Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

Technologieën zoals fluorescentie spectroscopie, fluorescentie microscopie en flowcytometrie, allemaal afhankelijk van fluorescentie, een woning op grote schaal uitgebuit in biochemische, biomedische en chemische toepassingen. Fluorescentie, hetzij intrinsiek of door etikettering, is benut voor de analyse van eiwit expressie en profielen lot van de cel, eiwit interacties en biologische functies ^1-9, en door fluorescentie / Förster resonantie energieoverbrenging voor de detectie van biomoleculen interacties en conformationele veranderingen ^10-13. Aangezien de isolatie van het Aequorea victoria groen fluorescerend eiwit (GFP) ^14,

Protocol

1. Voorbereiding van zoogdiercellen, Viral Productie en Transduction voor Genetische barcodes

1. Plaat 2,5 x 10 ⁶ hechtende cellen in een 10 cm plaat (of ongeveer 50-60% confluentie) één dag voor transfectie in Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS). Voor retrovirale productie gebruik inpakcellijn-lijn van keuze, zoals Phoenix-GP (een soort geschenk van Gary Nolan, Stanford University).
   OPMERKING: De inpakcellijn stabiel uitdrukt Gag en Pol eiwitten voor retrovirale vorming deeltje in trans. Controleer cellen gezond en gehecht aan de plaat in een monolaag vóór transfectie.
2. 24 uur ....

Results

Multiplexing fluorescerende genetisch barcode cellen ten behoeve van biologische toepassingen kan alleen worden bereikt wanneer individuele klonale populaties zijn gegenereerd. Multiplexing is het meest effectief wanneer barcode populaties duidelijk te onderscheiden fluorescerende eigenschappen met minimale spectrale overlap. De in figuur 1 met klonale populaties van cellen zoogdiercellen SupT1 voorbeeld illustreert dat barcode cellen met mCherry en cyaan fluorescerend eiwit (CFP) gemakkelijk simultaan .......

Discussion

Hier twee goed uitgewerkte procedures zijn gecombineerd; genetische manipulatie door middel van retrovirale technologie en detectie van fluorescerende eiwitten met behulp van flowcytometrie. Fluorescerend eiwit gebaseerde genetische barcode voor de productie van unieke cellijnen verschaft een robuuste en eenvoudige manier voor multiplex toepassingen. Genereren van genetisch gemanipuleerde barcode cellen door retrovirale-technologie, is in eerste instantie een langdurig proces, maar maakt het mogelijk om te verkrijgen, e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml syringes	BD	309604	used for filtering the virus
0.45 µm ploytetrafluoroethylene filter	Pall Corporation	4219	used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine)	poly sciences	23966-2	2 mg/ml concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated)	Eppendorf	5805 000.017	used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline)	Corning	21-040-CV	used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Used to increase viral infection efficiency. Used at a 5 µg/ml concentration.
FACSAria	BD Biosciences		instrument used for sorting cell populations
FACSCanto	BD Biosciences		instrument used for cell analysis
Phoenix-GP	Gift from Gary Nolan		cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum	Mediatech	MT35015CV	used for cell growth and sorting
SupT1 cells	ATCC	CRL-1942	Human T lymphoblasts
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268	Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	cell growth media for SupT1 cells