminiumfolie.
- Genereer een standaard curve voor FITC-inuline concentraties van 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 pg / ml (figuur 1). Bepaal FITC-inuline fluorescentie in monsters en standaarden met behulp van een microplaat reader met exciteren en emissie golflengten van 485 en 538 nm respectievelijk.
- Breng de fluorescentie waarden voor de normen van een 4-paramter logistische functie regressieanalyse. Met regressie parameters worden gebruikt om FITC-inuline concentratie berekenen in plasma en urine monsters (Tabel 1).
5. Post-lab Analyse van de resultaten: Berekeningen
- Bereken Urine Flow Rate (UV; ml / min): [urinevolume opgevangen (ml)] ÷ [na afname (min)]
- Bereken glomerulaire filtratiesnelheid (GFR; ml / min): [Urine inuline concentratie (ug / ml) x UV (ml / min)] ÷ [Plasma inuline conc. (Ug / ml)]
- Bereken Gefilterd natriumbelasting (pmol / min): Plasma-natrium (pmol / ml) x GFR (ml / min)
- Bereken natriumuitscheiding Rate (U Na V; umol / min): Urine natriumconcentratie (umol / ml) x UV (ml / min)
- Bereken fractionele uitscheiding van natrium (FE Na;%): [U Na V (umol / min)] ÷ [Gefilterd Natrium Load (umol / min)] x 100
- Bereken Gefilterd Kalium Load (pmol / min): Plasma kaliumconcentratie (pmol / ml) x GFR (ml / min)
- Bereken kaliumexcretie Rate (U K V; umol / min): Urine kalium concentratie (umol / ml) x UV (ml / min)
- Bereken fractionele uitscheiding van kalium (K FE;%): [U K V (umol / min)] ÷ [Gefilterd Kalium Load (umol / min)] x 100
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het diuretische in het lab demonstratie furosemide die zeer snel remt de reabsorptie van Na en K gefilterd door de nieren resulteert in verhoogde Na, K en water uitscheiding binnen minuten na geneesmiddeltoediening. Met zijn belangrijkste mechanisme dient furosemide minimale effecten op GFR en de gefilterde belasting van Na en K, maar zal urinestroom en fractionele uitscheiding van Na en K. vergroten
De representatieve resultaten in Tabel 3 laten zien dat in een verdoofde ra...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een geschikte marker voor de GFR meting moet voldoen aan vier criteria: vrij worden gefilterd bij het glomerulus, zijn niet gebonden aan plasma-eiwitten, en niet worden geabsorbeerd of uitgescheiden in het nefron. Inuline is een fructose polymeer dat voldoet aan deze criteria. Hierdoor wordt de klaring van inuline beschouwd als de gouden standaard voor het meten van GFR 7. De aangetoonde techniek vertegenwoordigt de traditionele benadering van het bepalen van de renale klaring van inuline met getimede urine c...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen. De adviezen of beweringen hierin zijn de privé-mening van de auteur en zijn niet te worden opgevat als ambtenaar of als gevolg van de standpunten van de afdeling van het Leger of het ministerie van Defensie.
Dankbetuigingen
De financieringsbron voor het lab demonstratie was NIGMS subsidie: GM077119. Wij danken Dr. Joseph R. Haywood en Dr. Peter Cobbett voor hun steun van de Short Couse in Integrative en Organ Systems Farmacologie. We danken ook mevrouw Hannah Garver voor haar technische ondersteuning van het laboratorium demonstratie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5-0 Braided Silk Surgical Suture | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| Assay Plate, 96-Well | Costar | 3922 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Chemical Co | A2934-25G | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | MicroFuge 18, 357160 | |
| Conical Sample Tubes | Dot Scientific Inc. | #711-FTG | |
| Cotton Tipped Applicators | Solon Manufacturing Co | 56200 | |
| Data Acquisition Software | ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | |
| Digital Scale | Denver Instrument | APX-4001 | |
| FITC-Inulin | Sigma Chemical Co | F3272-1G | |
| Gauze Sponges | Covidien | 2146 | |
| Heated Surgical Bed | EZ-Anesthesia | EZ-212 | |
| Heparin | Sagnet | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | Sigma Chemical Co | H3375 | |
| Isoflurane | Abbott Animal Health | IsoFlo, 5260-04-05 | |
| Isoflurane Vaporizer | EZ-Anesthesia | EZ-190F | |
| Micro Dissecting Forceps | Biomedical Research Instruments Inc. | 70-1020 | |
| Microplate Reader - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer | NOVA BioMedical | 14156 | |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PE-190 (for bladder catheter) | BD Medical | 427435 | |
| Pressure Transducer | ADInstruments | MLT1199 | |
| Pyrex Culture Tubes | Corning Inc. | 99445-12 | |
| Rat Femoral Tapered Artery Catheter | Strategic Applications Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemide 5% | Intervet | #34-478 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Student Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Surgical Gloves | Kimberly-Clark | Sterling Nitrile Gloves | |
| Syringe pump | Razel Scientific | R99-E | |
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 91121-12 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann Co | 105-420 | |
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar 3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc. #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann Co 105-420 |
Referenties
- Silverthorn, D. U. Human Physiology: An integrated approach. , Pearson. (2012).
