Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Summary

Sinds de ontdekking van het groene fluorescente eiwitgen, hebben fluorescente eiwitten invloed gehad op de moleculaire celbiologie. Dit protocol beschrijft hoe expressie van verschillende fluorescente eiwitten door genetische manipulatie wordt gebruikt voor het barcoden van individuele cellen. De procedure maakt het mogelijk om verschillende populaties in een cellenmengsel te volgen, wat ideaal is voor multiplextoepassingen.

Abstract

Fluorescente eiwitten, fluorescente kleurstoffen en fluoroforen in het algemeen hebben de moleculaire celbiologie gerevolutioneerd. Met name de ontdekking van fluorescente eiwitten en hun genen heeft de engineering van eiwitfusies mogelijk gemaakt voor lokalisatie, de analyse van transcriptionele activering en translatie van eiwitten van belang, of het algemene volgen van individuele cellen en celpopulaties. Het gebruik van genen voor fluorescente eiwitten in combinatie met retrovirale technologie heeft verder de expressie van deze eiwitten in zoogdiercellen op een stabiele en betrouwbare manier mogelijk gemaakt. Hier wordt getoond hoe men deze genen kan gebruiken om cellen binnen een populatie cellen hun eigen biosignature te geven. Aangezien de biosignature wordt bereikt met retrovirale technologie, worden cellen onbepaald lang gebarcodeerd. Als zodanig kunnen ze afzonderlijk worden gevolgd binnen een mengsel van gebarcodeerde cellen en worden gebruikt in meer complexe biologische toepassingen. Het volgen van verschillende populaties in een mengsel van cellen is ideaal voor multiplexed toepassingen zoals de ontdekking van geneesmiddelen tegen een veelvoud van doelen of het activeringsprofiel van verschillende promotoren. Het protocol beschrijft hoe men elegant gebarcodeerde zoogdiercellen kan ontwikkelen en amplificeren met verschillende genetische fluorescente markers, en hoe men meerdere markers tegelijk of één marker op verschillende intensiteiten kan gebruiken. Ten slotte beschrijft het protocol hoe de cellen verder kunnen worden gebruikt in combinatie met cel-gebaseerde assays om de kracht van analyse door multiplexing te verhogen.

Introduction

Technologieën zoals fluorescentie spectroscopie, fluorescentie microscopie en flowcytometrie, allemaal afhankelijk van fluorescentie, een woning op grote schaal uitgebuit in biochemische, biomedische en chemische toepassingen. Fluorescentie, hetzij intrinsiek of door etikettering, is benut voor de analyse van eiwit expressie en profielen lot van de cel, eiwit interacties en biologische functies ^1-9, en door fluorescentie / Förster resonantie energieoverbrenging voor de detectie van biomoleculen interacties en conformationele veranderingen ^10-13. Aangezien de isolatie van het Aequorea victoria groen fluorescerend eiwit (GFP) ^14, de ontdekking van nature voorkomende fluorescerende eiwitten van andere cnidarians, vooral koralen, sterk toegenomen het aantal bestaande fluorescerende eiwitten met onderscheiden excitatie / emissie spectra. Deze, samen met de introductie van mutaties in de genen ^15-19, have verder uitgebreid de mogelijkheden, het verkrijgen van een ware palet van fluorescente proteïnen beschikbaar voor wetenschappers die microscopie benutten flowcytometrie andere fluorescentie gebaseerde technologieën voor hun onderzoek.

