Directe visualisatie van het Muizen Dorsale Cochlear Nucleus voor optogenetische Stimulatie van de Auditieve Pathway

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om een chirurgische benadering te schetsen om directe toegang te bieden tot de dorsale cochleare nucleus in een muismodel.

Samenvatting

Onderzoek naar het gebruik van virus-gemedieerde genoverdracht te arresteren of achteruit gehoorverlies is grotendeels verbannen naar de perifere auditieve systeem. Enkele studies hebben genoverdracht naar het centrale auditieve systeem onderzocht. De dorsale cochleaire nucleus (DCN) van de hersenstam, die tweede orde neuronen van het auditieve pad bevat, is een potentiële site voor genoverdracht. In dit protocol is een techniek voor het direct en maximale blootstelling van de muizen DCN via een fossa posterior aanpak is. Deze aanpak maakt het voor zowel acute of overleving chirurgie. Na directe visualisatie van het DCN, een reeks experimenten mogelijk, zoals injectie van opsins in de cochleaire kern en daaropvolgende stimulatie door een optische vezel gekoppeld met een blauw laserlicht. Andere neurofysiologie experimenten, zoals elektrische stimulatie en neurale injector traces zijn ook mogelijk. Het niveau van visualizatie en de duur van de stimulatie stand te brengen is deze benadering voor diverse experimenten.

Inleiding

Virus-gemedieerde genoverdracht om gehoorverlies te keren, is grotendeels gericht op het perifere gehoorsysteem.¹ Met als doelwit de cochlea, hebben onderzoekers een reeks toedieningsroutes onderzocht, waaronder osmotische minipomp-infusie², vector-transgeencomplex-gedrenkte Gelfoam®² of gelatinespons³, directe micro-injectie⁴; talrijke genoverdrachtsvectoren, waaronder adeno-geassocieerde virale vectoren^5,6, lentivirale vectoren⁷ en cationische liposomen²; en de verspreiding van genoverdrachtsvectoren buiten het doelweefsel². Meest recent is adeno-geassocieerd virus (AAV)-1 geïntroduceerd in de cochlea om doofheid bij muizen te behandelen als gevolg van verlies van vesticulair glutamaattransporter-3.⁸ Verder is de toepassing van optogenetica in het perifere gehoorsysteem recent beschreven.⁹

Er zijn echter maar weinig studies die genoverdracht naar het centrale gehoorsysteem hebben onderzocht. De dorsale cochleaire kern (DCN) van de hersenstam bevat tweede orde neuronen van de gehoorbaan. Hoewel genoverdrachtstechnieken in de cochleaire kern (CN) kunnen worden gebruikt voor een groot aantal onderzoeken, kan genoverdracht van opsines, lichtgevoelige eiwitten, naar de DCN ook worden gebruikt om optogenetica-gebaseerde experimentele technieken mogelijk te maken. Na virus-gemedieerde genoverdracht van een opsine, zoals channelrhodopsine-2 (ChR2), worden de neuronen van de DCN gevoelig voor lichtstimuli. Optogenetische genoverdracht is eerder geprobeerd in verschillende hersenstamgebieden, waaronder de retrotrapezoïde kern van de rat, de locus coeruleus van de muis, de superieure colliculus van de aap en het ventrale tegmentale gebied van de muis.^10-14

Onlangs hebben onderzoekers het gebruik van optogenetica in de DCN onderzocht.^15,16 De DCN is de locatie voor het plaatsen van auditieve hersenstamimplantaten bij mensen, waardoor het een aantrekkelijk deel van het gehoorsysteem is om te bestuderen voor translationele studies over auditieve neuroprothesen. Gezien de locatie van de DCN is chirurgische expositie echter een uitdaging. De hier beschreven techniek biedt een protocol voor maximale blootstelling van de DCN via de posterior fossa-aanpak om virale vectorgenoverdracht en optogenetische experimenten mogelijk te maken in een muismodel. Eerdere studies gebruikten stereotactische micro-injectie in de DCN met channelrhodopsine-2.¹⁶ Stereotactische injecties zijn echter mogelijk minder nauwkeurig dan injecties gemaakt door directe visualisatie, vooral in een kern die zo klein en diep langs de hersenstam is als de DCN. Transgene muizen die weefselspecifieke eiwitten in de CN tot expressie brengen, zijn ook een aantrekkelijke optie en zouden de noodzaak van genoverdracht overbodig maken. Ons protocol voor blootstelling van de DCN zou ook werken bij transgene muizen, aangezien de DCN rechtstreeks blootgesteld zou moeten worden voor optische stimulatie. Deze techniek voor chirurgische blootstelling van de DCN is aangepast van eerdere protocollen die betrekking hebben op opnames van de auditieve zenuw en de cochleaire kern bij muis- en ratmodellen.^15,17-20