- Hall, J. E. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 303-344 (2011).
- Levey, A. S. Measurement of renal function in chronic renal disease. Kidney International. 38 (1), 167-184 (1990).
- Thurau, K., Valtin, H., Schnermann, J. Kidney. Annual Review of Physiology. 30, 441-524 (1968).
- Shannon, J. A., Smith, H. W. The excretion of inulin, xylose, and urea by normal and phoriziniaed man. Journal of Clinical Investigation. 14, 393-401 (1935).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Sterner, G., et al. Determining 'true' glomerular filtration rate in healthy adults using infusion of inulin and comparing it with values obtained using other clearance techniques or predictive equations. Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 42, 278-285 (2008).
- Toto, R. D. Conventional measurement of renal function utilizing serum creatinine, creatinine clearance, inulin and para-aminohippuric acid clearance. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 4 (6), 505-509 (1995).
- Matavelli, L. C., Kadowitz, P. J., Navar, L. G., Majid, D. S. Renal hemodynamic and excretory responses to intra-arterial infusion of peroxynitrite in anesthetized rats. Americam Journal of Physiology. 296, F170-F176 (2009).
- Davidson, W. D., Sackner, M. A. Simplification of the anthrone method for the determination of inulin in clearance studies. Journal of Laboratory, & Clinical Medicine. 62, 351-356 (1963).
- Symes, A. L., Gault, M. H. Assay of inulin in tissues using anthrone. Clinical Biochemistry. 8 (1), 67-70 (1975).
- Shalmi, M., Lunau, H. E., Petersen, J. S., Bak, M., Christensen, S. Suitability of tritiated inulin for determination of glomerular filtration rate. Americam Journal of Physiology. 260 (2 Pt 2), F283-F289 (1991).
- Denton, K. M., Anderson, W. P. Glomerular untrafiltration in rabbits with superficial glomeruli. EUropean Journal of Physiology. 419 (3-4), 235-242 (1991).
- Jobin, J., Bonjour, J. -P. Measurement of glomerular filtration rate in conscious unrestrained rats with inulin infused by implanted osmotic pumps. Americam Journal of Physiology. 248 (5 Pt 2), F734-F738 (1985).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Americam Journal of Physiology. 276 (1 Pt 2), F172-F177 (1999).
- Qi, Z., et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Americam Journal of Physiology. 286 (3), F590-F596 (2004).
- Bivona, B. J., Park, S., Harrison-Bernard, L. M. Glomerular filtration rate determinations in conscious type II diabetic mice. Americam Journal of Physiology. 300 (3), F618-F625 (2011).
- Rosen, S. M. Effects of anaesthesia and surgery on renal hemodynamics. British Journal of Anesthesiology. 44, 252-258 (1972).
- Cousins, M. J. Anesthesia and the kidney. Anaesthesia and intensive care. 11 (4), 292-320 (1983).
- Walter, S. J., Zewde, T., Shirley, D. G. The effect of anaesthesia and standard clearance procedures on renal function in the rat. Quarterly Journal of Experimental Physiology. 74, 805-812 (1989).
- Rieg, T. A. A high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice. Journal of Visualized Experiments. (75), (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