Daarnaast hoewel onafhankelijk de ontwikkeling van retrovirale technologie drastisch vergemakkelijkt de stabiele expressie van ectopische genetische informatie in zoogdiercellen ^20-23. Het is dus niet verwonderlijk dat deze technologie is gebruikt om genen van fluorescerende eiwitten over in een groot aantal celtypen en weefsels ^24-28 of voor de productie van transgene dieren ^29-31. Na de aard van retrovirussen, wordt de genetische informatie van het ectopische fluorescerend eiwit geïntroduceerd in het genoom van de cel ³² en de cel wordt fluorescente 'voor ever'. Deze woning is toegestaan ​​volgen van lot van de cel, of van een enkele cel binnen een populatie van cellen. De nu fluorescerende cel heeft dus Acquired eigen Biosignatuur en kan worden gedefinieerd als barcode. Zijn unieke Biosignatuur identificeert zich van andere cellen, en belangrijker nog, onderscheidt het zich van cellen genetisch gemanipuleerd om verschillende fluorescerende eiwitten met onderscheiden absorptie / emissie spectra te uiten. Biologische toepassingen zoals het volgen van herprogrammering factoren naar pluripotentie ^33, de analyse van subnucleaire factoren voor de opheldering van nucleolaire lokalisatie ^34, de constructie van fluorescerende reporter plasmiden voor transcriptionele studies ³⁵ of de genetische kenmerken van neuronen voor de studie van neuronale netwerkarchitectuur ³⁶ , zijn slechts vier voorbeelden van de vele die verschillende fluorescent proteïne genen benut voor dezelfde experimentele opstelling.

Flowcytometrie ruim is toegepast voor de analyse van biologische processen op enkele cel niveau, zoals genexpressie, celcyclus, apoptose en signalering door fosforylatie ^37-43 .De stabiele expressie van fluorescent proteïne genen in zoogdiercellen is verder versterkt het nut van flowcytometrie voor celanalyse ^38,44 en ligand-receptor interacties ^45. Verbeterde mogelijkheden hebben stroom toegestaan ​​cytometrie een veel gebruikt methodologie voor high-throughput en high content ⁴⁶ geworden. Ondanks het nu uitgebreid aantal fluorometers en robotica technologieën die paar plaatafleesinrichting systemen, beeldvorming en kan flowcytometrie, lijkt er een gebrek in de experimentele ontwerp dat kan benutten en past deze verbeterde technologische mogelijkheden zijn.

Snel, betrouwbaar, eenvoudig en robuust cellen gebaseerde methoden zijn drastisch nodig voor multiplex-toepassingen die verder te verbeteren high-throughput capaciteit. Dit geldt vooral op het gebied van geneesmiddelen waarbij techniek celgebaseerde proeven in een gemultiplexte vorm het vermogen van high-throughput screening ^39,47-50 kan verbeteren . Multiplexing, omdat maakt gelijktijdige analyses in een monster, verder verbetert high-throughput mogelijkheden ^51-54. Fluorescerende genetische barcoding maakt niet alleen voor elegante multiplexing, maar ook, zij eenmaal, omzeilt de noodzaak van tijdrovende protocollen, verlaagt de kosten gepaard met antilichamen, kralen en vlekken ^39,52,55, en kan het aantal schermen die nodig is voor high verminderen throughput toepassingen. We hebben recent beschreven hoe retrovirale technologie multiplexen via fluorescent genetische barcode verbeteren voor biologische toepassingen, door expressie een assay die eerder HIV-1 protease-activiteit ^56,57 monitor met verschillende klinisch voorkomende varianten ^58. De methodologie wordt toegelicht in een meer beschrijvende manier te focussen op hoe om te selecteren en te versterken genetisch fluorescerende barcode cellen en hoe panelen van klonale populaties uiten verschillende fluorescerende eiwitten en / of verschillende fluorescentie intensit producerenies. Panelen van celpopulaties onderscheiden op basis van hun fluorescerende eigenschappen verbeteren gemultiplexte vermogens, die verder in combinatie kunnen worden benut met celgebaseerde proeven die verschillende biologische vragen pakken. Het protocol beschrijft ook hoe je een panel van barcode cellen die één van de cel-gebaseerde testen die eerder ontwikkeld in het laboratorium ingenieur, zoals bijvoorbeeld ^59. Dit protocol is dus niet bedoeld om de gevestigde retrovirale / lentivirale technologie voor genetische overdracht, de waarde van fluorescerende eiwitten of de toepassing van flowcytometrie ^60,48 laten maar om het versterkende kracht van het combineren van de drie voor gemultiplexte aanvragen blijkt.