Het algemene doel van het protocol is om directe blootstelling aan de CN mogelijk te maken voor genoverdrachtstechnieken. Meer specifiek is de aanpak compatibel met zowel acute als overlevingschirurgie en de voorbereiding kan worden herhaald bij hetzelfde dier voor verdere neurofysiologische tests. De directe blootstelling van het DCN-protocol heeft implicaties voor optogenetische- en virus-gemedieerde genoverdracht-gebaseerde experimenten in andere kernen van de hersenstam.

Protocol

OPMERKING: Alle experimentele procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Care en gebruik Comite van het Massachusetts Eye en Ear Infirmary en de Harvard Medical School, die de nationale richtlijnen verzorging van dieren te volgen, waaronder GGD Beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren, de ILAR Guide, en de Animal Welfare Act. Opgesomd experimentele procedures hieronder detail blootstelling van de linker DCN. Gebruik steriele instrumenten tijdens het uitvoeren van de overleving chirurgie.

1. Primaire Craniotomie en Dorsale Cochlear Nucleus Exposure

1. Anesthesie
   1. Verdoven een muis, 8-12 weken, gewicht 18-24 g jaar, met xylazine 20 mg / kg ketamine en 100 mg / kg via de intraperitoneale toediening. Bevestig de juiste verdoving door bewaking hartslag, ademhaling, evenals teen knijpen terugtrekking reflex. Plaats dierenarts zalf op ogen droog terwijl onder narcose voorkomen. Zodra voldoende onder narcose, scheren haar bovenliggende tHij hoofdhuid onbelemmerde toegang tot de chirurgische site.
2. Chirurgische positionering
   1. Plaats de muis stevig in een klein dier stereotaxisch houder, op zijn plaats gehouden door een snuit klem.
   2. Zorg ervoor dat de snuit klem is los genoeg zodat er passende ademhaling, maar strak genoeg om volledig te immobiliseren het hoofd van de muis. Als de muis hoofd los is, het dier is waarschijnlijk uit de kop houder te vallen tijdens de craniotomie deel van de procedure.
   3. Plaats auditieve hersenstam implantaat elektroden in standaard mode, die het mogelijk maakt voor hartslagmeting. Rate luchtwegen moet worden gecontroleerd door visualisatie. Merk op dat de normale hartslag en ademhaling zal variëren afhankelijk van de leeftijd van de muis.
   4. Een thermometer wordt via plaatsing geplaatst en euthermia is verzekerd op een homeothermic verwarming deken.
3. Huidincisie en de blootstelling van de interparietal en occipitale beenderen van de schedel
   1. Onder een Microscope, maak een verticale incisie door de huid vanaf de middellijn, rechtstreeks tussen de oorschelp, en zich uitstrekt tot het caudale gedeelte van de achterhoofdsknobbel. Volgende middellijn incisie in de huid, verdringen de huid lateraal. Visualiseer de spieren die het liet de achterste deel van de schedel.
