Muizen geïsoleerde hart Model van myocard Stunning Associated met Cardioplegisch Arrestatie

Samenvatting

Het doel van dit protocol om myocardiale stunning te beoordelen na ischemische cardioplegie-arrestatie bij knaagdieren.

Samenvatting

Het volgende protocol is gebruikt om een ​​verminderde hartfunctie of myocard prachtige volgende matig ischemische beledigingen evalueren. De techniek is nuttig voor het modelleren van ischemisch letsel in verband met een groot aantal klinisch relevante fenomeen zoals hartchirurgie met cardioplegische arrestatie en cardiopulmonale bypass, off-pump CABG, transplantatie, angina, korte ischemie, enz. Het protocol stelt een algemene methode met model hypothermie hyperkalemic cardioplegische arrestatie en reperfusie in knaagdieren harten gericht op metingen van myocardiale contractiliteit. In het kort wordt een muis hart doorbloed in Langendorff-modus, geïnstrumenteerd met een intraventriculaire ballon, en de baseline cardiale functionele parameters worden geregistreerd. Na stabilisatie, het hart is dan onderworpen aan infusie van een cardioprotective onderkoeld cardioplegia oplossing kort te diastolische arrestatie starten. Cardioplegie wordt met tussenpozen meer dan 2 uur geleverd. Het hart wordt vervolgens reperfusie en warmed om normotherme temperaturen en het herstel van myocardiale functie wordt gecontroleerd. Gebruik van dit protocol resulteert in betrouwbare depressief cardiale contractiele functie vrij van grove myocard weefselschade bij knaagdieren.

Inleiding

Myocardiale verdoving gedefinieerd als omkeerbare contractiele activiteit ondanks herstel van adequate bloedstroming na een korte periode van ischémie en langere perioden van ischemie beledigingen met cardioprotectie ^1,2,3,4,5. De gepresenteerde methode wordt specifiek gebruikt voor het modelleren klinisch relevante ischemische beledigingen die kan leiden tot omkeerbare stoornissen in contractiele functie (bijv ischemische beledigingen verbonden aan hartchirurgische cardioplegie gebruik arrestatie korte perioden van ischemie, angina, etc.). In tegenstelling tot ernstige ischemie studies (myocardinfarct, necrose) werd dit protocol ontwikkeld om myocard functioneel herstel en cardioprotectie zonder weefselbeschadiging, verbouwing en celdood te evalueren. De meeste artikel bespreekt een standaard cardioplegisch aanhouding protocol met elementen gelijkend op een hartoperatie behulp onderkoeling en intermitterende cardioplegie levering.

Myocard proteel tijdens het grootste deel van hartoperaties voert cardioplegie en cardiopulmonale bypass. Hoewel cardioplegia (CP) oplossingen en strategieën lopen sterk uiteen (bloed, kristalachtige, koud, warm etc.) de meest voorkomende elementen zijn 1) hyperkaliëmie en / of andere strategieën om het hart stil in diastole, waardoor energiebenutting gevolg van myocardiale contractie beperken en 2) onderkoeling te vertragen stofwisseling en helpen handhaven ATP en andere energie-reserves, terwijl gearresteerd. Huidige cardioplegie oplossingen bieden bescherming aan het hart tegen ischemische beledigingen die anders dodelijk zou blijken. Echter, cardioprotectieve strategieën tijdens chirurgische ischemische beledigingen niet perfect, en het resulterende milde ischemische letsels leiden reversibele cardiale contractiele dysfunctie ondanks adequate bloedstroming (myocard verdoven), acidose, cardiomyocyt schade en vasculaire effecten waaronder verminderde coronaire perfusie en vasospasme.

Dit protocol verschiltvan standaard geïsoleerde hart ischemiemodellen evalueren myocardiaal infarct en ernstige ischemie doordat evalueert mildere ischemische beledigingen wat kan leiden tot verminderde hartfunctie volgende korte ischémie of ischemische beledigingen geassocieerd met cardioplegie arrest. (Voor een overzicht op Langendorff perfusie technieken en I / R studies zie ^6-8). Voor algemene richtlijnen en een grondige analyse van de experimentele parameters in verband met de muis geïsoleerd geperfuseerde harten zie Sutherland e t al. 2003 ⁹ De hier gepresenteerde techniek worden de benodigde apparatuur, reagentia, stappen, strategieën en tips om betrouwbaar te induceren schitterend in de muis harten. Kleine aanpassingen zijn nodig om de techniek te gebruiken om ratten.