Protocol

1. Voorbereiding van zoogdiercellen, Viral Productie en Transduction voor Genetische barcodes

1. Plaat 2,5 x 10 ⁶ hechtende cellen in een 10 cm plaat (of ongeveer 50-60% confluentie) één dag voor transfectie in Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS). Voor retrovirale productie gebruik inpakcellijn-lijn van keuze, zoals Phoenix-GP (een soort geschenk van Gary Nolan, Stanford University).
   OPMERKING: De inpakcellijn stabiel uitdrukt Gag en Pol eiwitten voor retrovirale vorming deeltje in trans. Controleer cellen gezond en gehecht aan de plaat in een monolaag vóór transfectie.
2. 24 uur later, de voorbereiding van het DNA transfectie mengsel.
   1. 125 ul serumvrij DMEM voeg 3 ug Vesiculaire stomatitis envelop glycoproteïne vector (pCI-VSVG) en 3 ug overdracht vector die het fluorescerende proteïne gen van interesse. Mengen en voeg 15 ul van polyethylimine (2 mg / ml).
   2. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en voeg aan cellen druppelsgewijs.
      OPMERKING: polyethylimine toegevoegd aan het homogene mengsel DNA transfectie reagens voor de vorming van polyplexen. Om virale deeltjes te verkrijgen dragen verschillende fluorescent eiwit markers, voeren elke transfectie zelfstandig met de markering van keuze. Bedenk dat de retrovirale vector overdracht is ongeveer 7 kb in lengte en kan niet worden verpakt als boven 10 kb.
3. Incubeer de platen bij 37 ° C. Om virusproductie plaats platen verhogen bij 30 ° C of 32 ° C plaats.
   OPMERKING: 24 uur na transfectie media kunnen worden vervangen door 7 ml vers medium, en hoewel dit gezondheid cel kan verbeteren kan viral load in het supernatant af.
4. 48 uur na transfectie verzamel de bovenstaande vloeistof die virusdeeltjes en filter met een 0,45 pm polytetrafluoretheen filter. Gebruik vers verzameld viraal supernatant voor transductie. Othders houden supernatant in aliquots bij -80 ° C en voorkomen vries-dooi. Bedenk dat virale titer waarschijnlijk tot 50% bij elke invriezen ontdooicyclus zal afnemen.
5. Plaat cellijn naar keuze 24 uur voorafgaand aan transductie als aanhanger, of onmiddellijk vóór transductie als niet-klevende. Seed 2.0 x 10 ^5-3,0 x 10 ⁵ hechtende cellen (hier Huh 7.5.1 en HEK 293T) of 5,0 x 10 ⁵ tot 1 x 10 ⁶ niet-hechtende cellen (hier SupT1) per putje in een 6-wells plaat.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u het kalibreren van het aantal cellen voorafgaand aan transductie te worden gezaaid, vooral zo voor hechtende cellen, zodat de cellen bereiken van een samenvloeiing van ongeveer 60% op het moment van transductie.
6. Voeg 5 ug / ml polybreen (hexadimethrene bromide) te gezaaide cellen en voeg eerder verzamelde virale supernatant tot ongeveer 20-40% infectie (hier 2 ml) te verkrijgen.
   OPMERKING: De MOI of percentage van de infectie is meestal arbitrair, zoals sorteren zal toelaten om elke subpopulat versterkenion cellen. Uiteraard, een hoger percentage van de infectie vergemakkelijkt en versnelt het proces van versterking.
7. Transduceren cellen door centrifugeren in een hangende bucket rotor bij 1500 xg gedurende 120 min bij 32 ° C. Resuspendeer niet-hechtende cellen met vers medium voorafgaande aan incubatie. Voor hechtende cellen, te vervangen door vers medium 24 uur na transductie.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de platen centrifugeerden met parafilm verzegelen om te voorkomen dat morsen over. Genetisch barcode diversiteit cel te verhogen, transduceren cellen met virale deeltjes dragen verschillende fluorescerende eiwitten (verkregen uit stap 1.4). Bij het kiezen van fluorescente merkers, zorg ervoor dat ze compatibel zijn met de instrumentatie en ze hebben onderscheiden fluorescerende parameters.