   2. Verwijder spier bovenop de linker pariëtale, interparietal en occipitale beenderen van de schedel door exarticulatie van spieraanhechtingen hun respectieve botten met een scalpel of iris schaar. Observeer een kleine mate van bloeding langs cut spier randen. Minimaliseer deze door lichte druk met een wattenstaafje voor 10-15 sec.
4. Craniotomie bovenliggende Cochlear Nucleus
   1. Identificeer relevante hechtdraad lijnen, met inbegrip van sagittale en lambda hechtingen lijnen (figuur 1, linker paneel).
   2. Met behulp van rongeurs, maak een craniotomie over de interparietal bot, links van de middellijn, ~ 2 mm caudaal van de lambda hechting. Deze regio ligt over de DCN.
   3. Following craniotomie, observeren een dun laagje dura dat de kleine hersenen bedekt. Met behulp van een scalpel, verwijder de dura. (Figuur 1, Midden-Panel).
      LET OP: Het verwijderen van dura kan een kleine mate van bloeden veroorzaken. Dit proces van het gebruik van de scalpel de dura verwijderen beoogt de hoeveelheid bloedverlies te verminderen tijdens het cerebellum aspiratie, die pool op de hersenstam oppervlak obscure identificatie van het DCN. De totale bloedvolume van muis ~ 1,5 ml niet overschrijden> dan 15%. Als bloeden dit bedrag overschrijdt, moet de muis worden voorzien met vocht suppletie.
   4. Verwijder gestold bloed bedekken het cerebellum met de katoenen tip applicator. Optioneel zachtjes druppelen zoutoplossing met behulp van een tandheelkundige punt op de kleine hersenen om bloed bloed te ruimen.
5. Cerebellaire Aspiration
   1. Met een 5 French zuiging, zuig het meest laterale deel van de linker cerebellum bovenop de DCN totdat het DCN is visUAL (figuur 1, rechter paneel). Verwijder ongeveer 1/4 tot 1/3 van de linker cerebellum. Het belangrijkste monument naast de DCN is de ampulla van de superieure halfronde gracht.
      OPMERKING: Aspiratie van het cerebellum is de belangrijkste stap van het protocol. Gericht aspiratie van het cerebellum is het meest succesvol uitgevoerd als het zich voordoet in één poging en niet met meerdere passages van de zuiging, omdat dit zal leiden tot bloeden. Om te helpen bij aspiratie, stelt het brandvlak van de microscoop op de verwachte diepte van de GN, die enigszins distaal van het oppervlak van het cerebellum is. De focal plane instellen op de GN zal visualisatie te verbeteren en te zorgen voor een scherp beeld.
   2. Als gevolg van aspiratie, verder bloeden, cerebrospinale vloeistof (CSF) te bouwen-up, en het cerebellum verdringing op de DCN worden verwacht. Inboezemen 0,5 cc steriele zoutoplossing snel in de craniotomie om bloedstolling te voorkomen. Een combinatie van zacht deppen met een tandheelkundige punt en zuigkracht kan dangebruikt te ruimen een pad voor directe visualisatie van het DCN. Niet direct contact op met de oppervlakte van de DCN.