Kort geïsoleerd muisharten zijn Langendorff perfusie gedurende ongeveer 30 minuten onder fysiologische Krebs-Henseleit buffer (KHB), gevolgd door koude beschermde hartstilstand via afgifte van een hyperkalemic hypothermic cardioplegie oplossing. Na de arrestatie, is cardiale functioneel herstel gecontroleerd tijdens opwarmen en reperfusie van het hart met KHB. Wijzigingen in de mate van herstel van cardiale contractiliteit kan worden geëvalueerd om cardioprotectieve cardioprotectie en verschillende strategieën te beoordelen.

Protocol

LET OP: Alle procedures werden goedgekeurd door de Levensduur Institutional Animal Care en gebruik Comite en alle dieren en procedures volgens de National Research Council Gids voor Zorg en gebruik van proefdieren ^10.

1. Balloon Fabrication en Linksventriculaire Pressure Monitoring Circuit

1. Construct LV ballonnen volgens Miller et al. ¹¹ in een bekerglas met een roerstaafje, mix 9,5 ml gedestilleerd water, 14,2 ml lichte glucosestroop en 33,8 g sucrose, en warmte op een hete plaat, meng tot de suiker is opgelost . Doorgaan verwarming oplossing totdat het ongeveer 150 ºC bereikt.
   OPMERKING: Tal van methoden bestaan ​​om LV ballonnen met inbegrip van wijziging van condoom tips en vershoudfolie bouw ^9,12 construeren. We vinden de bovenstaande methode om relatief eenvoudig lekvrij ballonnen te construeren zijn, maar een voordeel van vershoudfolie ballonnen bevat eerdere karakterisering passende frequency-respons relaties ^9.
2. Breek droge spaghetti strengen in stukjes van ongeveer 5 cm lang en dip één zijde van elk stuk ongeveer 1 cm diep in de suikeroplossing en langzaam verwijderd.
3. Plaats het droge einde van de pasta streng in een piepschuim blok en op te schorten, zodat de suiker mix druipt en vormt een druppelvorm mal. Laat O / N in een exsiccator, zodat de mal verhardt.
4. De volgende dag, dompel de mallen in siliconendispersie gel. Plaats pasta strengen terug in piepschuim blok en plaats in aa 37 ºC oven gedurende 2 uur of tot het droog is. Herhaal deze stap opnieuw zodat beide lagen van silicone worden toegepast.
5. Na droging plaats in water gedurende een aantal uren te helpen bij het verwijderen van de ballon uit de matrijs. WINKEL ballonnen in 0,02% natrium- azide oplossing.
6. Gebruik een 23 G bloedafname ingesteld op een aangepaste ballon canule te produceren door het snijden van een naald om een ​​stompe punt maken en plaatsen van inkepingen in de naald.
7. Sluit de slang aan op een druk transproducent en spoelen met water terwijl het houden van slangen en canule volledig ondergedompeld te voorkomen dat er lucht in het systeem. Plaats een ballon die is gevuld met water op de canule en gebruik 2-0 zijden hechtingen te binden op canule. Test ballon door het vermogen om druk te handhaven (-100 mmHg gedurende ten minste 1 uur)

2. Voorbereiding van de geïsoleerde hart perfusiesysteem

1. Aanvankelijk was en verwarm het systeem. Zet een 37 ºC warm waterbad circulatiepomp die is aangesloten op de Langendorff apparaat, en vul bufferreservoir met gedestilleerd water. Sluit een nieuwe glasvezel filter buis stroomt in apparaten en zet de pomp voor het spoelen van het systeem. Gedurende prep tijd bewaken van de temperatuur van water uitgedreven uit het Langendorff blok met een temperatuursensor, zodat waterbad nauwkeurig ingesteld. Ook, zet een gekoelde circulatiepomp en ingesteld op 20 ºC, dat zal worden gebruikt tijdens cardioplegische arrestatie van het hart.
2. Ikn de tussentijd de voorbereiding van de volgende oplossingen. Bereid 1 liter cardioplegia-oplossing (110 mM NaCl, 16 mM KCI, 16 mM _MgCl2, 1,5 mM _CaCl2, 10 mM NaHCO ₃₎ en filtreer. Ook bereiden 2 L van KHB (118 mM NaCl, 4,8 mM KCI, 1,2 mM KH _{2PO 4,} 1,7 mM MgSO _4, 2 mM Na-pyruvaat, 6 mM dextrose, 24,9 mM NaHCO ₃ (pre-belucht met CO ₂₎ , 1,4 mM CaCl ₂ (laatste toegevoegd). Na oplossen verwijderen precipitaten opgevangen door filtreren in een kolf met een 5 micrometer gefrit glas trechter. Doe wat in een kleine schaal op ijs worden gebruikt tijdens de operatie en isolatie.
3. Oxygenaat het perfusaat (KHB) met 95% _O2 / 5% _CO2 gedurende ten minste 30 min voorafgaand aan gebruik. Perfuseren Langendorff systeem KHB om alle resterende water uit het systeem te verwijderen en buffer reservoir. Voor muizen, stellen de beginsnelheid pomp ~ 2,0 ml / min. Plaats 2-0 en 4-0 zijde hechtingen buurt perfusie canule. Laat de pomp totdat de slangen en apparaten zijn gevuld with perfusaat en zorgen voor de bubble strup is gevuld met perfusaat.
   OPMERKING: Voor lange periodes van perfusie en stabiele functie is het sterk aanbevolen om een ​​in-line glasvezel filter (~ 1 micrometer) in de perfusiecircuit installeren om elke neerslag die stolsels in het hart kunnen vormen verzamelen