2. Selectie en Versterking van genetisch barcode Cellen

1. Analyseer getransduceerde zoogdiercellen door flowcytometrie ten minste 72 uur na transductie op het kortingspercentage van transductie te kwantificeren. Gebruik een vergelijkbare niet-getransduceerde cellijn als negatieve controle.
   OPMERKING: het sorteren wordt gebruikt om individuele barcode celpopulaties, een hoog percentage van de initiële transductie te zuiveren, terwijl het niet nodig is, moet versnellen het proces van versterking.
2. Gebruik de cel sorter keuze aan de cellen die het eiwit van interesse tot expressie te verkrijgen.
   1. Daartoe zorgen de poorten goed zijn ingesteld in de juiste kanalen.
      1. Om dit te doen gebruiken dezelfde naïeve cellijn als negatieve controle en stel de parameter / kanaal spanning, zodat de negatieve bevolking is lager dan de waarde van 10 ³ op elke TL-as. Bepaal venstertijd voor positieve fluorescentie als gebeurtenissen die boven die van de negatieve controle voor elk fluorescerende kanaal verschijnen.
   2. Wees ervan bewust dat elk instrument kan variëren en de juiste spanning voor het bepalen van gating moet dienovereenkomstig worden aangepast, het maken van positieve en negatieve controles imperatief in elk experimental setup.
      1. Voor fluorescentie detectie in deze experimentele opstelling te kunnen gebruiken de FITC kanaal (530/30 band pass filter voorafgegaan door een 502 lange pass filter) voor eGFP, de PE-kanaal (585/42 band pass filter voorafgegaan door een 556 lange pass filter) voor td Tomaat , en het APC-kanaal (660/20 band pass filter) voor E2 Crimson.
         OPMERKING: De 488 nm laser boeit eGFP en td Tomaat terwijl E2 Crimson wordt opgewekt door de 633 nm laser.
3. Sorteren in 15 ml conische buizen met 1 ml 100% FCS.
   Opmerking: Het proces sorteren fluorescente celpopulaties niet verplicht als een direct doorgaan met de soort van individuele klonen (zie hieronder). Sorteren strakke populatie op basis van gekozen fluorescentie zorgt voor een back-up bevolking voor de toekomstige selectie van individuele klonen. Houd in gedachten dat individuele cellen zijn soms moeilijk om te groeien, terwijl een grote populatie van cellen gemakkelijk kunnen worden bevroren, en vervolgens ontdooid en versterkt in een later stadium.
4. Spin onderaan de gesorteerde populaties hangend bucket rotor centrifuge bij 524 g bij 32 ° C gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Resuspendeer in 1 ml vers medium en opnieuw cellaag zodat cel confluentie is dan 60% groei en deling wacht ten minste twee dagen.
   1. Bijvoorbeeld plaat hechtende cellen op ongeveer 3 x 10 ⁵ cellen in 2 ml medium per putje in een 6-wells plaat en 2 x 10 ⁶ cellen in 2 ml medium in een 6 cm plaat. Gebruik DMEM voor hechtende cellen en RPMI voor niet-hechtende cellen (of enige drager indien nodig). Plaats cellen uitgeplaat in een incubator bij 37 ° C gedurende enkele dagen amplificatie mogelijk.