2. Druk Micro-injectie voor-Virus gemedieerde Gene Transfer en Chirurgische Recovery

1. Na de DCN is vrij van bovenliggende bloed en CSF en is duidelijk zichtbaar, maken druk micro-injecties in de DCN met behulp van een 10 ul Hamilton spuit over een 2 min periode.
2. Breng de naald met een micromanipulator totdat de tip niet meer zichtbaar onder het oppervlak van het DCN.
3. Voor optimale prestaties gebruikt een 33 of 34 gauge naald (gebruik een gasdichte injectiespuit met 34 gauge naald) met ondiepe afschuining, zoals 45 °, stompe trauma te minimaliseren en het injectievolume binnen het DCN, dat een dun lokaliseren en ondiepe hersenstam structuur (<300 micrometer dik).
   OPMERKING: Andere micro-injectie instrumenten kunnen worden gebruikt gebaseerd. Idealiter zou de injectie instrument flexibel waardoor enige lichte bend, indien nodig direct richten op de DCN. Verder, zoals de muis zich verplaatst gedurende de procedure door ademhaling, het instrument moet robuust genoeg zijn om kleine hoeveelheden beweging weerstaan.

3. Chirurgische Recovery

1. Onmiddellijk na de injectie, opnieuw benaderen van de huid en laat de muis om te herstellen per standaard invorderingsprocedure. Resterende cerebellum en littekenweefsel zal in de holte, veroorzaakt door aspiratie van het cerebellum te vullen. Voortdurend te controleren dieren totdat voldoende bewustzijn is hersteld om borstligging behouden. Monitor hartslag, ademhaling, alsmede het vermogen om te voeden.
   OPMERKING: Geen enkel dier dat een operatie heeft ondergaan is teruggekeerd naar een kooi met andere dieren tot ze volledig hersteld.
2. Als een muis begint te lopen in cirkels na operatie (<5% van de gevallen), meestal 2-4 uur na sluiting van de incisie in de huid, onmiddellijk te offeren de muis, omdat het waarschijnlijk zou hebben een moeilijke tijd het voeden. Tzijn zijde effect is waarschijnlijk te wijten aan aspiratie van het cerebellum. Het dier moeten worden gecontroleerd op de pijn na de operatie, en passende verdovende middelen moet worden besteed aan het comfort van dieren te verzekeren op basis van de institutionele normen. Antibiotica kan nodig zijn, als bewijs van de infectie.

4. Secundaire Craniotomie en Cochlear Nucleus Exposure

1. Na 2-4 weken van genezing en virus-gemedieerde genoverdracht incubatie opnieuw verdoven een eerder geïnjecteerde muis en herhaal stap 1,1-1,5 Optimale incubatietijd varieert met het type van gen overgedragen.
2. Verwijder littekenweefsel over de craniotomie plaats door een combinatie van een pincet, scalpel, en rongeurs.
3. Na het visualiseren van de craniotomie, identificeren van een combinatie van de resterende cerebellum en littekenweefsel bovenop de DCN. Gebruik een 5 Franse afzuigen bovenliggende cerebellum / littekenweefsel (vergelijkbaar met de vorige cerebellaire aspiratie) te zuigen.
4. Als gevolg van aspiratie, verwachten een verdere bloeden, CSF build-up, en de overige bits van het cerebellum. Snel introduceren zoutoplossing in de craniotomie om bloedstolling te voorkomen. Gebruik een combinatie van zachte tandheelkundige punt deppen en zuigkracht om het pad voor de directe visualisatie van de DCN wissen.
5. Let op de oppervlakte van de DCN. Uitvoeren-optogenetics basis fysiologie experimenten als DCN is nu toegankelijk. Introductie van een licht stimulus, bijvoorbeeld een optische vezel (Figuur 2), om een optogenetics experiment brengt drijven.

5. Histologie

1. Na afloop van experimenten euthanaseren de muis met een overdosis ketamine. Perfuse de muis met een fysiologische zoutoplossing, gevolgd door 4% paraformaldehyde.
2. Pak de hersenstam van de schedel en de post-fix voor 2 uur. Cryoprotect de hersenstam in 30% sucrose gedurende 24-48 uur. Deel van de hersenstam met een standaard cryostaat met behulp van 60 micrometer secties.

Resultaten

Gedeeltelijke Cerebellar Aspiration toegang verschaft tot de Cochlear Nucleus

Nadat de huid en spieren die over de schedel verwijderd, schedeloppervlak monumenten, zoals de coronale en Lamda hechtdraad lijnen tonen de benaderde lokalisatie van de craniotomie. Na craniotomie met rongeurs, wordt het cerebellum gevisualiseerd. Zorgvuldig aspireren van het kleine deel van het cerebellum toont visualisatie van de GN, die vervolgens kan worden geïnjecteerd (Figuur 1).

Discussie

Dit artikel beschrijft de techniek van directe visualisatie van het DCN in het muismodel manipulatie van het centrale auditieve systeem. De geschetste aanpak van directe visualisatie biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de belangrijkste alternatief, dat stereotaxisch benaderingen zijn. In de eerste plaats, directe visualisatie van de DCN zorgt voor directe bevestiging van de site van de hersenstam, terwijl stereotaxisch benaderingen niet veroorloven directe visualisatie. In experimenten die incubatietijd noodza...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Stereotaxic holder	Stoelting	51500
Homeothermic blanket	Harvard	507214
Scalpel blade #11	Fine Surgical Tools	10011-00
Iris scissor	Fine Surgical Tools	14084-08
5 French suction	Symmetry Surgical	2777914
Dental Points	Henry Schein	100-8170
Bone rongeur	Fine Surgical Tools	16020-14
10 µl Hamilton syringe	Hamilton	7633-01
34 gauge, needle	Hamilton	207434
Rongeurs	Fine Surgical Tools	16021-14