3. Mouse Surgery

3.1) Muis Anesthesie en Handling

1. Bereid spuit met anesthetische dosis van 80 mg / kg ketamine en 5 mg / ml xylazine mengsel en voeg steriele 0,9% zoutoplossing volume op 0,2 ml te brengen. Injecteer Heparine IP (50 pl 1000 U / ml oplossing).
2. Plaats de muis terug in transportcontainer (~ 10-20 min) en wacht tot hij het bewustzijn verliezen als heparine ingaat. Periodiek doe een teen knijpen om pijn reflex controleren.

3.2) Verwijder de Heart

1. Zodra de muis is volledig bewusteloos en reageert niet op teen knijpen, zet hem vast aan een geschikte operatietafel met pinnen of 25 G spuit tips door de ledematen. Voer een thoracotomie om het hart bloot te leggen. Snij een gaatje net onder het borstbeen en strekken de snede aan de zijkanten van de muis het vermijden van de membraan.
2. Snel snijden het membraan en vervolgens snel gesneden zijden van de ribbenkast. Flip de rug van de ribbenkast als een clam shell om de borstholte bloot te leggen. Neem voorzichtig vast van het hart, plaatsen scharen onder en verwijder het hart.
   OPMERKING: Het is essentieel om snel het hart verwijderen zodra het wordt blootgesteld in de borstholte en de longen zijn niet-functioneel.

3.3) Maak het Hart

1. Plaats het hart in het schaaltje met ijskoude KHB en trim off elke grote stukken longweefsel bevestigd. Gebruik een tang op te halen het hart en zoek de aorta. Knijp het hart en het zoeken naar eventuele bloed dat verschijnt, zoals dit het open einde van de aorta moet zijn. Gebruik fijne tip pincet om het hart te houden door het open uiteinde van de aorta.

e "> 4. Montage van de Hart, starten perfusie en plaatsen van de Ballon

4.1) Montage en cannuleren the Heart

1. Voor het transport van het hart naar de Langendorff apparaat, zet de pomp ervoor zorgen dat de perfusiedruk is laag (~ 20 mmHg). Houd het hart van de aorta net onder de canule. Met behulp van een andere set van fijne tip pincet, open de aorta en schuif hart omhoog op de canule. Zijn plaats te houden met een set van een pincet en gebruik dan een zachte randen clip tijdelijk vast aan de canule.
   OPMERKING: snel monteren het hart naar de perfusie canule is essentieel voor een goede voorbereiding. Met ervaring, moeten de procedures van het openen van de borstholte tot de montage van het hart tussen de 1 en 2 minuten duren.
2. Bind en initiëren perfusie als volgt, met behulp van 4-0 zijden hechtdraad veilige aorta naar de canule direct onder de clip. Zorg ervoor dat de band is ook rond de metalen aorta canule, zodat de aorta niet wordt afgebonden bij het aandraaiende knoop. Zodra een band stevig is geplaatst, verwijdert u de clip.
3. Gebruik extra zijde hechtingen aan de aorta stevig vast aan de canule en zorg ervoor om af te binden onder elk vaartuig takken die kunnen worden komende uit de aorta. Deze kunnen vaak worden gespot door perfusaat lekken of schieten uit de aorta.
   LET OP: Tijdens de eerste stadia van perfusie het bloed moet worden wassen van het hart en de hele hart zou een zacht roze kleur verschijnen. Donkere verkleuringen die niet uitspoelen geven ischemische gebieden waarschijnlijk te wijten aan de lucht embolie of stolsels en het hart mag niet worden gebruikt.