3. Zorg voor klonale populaties van genetisch barcode cellen op verschillende intensiteiten

1. Verkrijgen klonale populaties van cellen oorspronkelijk getransduceerde (stap 1.7) of de gesorteerde populatie (stap 2.3).
   LET OP: Dit zal zorgen voor gelijke of gelijkwaardige niveau van fluorescerend eiwit expressie onder al de cels binnen de populatie (een strakke populatie met een kleine CV gemiddelde fluorescentie-intensiteit van 40%).
   1. Daartoe soort enkele cellen in 96-well platen met een geautomatiseerde cel neerslageenheid (ACDU). Stel poorten voor het sorteren volgens de bevolking van belang. Zorgen poorten zijn ingesteld ten minste één log-schaal uit elkaar te onderscheiden populatie te verkrijgen bij het kiezen van cellen op verschillende fluorescentie-intensiteiten. Voor de hier getoonde procedure, maken gebruik van dezelfde flowcytometrie experimentele opgezet als de ene in stap 2.2 beschreven.
2. Amplify individuele klonen in een incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 2 weken. Door het proces van amplificatie analyseren de cellen onder de microscoop opdat groeiende bevolking ontstaan ​​uit afzonderlijke cellen en niet uit meer dan één.
   LET OP: Vergeet niet dat de sorter één cel per putje zal leggen op het gemiddelde, en terwijl sommige putten elke cel niet kan hebben helemaal niet, anderen kunnen er meer zijn.
   1. Om ervoor te zorgen dat een povolking ontstaat uit één cel alleen, uiterst voorzichtig met de plaat en nooit verstoren de putten door pipetteren. Bekijk de plaat, goed door goed, onder de microscoop.
      OPMERKING: Terwijl de individuele cellen kan soms moeilijk te identificeren, als ze eenmaal beginnen te delen zullen ze gemakkelijk te herkennen zijn.
   2. Wees ervan bewust dat vaak cellen 'klomp' langs de randen. Gooi die putten waar meerdere klonale populaties kunnen worden waargenomen en die bewaren, dat een strakke bevolking.
      OPMERKING: Het is raadzaam om deze over te dragen in grotere platen voor versterking.
3. Zeef de vermoedelijke klonale populaties door deze te analyseren door flowcytometrie. Vergelijk ze een negatieve controle die dezelfde flowcytometrie experimentele opstelling.
   1. Analyseer slechts een percentage van het monster en houden de rest als backup. Kies de meest duidelijk omschreven populaties op basis van gemiddelde intensiteit en de dichtheid van de bevolking. Versterken ze als dat nodig is of voorraden te bevriezen inbevriezing medium met 20% glycerol bij -80 ° C gedurende korte perioden of vloeibare stikstof langer.
      LET OP: Vergeet niet dat een 'echte' klonale populatie een zeer strakke fluorescentie patroon zou moeten hebben.

4. Zorg Multiplexing Mogelijkheden voor high throughput screening (HTS)

1. Combineer zoveel afzonderlijke klonale populaties nodig die verder kunnen worden gebruikt in een multiplex formaat. Kies klonen met onderscheidbare absorptie / emissie spectra en / of verschillende intensiteiten. Als een 96-well plaat formaat wordt gebruikt, die geschikt is voor HTS, zaad 50.000 cellen in 200 ul per putje.
   OPMERKING: Houd er rekening mee dat het aantal cellen is slechts een schatting en kunnen veranderen op basis van cell-type en of het aanhangend of niet.
2. Analyseer het monster met behulp van flowcytometrie zodat elk onafhankelijk vastgestelde fluorescerende cellijnen kunnen worden onderscheiden van elkaar. Voorafgaand aan de analyse te maken negatieveen enkele kleur controles om de parameters en compensatie waarden in te stellen.
   NB: Het instellen van de parameters om een ​​duidelijk onderscheid van de gemengde populatie zal hen in staat stellen verder te worden gebruikt in een multiplex-formaat.

