Functionele karakterisatie van Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Warmtewisselaars van intracellulaire compartimenten met Proton-doden Selectie om ze te uiten op het plasmamembraan

Samenvatting

Het eerste deel van dit artikel laat zien hoe mutante cellijnen te selecteren zijn die vesiculaire Na⁺/H⁺ uitwisselaars in hun plasmamembraan tot expressie brengen. Het tweede deel biedt protocollen gebaseerd op intracellulaire pH-metingen en snelle ionopname, die worden gebruikt om de ionselectiviteit en de kinetische parameters van deze uitwisselaars te bepalen.

Samenvatting

Endosomale verzuring is van cruciaal belang voor een breed scala van processen, zoals eiwitten recycling en degradatie, receptor desensibilisatie, en neurotransmitter laden in de synaptische blaasjes. Deze verzuring wordt beschreven te worden gemedieerd door proton ATPasen gekoppelde CIC chloride transporters. Sterk geconserveerde electroneutrale protonen transporters, worden de Na ⁺ / H ⁺ uitwisselaars (NHE) 6, 7 en 9 ook die in deze compartimenten. Mutaties in de genen verbonden met menselijke cognitieve en neurodegeneratieve ziekten. Paradoxaal genoeg, hun rol blijven ongrijpbaar, als hun intracellulaire lokalisatie heeft verhinderd gedetailleerde functionele karakterisatie. Het manuscript geeft een methode om dit probleem op te lossen. Deze bestaat uit de selectie van mutante cellijnen, bestand zijn tegen acute cytosolische verzuring door behoud intracellulaire NHEs op het plasmamembraan. Het toont dan twee aanvullende protocollen bij het ion selectiviteit en activiteit te metenDeze wisselaars: (i) één gebaseerd op intracellulaire pH-metingen via fluorescentie microscopie video, en (ii) een op basis van de snelle kinetiek van lithium opname. Dergelijke protocollen kunnen worden geëxtrapoleerd naar andere niet-elektrogene transporters meten. Bovendien is de selectieprocedure gepresenteerde genereert cellen met een intracellulaire retentie defect fenotype. Daarom zullen deze cellen ook andere vesiculaire membraaneiwitten in de plasmamembraan drukken. De experimentele strategie hier afgebeelde derhalve een potentieel krachtig hulpmiddel om andere intracellulaire eiwitten die dan wordt uitgedrukt in het plasmamembraan met vesiculaire Na ⁺ / H ⁺ warmtewisselaars gebruikt voor de selectie.

Inleiding

De meeste intracellulaire compartimenten geven een zure luminale pH, dat is een belangrijke parameter voor de rijping, mensenhandel, recycling van eiwitten of hormonen en neurotransmitters geladen. Aangetoond is dat de pH-gradiënt tussen cytosol en vesiculaire inhoud wordt gegenereerd door vacuolair H ⁺ ATPasen ^1, gekoppeld met vesiculaire ClC chloride transporteurs ^2. Zowel in de knock-out (KO) muizen en menselijke patiënten, het belang van deze transporters werd benadrukt door de zware fenotypes veroorzaakt door mutaties in hun genen ^3-6.

De leden van de natrium-waterstof wisselaars SLC9A familie, aangeduid ook NHEs voor Na ⁺ / H ⁺ wisselaars, is aangetoond sleutel effectoren in intracellulaire pH en celvolume regulatie, evenals in vectoriële transport van zuur-base-equivalenten in epithelia worden . Naast de plasmamembraan NHEs, drie zeer geconserveerde Na ⁺ / H ⁺ wisselaars NHE 6, 7en 9 worden uitgedrukt in trans-Golgi netwerk en begin endosomen ^7. Mutaties in hun genen hebben in verband gebracht met het Angelman-achtige of Christianson syndromen ^8-9, familie-gebaseerde autisme ¹⁰ en Attention Deficit Hyperactivity Disorder ^11-12. Deze warmtewisselaars zijn ook betrokken geweest bij neurodegeneratieve problemen zoals Alzheimer ziektegevoeligheid ¹³ en X-gebonden mentale retardatie aaneengesloten genen syndromen ^14. Tezamen bieden deze studies benadrukken het belang van deze intracellulaire NHEs in ontwikkeling van de hersenen en / of functie.