4.2) Vaststelling perfusie en LVP Measurement

1. Langzaam de perfusie druk en verhogen snelheid van de pomp totdat de perfusiedruk bereikt 70 mmHg.
   OPMERKING: Standard perfusiedruk voor muizen perfusie kan 70-90 mmHg, maar moeten binnen een experiment constant blijven van dier tot dier.
2. Reinig de resterende weefsel (longen, schildklier enz.), Die nog steeds naar het hart worden bevestigd. Knip met een schaar de linker atria afgesneden teneinde een opening in de linker ventrikel creëren.
3. Plaats de ballon op de houder en leeglopen. Plaats de ballon canule bij de aorta canule direct over de opening in de linkerventrikel. Steek ballon naar beneden in de linker ventrikel terwijl het hart op zijn plaats zodat de aorta niet scheurt.
4. Zodra het is op zijn plaats langzaam beginnen om de ballon op te blazen tot de LVEDP bereikt ~ 8 mmHg. Plaats de temperatuursensor tegen de bodem van het hart zodat meet de temperatuur van het effluent.

4.3) Measurement Basal

1. Seal het hart in een water mantel perfusie kamer. Gedurende deze tijd voortdurend perfuseren het hart met KHB, en ervoor zorgen dat de temperatuur blijft stijgen. Controleer de temperatuur en het waterbad dienovereenkomstig aan te passen totdat deze ongeveer 37 ~ * C bereikt.
   OPMERKING: Monitoring temperature in de eerste fasen van de perfusie is kritisch als coronaire stromen en vervolgens de temperatuur kan variëren van hart tot hart. De temperatuur van het effluent perfusaat wordt gecontroleerd gewenst myocardiale temperatuur via een temperatuursonde geplaatst bij de apex van het hart. Bovendien, in vergelijking met andere Langendorff perfusie protocollen, het hart niet ondergedompeld in CP of KHB tijdens perfusie aanhouden of wordt dit vooral gedaan om snel temperatuur aan te passen en een efficiënte CP levering zonder diffusie.
2. Begin continu opnemen functionele meting met een data-acquisitiesysteem verbonden met de geschikte sensoren, waaronder perfusiedruk, linker ventriculaire druk (druk transducer die aan LVP ballon), temperatuur en elektrofysiologische parameters (EKG, MAP indien aanwezig) (attachment wordt Volgens de fabrikanten en specifiek voor de individuele sensoren en gegevensverzamelsysteem). Zodra het effluent KHB bereikt ~ 37 * C gedurende ten minste 15 min en cardiale functionele parameters zijn stabiel, let op de tijd voor de nulmetingen.
   OPMERKING: criteria Inclusie / uitsluiting worden toegepast op elk hart. Een LVDP van <60 mmHg bij aanvang duidt op een hart dat uit de analyse moeten worden verwijderd. Daarnaast coronaire stroom> 4,5 ml / min, of het onvermogen om perfusie druk op baseline behouden waarschijnlijk duidt op een lekkende of gescheurde aorta. Ook alle harten die duidelijk ischemische gebieden die visueel kan worden bevestigd (dat wil zeggen, stolsel) of vertonen-ischemie geassocieerd vermindering van de hartfunctie (dat wil zeggen, het verhogen van LVEDP, extreem aritmische) moeten worden verwijderd uit de analyse.
3. Meet coronaire stroom via verzameling van de coronaire effluent in een maatcilinder 1 min. Sluit de kamer en laat de temperatuur en de functie om terug te keren naar de uitgangswaarden. Ook het meten van de coronaire stroom continu in de perfusie lijn via een stroom sonde geplaatst na het overdrukventiel circuit.