5. Pas Genetisch Barcoded cellijnen aan de Biologische Toepassing van Keus

1. Transduceren vastgesteld genetisch barcode cellijnen met virale deeltjes die de testelementen keuze bevatten, zoals hier beschreven Stolp et al., 2013 ^59. Bedenk dat de test van keuze een extra en onderscheidbaar fluorescerend kanaal moet innemen en dus moet worden overgebracht naar de juiste barcode cellijn.
   OPMERKING: Elke barcode cellijn kan een andere test te dragen.
2. Sorteer genetisch fluorescerende barcode cellen voor degenen die analyse-elementen bevatten.
   OPMERKING: Assay elementen kunnen worden gemanipuleerd gekoppeld aan een label of fluorescerend eiwit (als een fusie of door een interne ribosoom binnenkomstplaats) fof eenvoudig opsporing door western blotting, flowcytometrie of microscopie. Het systeem gebruikt in dit protocol is gebaseerd op HA epitoop oppervlakte-expressie alleen, of met extra FLAG epitoop expressie.
   1. Vlekken de klonale populaties die de assay met HA en APC-fluorescent gekoppelde antilichamen. Vervolgens analyseren de klonale populaties met anti-FLAG en FITC-geconjugeerd antilichaam kleuring.
   2. Om terug volgen de assay geanalyseerd of "decoderen" van de bevolking in het juiste kanaal waarbij de kenmerkende genetisch barcode cellijnen kunnen worden onderscheiden. Hier, decoderen de aard van het substraat door het analyseren in het PE kanaal TD Tomato detectie.

Results

Multiplexing fluorescerende genetisch barcode cellen ten behoeve van biologische toepassingen kan alleen worden bereikt wanneer individuele klonale populaties zijn gegenereerd. Multiplexing is het meest effectief wanneer barcode populaties duidelijk te onderscheiden fluorescerende eigenschappen met minimale spectrale overlap. De in figuur 1 met klonale populaties van cellen zoogdiercellen SupT1 voorbeeld illustreert dat barcode cellen met mCherry en cyaan fluorescerend eiwit (CFP) gemakkelijk simultaan ...

Discussion

Hier twee goed uitgewerkte procedures zijn gecombineerd; genetische manipulatie door middel van retrovirale technologie en detectie van fluorescerende eiwitten met behulp van flowcytometrie. Fluorescerend eiwit gebaseerde genetische barcode voor de productie van unieke cellijnen verschaft een robuuste en eenvoudige manier voor multiplex toepassingen. Genereren van genetisch gemanipuleerde barcode cellen door retrovirale-technologie, is in eerste instantie een langdurig proces, maar maakt het mogelijk om te verkrijgen, e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml spuiten	BD	309604	gebruikt voor het filteren van het virus
0,45 µm ploytetrafluorethyleen filter	Pall Corporation	4219	gebruikt voor het filteren van het virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	45000-304	celgroeimedia voor HEK 293T cellen
PEI (Polyethyleenimien)	poly sciences	23966-2	2 mg/ml concentratie gebruikt
Hangende emmercentrifuge (gekoeld)	Eppendorf	5805 000.017	gebruikt voor spininfectie
PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing)	Corning	21-040-CV	gebruikt voor het wassen van cellen
Polybrene (hexadimethreen bromide)	Sigma-Aldrich	107689	Gebruikt om de efficiëntie van virale infectie te verhogen. Gebruikt op een 5 µg/ml concentratie.
FACSAria	BD Biosciences		instrument gebruikt voor het sorteren van celpopulaties
FACSCanto	BD Biosciences		instrument gebruikt voor celanalyse
Phoenix-GP	Gift van Gary Nolan		cellijn gebruikt om retrovirale deeltjes te produceren
Fetaal runder serum	Mediatech	MT35015CV	gebruikt voor celgroei en sortering
SupT1 cellen	ATCC	CRL-1942	Menselijke T-lymfoblasten
HEK 293T cellen	ATCC	CRL-11268	Menselijke embryonale niercellen die ook het SV40 grote T-antigeen bevatten
RPMI 1640	Corning	10-040-CV	celgroeimedia voor SupT1 cellen