De intracellulaire lokalisatie van deze wisselaars voorkomt nauwkeurige metingen van hun ionselectiviteit, transport richting, kinetische parameters en regelgeving. Zoals bij alle transporteurs uitgedrukt in intracellulaire compartimenten, is het uiterst moeilijk om hun biochemische activiteiten te beoordelen en daarmee tot volle hun fysiologische rol en de Mechanismen onderliggende hun pathologische gevolgen. Gebaseerd op de hoge cytosolische K ⁺ concentratie, de meest algemeen aanvaarde hypothese was dat ze werken als K ⁺ gekoppelde proton efflux transporters. Het bestaan ​​van dergelijke proton lek werd verondersteld, omdat proton pomp kan compenseren door de V-ATPasen om een ​​steady state vesiculaire pH te handhaven. Het doel van dit visuele artikel is (i) een werkwijze die de genetische selectie van cellijnen die dergelijke vesiculaire transporters op de plasmamembraan expressie, en (ii) twee onafhankelijke benaderingen om de functies van deze transporters meten zichtbaar blijft tonen.

Drie decennia geleden hebben Pouysségur en Franchi een genetische benadering die de moleculaire klonering en karakterisering van de leden van de NHE familie ¹⁵ ingeschakeld bood. Dit was gebaseerd op de toxiciteit van intracellulaire protonen als screeningsmethode. De eerste stap was om cellijnen deficiënt te verkrijgenin een Na ⁺ / H ⁺ uitwisseling uitgedrukt op het plasmamembraan, waarbij de reversibiliteit van deze transporter. Fibroblasten (CCL39 cellijn) werden voorgeladen met Na ⁺ of Li ⁺ en daarna in een zuur extracellulaire medium (pH 6,5) gedurende 2 uur. Dit leidde tot de dood van cellen die een functioneel Na ⁺ / H ⁺ uitwisseling en de selectie van antiporter-deficiënte cellen (PS120 cellijn) ^16. Wanneer gekweekt in bicarbonaat-vrij medium, deze cellen zijn zeer gevoelig voor acute intracellulaire aanzuring. Bijgevolg zal de expressie van een functioneel proton efflux mechanisme het plasmamembraan positief worden geselecteerd (zie ¹⁷⁾ of dergelijke cellen zijn afkomstig van acute intracellulaire acidifications. Dergelijke verzuring technieken kunnen worden gebruikt om cellijnen te isoleren met verhandelen gebreken waarvan de geforceerde expressie van WT intracellulaire NHEs het plasmamembraan.

Als eukaryotische Na ⁺ / H⁺ Wisselaars electroneutrale, zijn ze niet meetbaar door de elektrofysiologische benaderingen die zijn met succes gebruikt om kanalen te meten. Dit manuscript toont dus hoe de activiteit van dit wisselaar te meten door intracellulaire pH-metingen en snelle kinetiek van lithium opname. Als de onderliggende begrippen hetzelfde is interessant op te merken dat veel van de werkwijzen ontwikkeld voor het gedeelte selectie ook rechtstreeks worden gebruikt voor functionele metingen.

Interessant, hebben we vastgesteld dat de handel defect in de cellijnen geselecteerd met de in dit manuscript beschreven aanpak leidt tot een grotere expressie van andere vesiculaire eiwitten in het plasmamembraan zoals vesiculaire kaliumkanaal TWIK1 ^18. Dit wijst in de richting van de selectie van een algemene retentie defect mechanisme voor vesiculaire transmembraaneiwitten. Vandaar deze selectieprocedure en de cellen die het genereert meivormen een veelbelovend hulpmiddel voor de wetenschappelijke gemeenschap aan het membraaneiwitten van intracellulaire compartimenten. Zowel de meettechnieken hier gepresenteerde zou gelden voor het bestuderen van andere niet-elektrogene transporters zijn.

Protocol

1. H ⁺ Killing Selection

1. Cellijnen
   1. Stabiel transfecteren NHE-deficiënte cellen (bijvoorbeeld het CCL39-afgeleide PS120 cellijn ¹⁶⁾ met combinatie van zoogdierlijke expressievector en transfectie werkwijze eventuele die efficiënte transfectie opbrengsten en selectie zal produceren in een fibroblast cellijn.
      OPMERKING: Voor vele jaren calciumfosfaatprecipitatiewerkwijze ¹⁹ werd gebruikt met goede transfectie opbrengsten. Dit werd onlangs vervangen door commerciële reagentia zoals Lipofectamine2000, de transfecties wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.
2. Oplossingen
   1. Bereid drie steriele oplossingen zoals hieronder beschreven. Steriliseer deze oplossingen door filtratie (0,22 pm).
      1. Bereid een _NH4 ⁺ geladen (pH 7,4) bestaande uit 50 mM _NH4CI, 70 mM cholinechloride, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM GLucose en 15 mM MOPS pH 7,4.
      2. Bereid een spoeloplossing (pH 7,0) bestaande uit 120 mM choline chloride, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,0.
      3. Bereid een Recovery oplossing (pH 7,4) bestaande uit 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4.
3. Voordat de selectie, het verkrijgen van een celkweek incubator die kunnen worden gebruikt bij 37 ° C zonder extra _CO2 uit buitentank (aangeduid CO ₂ - "vrij" incubator), 5% _CO2 leidt tot buffering die kan verminderen de verzuring. Amplify de cellijn de NHE plaats tot ongeveer 2 x 10 ⁸ cellen (gewoonlijk ongeveer 20 confluente 100 mm platen).
4. H ⁺ doden procedure:
   1. Incubeer de cellen die de intracellulaire NHE plaats gedurende 1 uur in de beladingsoplossing, 37 ° C in de _CO2-vrije incubator.
   2. Zuig het laden oplossing en spoel ze tweemaal in de bovenbeschreven-spoeloplossing. Voer deze stap efficiënt om de resterende extracellulaire _NH4Cl dat de oprichting van een steile _NH4 ⁺ gradiënt dat de verzuring zal genereren afbreuk zou elimineren.
   3. Elimineer het spoelmedium door afzuiging en incubeer de cellen gedurende een uur recovery oplossing opnieuw bij 37 ° C in de _CO2 incubator vrij.
   4. Vervang het herstelmedium regelmatig kweekmedium (DMEM typisch 7,5% FCS) en groeien de cellen in standaard kweekcondities (37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% _CO2 en 95% lucht).
5. Herhaal deze cyclus van selectie tweemaal per week tot stabiele klonen ontstaan.
   OPMERKING: Wees extra voorzichtig met betrekking tot de celcultuur en selectievoorwaarden. Maanden van het werk kan worden geruïneerd door elke vorm van verontreiniging, dat is meer vatbaar voor occur na een lange periode van cultuur en herhaalde cel manipulaties.
   1. Hier kiezen of u de klonen te versterken en te karakteriseren hen individueel zoals nader beschreven in de paragrafen 2-3, of bundelen ze samen om een ​​mobiele bevolking vóór karakterisering genereren.
6. Breng incidentele selectie (ongeveer om de twee weken) het aanzuren-resistente cellen behouden door toonbank selecteren die kunnen teruggekeerd naar de ouderlijke zuur-gevoelige fenotype (Figuur 1B).

2. De intracellulaire pH Metingen

2.1) Fluorescentie pH Imaging

1. Gebruik de ratiometrisch pH-gevoelige fluorescente kleurstof BCECF / AM, dat is pH-gevoelig bij excitatie bij 490 nm en beschikt over een 445 nm isosbestic punt, volgende protocollen van de fabrikant.
   1. Alternatief gebruik andere pH-gevoelige probes volgende protocollen van de fabrikant.
2. Gebruik een imaging set consteld uit een omgekeerde microscoop gekoppeld aan een hoge gevoeligheid videocamera. Rusten deze set met 450 nm en 490 nm smalle band interferentie filters gecombineerd met de juiste kwarts neutrale dichtheid filters voor excitatie.
   1. Indien mogelijk, gebruik maken van de juiste set van filters en verlichting voorwaarden setup vergelijkbaar fluorescentie waarden voor λ1 en λ2, zodat de verhouding benadert 1. Vermijd ook basale fluorescentie waarden die zijn ingesteld ofwel verzadigen of te laag is, zowel voor λ1 en / of λ2. Dit kan van belang artefacten opleveren als toen het quotiënt mag niet detecteerbaar zijn, hoewel de intracellulaire pH is aan het veranderen.
      Opmerking: Dit systeem moet snelle perfusie, time-lapse excitatie bij de twee bovengenoemde golflengten en verwerving mogelijk op de juiste emissiegolflengte (535 nm voor BCECF). Voorzie het systeem met software waarmee de automatische data-acquisitie en opslag.

2.2) Meting van NHE Forward Activity (Extrusie vanProtonen uit het cytosol)

1. Zuur cellen door een 1 uur incubatie in de _NH4 ⁺ geladen oplossing (zie stap 1.4) bij afwezigheid van CO _2.
2. Voeg BCECF-AM (5 uM eindconcentratie) aan de oplossing van de laatste vijf minuten en spoel het met _NH4 ⁺ beladingsoplossing de extracellulaire probe elimineren.
3. Monteer de cellen op de microscoop en neemt meerdere afbeeldingen een stabiele basislijn te nemen. Perfuseren de spoeloplossing (zie hierboven). Dit resulteert in een daling van fluorescentie overeenkomt met de verzuring.
4. Na pH stabilisatie perfuseren een van de onderstaande oplossingen tot pH opbrengst gemedieerd door Li ⁺ / H ^+, Na ⁺ / H ⁺ of K ⁺ / H ⁺ uitwisseling meten. Elke oplossing bevat een mogelijke koppeling catie te worden getest op H ⁺ uitwisseling. Als een van deze wordt getransporteerd, zal dit resulteren in een fluorescentie verhoging bij 495 nm die correspondond een verhoging van de intracellulaire pH:
   120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4
   120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4
   125 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4

2.3) Meting van NHE Reverse Activity

OPMERKING: Het principe is hier om de transmembraan ionische gradiënten omkeren.

1. Voorafgaand aan de meting, laden de cellen met de intracellulaire catie van belang (zie hieronder).
2. Incubeer ze gedurende 5 minuten met BCECF / AM (zie stap 2.2.2); spoel ze af, monteer ze op de video microscoop.
3. Perfuse het laden oplossing en neem verschillende beelden naar een stabiele basislijn te nemen.
4. Na de basislijn stabilisatie, imago van de schommelingen in de pH wanneer de cellen perfusie met een extracellulaire zuur medium met 120 mM choline chloride, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM MES bij pH 6,5.
5. Voor LiCl laden, incubeer cellen gedurende 2 uur in een oplossing bestaande uit 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4. Intracellulaire lithium gemeten met atoomabsorptie spectroscopie levert een waarde van ongeveer 60 mM.
6. Voor Na ⁺ laden, incubeer cellen gedurende twee uur in een oplossing bestaande uit 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glucose en 15 mM HEPES bij pH 7,4 in aanwezigheid van 1 mM ouabaïne de Na / K ATPase blokkeren. In deze omstandigheden intracellulaire Na ⁺ concentratie in het traject van 40 mM.
   OPMERKING: K ⁺ belasting is niet noodzakelijk als cytosolische K ⁺ concentratie in het gebied van 140 mM en een naar buiten gerichte K + gradiënt is dus eenvoudig te realiseren.

2.4) De gegevens Behandeling en kalibratie:

OPMERKING: Deze stap geldt zowel voor het vooruit en achteruit metingen.

1. Aan het einde van elk experiment perfuseren cellen met een oplossing van 140 mM KCI, 20 mM HEPES en 5 uM nigericine op pH-waarden tussen 6,5 en 7,4.
2. Verzamel gegevens als fluorescentie metingen van de beelden (grijs niveaus vertegenwoordigen intensiteit niveaus) en export onder tekstformaat en behandelen als toegelicht met behulp van een spreadsheet programma.
3. Bereken intracellulaire pH-waarden voor elke afzonderlijke cel of gebied van belang met de volgende vergelijking:
   pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R _max -R)) x F _{min (λ2)} / F _{max (λ2)}
4. Gebruik de F _{min (λ2)} / F _{ma x (λ2)} verhouding als er probe bleken of lekken, wat resulteert in een afname in de 450 nm fluorescentie gedurende de experimenten. Dit is echter zeer zelden waargenomen in de bij de des voorwaardencribed experimenten.
5. Aangezien de kalibratiegegevens bij het einde van elke pH meting, controleert of de overeenkomstige berekende waarden afwijken van de pH worden gebruikt voor kalibratie. Als dit het geval dan met de volgende procedure pas alle experimenteel bepaalde pH-waarden aan de kalibratie:
   1. Bereken de volgende quotiënt (Q, het verschil tussen de meetwaarden / Verschil tussen de kalibratiewaarden). Vermenigvuldig de hele dataset door Q. Maak de laatste aanpassing door optellen of aftrekken, zodat de berekende waarden van de bijbehorende kalibratie waarden zal evenaren.

3. Metingen van Initial tarieven van NHE7 door Fast Li ⁺ Opname

1. Zaad cellen op meerdere putjes (6 tot 24-well) en zuur ze met behulp van de _NH4 ⁺ ladingstechniek boven of afwisselend de nigericine / bovine serum albumine (BSA) verzuring ²⁰ beschreven beschreven.
2. Spoel platen tweemaal snel met de bovenbeschreven spoeloplossing en vervolgens incuberen van de cellen in opname oplossingen bevattende 1-10 mM lithium (iets onder Km waarden) en de gewenste concentratie van de kationen en / of remmers van belang zijn voor de gewenste hoeveelheid van de tijd.
3. Onderhouden kort en consistente opname duur (meestal een minuut of hieronder) om ervoor te zorgen dat het vervoer werkt in eerste tarieven omstandigheden. Zorg er ook voor dat alle gebruikte voor opname oplossingen zijn isotone.
4. Aan het einde van de opname tijd voorzichtig elimineren het opname medium en was de cellen vier keer met ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voer deze wast zo snel mogelijk (minder dan 10 sec voor de vier van hen is ideaal) lithium uitstroom te voorkomen.
5. Lyse van de cellen in 25% salpeterzuur. Breng 250 ui per putje van 25% salpeterzuur en laat het zitten gedurende ten minste 1 uur, daarna schroot elk putje met het uiteinde van de pipet en breng het geheel goed suspensie in een nieuw microcentrifuge buis.
6. Breng het lysaat in 1,5 ml microcentrifuge buizen centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 15.000 xg (kamertemperatuur) om de celresten te verwijderen.
7. Meet de lithium van de bovenstaande vloeistoffen door atoomabsorptiespectroscopie ^21.
   OPMERKING: Verschillende bedrijven bieden atomaire absorptie spectrometers, die moeten worden uitgerust met een Lithium holle kathode lamp. Volg de instructies van de fabrikant, zoals deze machines zijn zeer nauwkeurig, maar ook heel delicaat.

Resultaten

Selectie:

De H ⁺ doden selectie is gebaseerd op de diffusie van de ammonium zwakke base, zoals weergegeven in figuur 1A. Het effect van zwakke basen en zuren diffusie op intracellulaire pH is ontwikkeld door Walter Boron en medewerkers ^22. De elegante idee om dit fenomeen te gebruiken voor de productie van een dodelijke verzuring voor positieve genetische selectie werd vervolgens ontwikkeld door Jacques Pouysségur ^17. In het kader van een der...

Discussie

Dit protocol wordt beschreven hoe cellen die intracellulaire Na ⁺ / H ⁺ uitwisselaars bij de plasmamembraan selecteren zonder dat hun primaire sequentie door plaatsgerichte mutagenese. Deze wisselaars kunnen nu worden gekarakteriseerd.

Deze methode is gebaseerd op de cellulaire toxiciteit van intracellulaire protonen cellijnen die vesiculaire Na ⁺ / H ⁺ uitwisselaars zal drukken op de plasmamembraan selecteren. Het zou mogelijk zijn in principe and...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Standard cell culture apparatuur			Gebreikt voor H+ killing selectie, samengesteld uit vele apparaten met verschillende catalogusnummers
Incubator met CO2	Sanyo	MCO15A
Incubator zonder CO2	Heraeus instrument	BB6220
Laminair flow kap PSM1200NF	Fisher	52010120
DMEM medium	sigma	D5796
FBS gold	GE Healthcare	A15-151
Penicilline/streptomycine	PAA	P11-010
Trypsine 10x	PAA	L11-003
Atomaire Absorptie spectrometer met Zeeman oven systeem	Thermo Scientific	ICE 3500 GFZ
LiCl	sigma	L4408
Salpeterzuur	sigma	438073
Fluorescentie videomicroscopie set	Leica		Samengesteld uit vele apparaten met verschillende catalogusnummers
Omgekeerde geautomatiseerde microscoop	Leica	DMI6000B
microscoop stand	leica	11888906
		11888911
		11505180
		11888377
incidente fluorescentie	leica	11888901
		11504166
motorbeugel	leica	11888379
		11505234
		11521505
		11522106
LED transmissie licht	leica	8097321
		8102034
		11521580
gemotoriseerde plaat	leica	11522068
		11531172
		11521734
		11521719
		11888423
		11888424
camera uitvoer	leica	11888373
		11507807
		11888393
		11888259
		11888258
		11541510
beelden acquisitie/analyse software	leica	11888375
optics	leica	11506507
		11506243
		11506203
fluorescentie Xenon lamp	leica	DMI6000
camera	hamamatsu	8100601
metafluor/Mmfluor software		11640905
pH gevoelige sonde, BCECF-AM	life technologies	B1170
Nigericine	Sigma	N7143