"> 5. Initiëren Cardioplegisch Arrestatie

1. Plaats 100 ml koude buffer cardioplegia in een ander reservoir. breng de KHB reservoir canule de cardioplegie reservoir.
2. Maak de watermantel behuizing en de perfusie opwarming circuit van het warme water bad en verbinding maken met de gekoelde circulatiepomp met behulp van slangen snelkoppelingen. Gebruik aparte verwarming en koeling circulatiepompen aan snelle temperatuursveranderingen van het hart en perfusaat mogelijk te maken.
3. Volg de luchtbel die wordt geïntroduceerd in de slang tijdens de switch, en als het eenmaal bereikt, in de buurt van het geïsoleerde hart start de timing voor cardioplegie. Lever cardioplegie voor 2 min. Na de initiële dosis stop de pomp. Ervoor te zorgen dat het hart te arresteren in diastole en dicht bij de gewenste temperatuur CP.
   OPMERKING: Een voldoende bubble val is nodig om lucht embolie in het hart te voorkomen. Ook een afgiftesysteem voor zowel reservoirs geschakeld door een kraan gemakkelijk worden geconstrueerd, maar vinden we volgening de kleine luchtbel die wordt geïntroduceerd bij het ​​omwisselen van de canule tussen reservoirs, een eenvoudige methode van timing CP levering gegeven potentieel verschillende pomp snelheden tussen experimenten (dat wil zeggen, als gevolg van de muis / rat, perfusie druk, filter weerstand, enz.)
4. Bewaar het hart in cardioplegia voor 2 uur bij ~ 20 ° C. Elk half uur tijdens CP zet de pomp weer aan gedurende 1 minuut, zodat andere dosis wordt toegediend.
   OPMERKING: intermitterende doses van CP elke 30 min resulteert in functieverlies van het hart, zonder necrose van het weefsel. Langere perioden tussen de doses van CP (dwz> 45 min) kunnen leiden tot necrose en ischemische contractuur en zou meer geschikt voor een model van necrotische letsels geassocieerd met onbeschermde ischemie.

6. Reperfusie

1. Eind CP Breng het reservoir canule naar het geoxygeneerde KHB. Sluit de temperatuurregeling circuits naar de verwarmings- circulatiepomp en draai de pompaan reperfusie te starten. Op dit punt de cardioplegie wast, observeren de temperatuurstijging en het hart weer begint na 2-4 min reperfusie kloppen. Wanneer het hart begint de hartslag is traag en vaak aritmische.
   Opmerking: Er is meestal geen grote stijging van de diastolische LVP (bijv ≤10 mmHg stijging) die vaak kenmerkend in pure ischemiemodellen. Ritmestoornissen goed kan aanhouden in de reperfusie en af ​​en toe het hart zal moeten worden gedefibrilleerd. Dit kan worden bereikt met het gebruik van een stimulator reeks om hogere spanningen (~ 10-50 V) en de elektroden geplaatst aan de basis en de apex van het hart.
2. Laat het hart reperfusie gedurende 30 min, en gedurende deze periode neemt coronaire stroom metingen nodig. Meet coronaire stroom door het verzamelen van het effluent met een maatcilinder gedurende 30-60 sec.

7. Het verzamelen van de Tissue

1. Leeglopen van de ballon en verwijder het van de linker hartkamer. Neem het hart van decanule en wegen. In eerste experimenten, ten minste één transversaal segment van het hart genomen en TTC gekleurd necrose evalueren om te waarborgen dat het hart is vrij van necrotische letsels.
2. Verzamel hart plakjes voor microscopie studies, nat / droog gewicht, enz. De rest of hele hart moet snel worden bevroren door het plaatsen in vloeibare stikstof. Store bevroren harten in een -80 ° C vriezer.
   LET OP: Voor het meten van hoge energie fosfaat verbindingen (dat wil zeggen, ATP, creatine fosfaat), de harten onmiddellijk worden bevroren.

Resultaten

Figuur 1 toont de typische resultaten van de ene muis experiment. LVP (rode lijn), dP / dt (groene lijn) en de temperatuur (paarse lijn) werden continusouly geregistreerd dan ~ 3 uur. Letters duiden op een - nulmeting, b, c, d, e - levering van cardioplegia oplossing, f - begin van reperfusie, g, h, i, j - meting van cornary stroom tijdens reperfusie. Let op, depressief LVDP en dP / dt na reperfusie vergeleken met baseline. Figuur 1B bevat de gegevens van een opgenomen dan ~ 2 sec. Merk...

Discussie

Het vorige protocol gegevens methoden te evalueren myocard prachtige secundair aan wereldwijde ischemie geassocieerd met cardioplegische arrestatie. In onze handen produceert dit protocol een geschatte ~ 40% vermindering van de hartfunctie (LVDP, +/- dP / dt) met minimale veranderingen van de hartslag op de 30 min post-reperfusie tijdstip. Aangezien het hart reperfusie en opgewarmd alle parameters van de hartfunctie verminderd initieel tijdstippen met een sterk verminderde hartslag te stabiliseren tussen 20 en 30 min. C...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbool / Concentraties (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters - 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion reservoir (1L)
cardioplegia reservoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures