Method Article

Toepassing van een High-throughput In Vitro Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

DOI:

10.3791/52467

⸱

December 1st, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Epidemiology, School of Public Health, The University of Michigan, 2Centre for Oral Health Research, School of Dental Sciences, Newcastle University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze methoden papier is het gebruik van een microfluïdische systeem te beschrijven voor de ontwikkeling van multi-species biofilms dat soort gewoonlijk geïdentificeerd in humaan supragingivale tandplaque bevatten. Methoden om biofilm architectuur, biofilm levensvatbaarheid, en een aanpak om te oogsten biofilm voor cultuur-afhankelijke of cultuur-onafhankelijke analyses zijn gemarkeerd beschrijven.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn weinig high-throughput in vitro systemen die de ontwikkeling van multi-species biofilms die talrijke soorten gewoonlijk binnen in vivo orale biofilms gedetecteerd bevatten vergemakkelijken. Bovendien is een systeem dat natuurlijk humaan speeksel gebruikt als voedingsbron in plaats van kunstmatige media, bijzonder gewenst om de expressie van cellulaire en biofilm specifieke eigenschappen die de in vivo nabootsen gemeenschappen ondersteunen. We beschrijven een werkwijze voor de ontwikkeling van multi-species orale biofilms die vergelijkbaar zijn wat betreft samenstelling species, tandplak supragingivale, onder omstandigheden vergelijkbaar met de menselijke mondholte. Concreet zal dit werkwijzen artikel wordt beschreven hoe een in de handel verkrijgbaar microfluïdische systeem kan worden aangepast aan de ontwikkeling van multi-species orale biofilms ontleend vergemakkelijken en gekweekt in samengevoegd speeksel. Bovendien kan een beschrijving van het systeem in combinatie met een confocal laser scanning microscoop 3-D reconstructies biofilm voor architecturale en levensvatbaarheid analyses genereren gepresenteerd. Gezien de grote diversiteit van micro-organismen die groeien binnen biofilms in de microfluïdische systeem (met inbegrip van Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, en Porphyromonas), zal een protocol worden gepresenteerd die beschrijven hoe de biofilm cellen te oogsten voor verdere subcultuur of DNA-extractie en analyse. De grenzen van zowel de microfluïdische biofilm systeem en de huidige state-of-the-art data analyses zullen worden aangepakt. Uiteindelijk wordt voorzien dat dit artikel een basislijn techniek die de studie van orale biofilms verbeteren en helpen bij de ontwikkeling van aanvullende technologieën die kunnen worden geïntegreerd met de microfluïdische platform ontstaat.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biofilms zijn architectonisch complex gemeenschappen van bacteriën die worden geaggregeerd op oppervlakken 1. Deze gemeenschappen bevatten doorgaans talrijke soorten die interageren met elkaar binnen de biofilm 2. Orale biofilms, de meest visueel opvallende zijn tandplaque, een aanhoudend probleem bij mensen en ongecontroleerd ontwikkeling resulteert in het genereren van taxonomisch diverse multispeciesvisserij gemeenschappen 3. De component bacteriën van deze verschillende gemeenschappen kan tot 1.000 keer meer resistent tegen antibiotica dan hun vrij zwevende (planktonische) tegenhangers 4-6. Het negeren van deze or....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het speeksel collectie protocol hierin beschreven werd beoordeeld door de Universiteit van Michigan Institutional Review Board for Human Onderwerp Research.
OPMERKING: Met betrekking tot de institutionele reviews voor menselijke subject werk van dit type, moet vooraf afspraken en machtigingen worden vergaard uit de gastinstelling. In het bijzonder, afhankelijk van de instelling, IRB of ethiek goedkeuring zou moeten worden gezocht en goedgekeurd voordat het speeksel collectie van menselijke vrijwilligers kunnen gaan. Als hulpmiddel bij het ​​opstellen van een aanvraag, kan een nuttige NIH algoritme / grafiek hier te vinden:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D-rendering van biofilms

Representatieve resultaten zijn getoond in figuur 3. Een nuttig instrument IMARIS software is de mogelijkheid om elk segment van de verzamelde biofilm stack onderzoeken en combineren driedimensionale reconstructies gemaakt. Bovendien kunnen kunstmatige schaduweffecten worden toegevoegd om visueel te interpreteren driedimensionale structuren. Het gesmolten biofilms kunnen gericht worden in elke richting met verschillende ver.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methoden paper belicht de fundamentele stappen die nodig zijn om te installeren en uitvoeren van een microfluïdische systeem op een manier te zorgen voor de ontwikkeling van mondelinge multi-species biofilms afgeleid van gepoolde humane speeksel en gekweekt in een filter gesteriliseerde 25% gepoold menselijk speeksel. Benaderingen van de biofilm kenmerken worden gegeven, maar het moet niet vergeten dat deze beschreven benaderingen aanpasbaar en aanvullende technologieën zoals, bijvoorbeeld, kunnen vlekken of labels.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A. H. R. and N.S.J. have received research awards from a variety of sources such as the National Institutes of Health (NIDCR), Colgate-Palmolive (Piscataway, NJ) and the Society for Applied Microbiology to fund research studies in their lab over the past five years. All other authors: none to declare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken William Nance (Universiteit van Michigan) voor hulp bij het formuleren van de biofilm groei protocollen en John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) voor advies met betrekking tot technologische kwesties met betrekking tot de Bioflux systeem. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 om AHR) en de Universiteit van Michigan start-up fondsen om AHR

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Falcon 50 ml Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-432-22
Falcon 15 ml Conical Centrifuge TubesFisher Scientific14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible)ThermoscientificUnit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor Thermoscientific28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized WaterThermo  Scientific Inc23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.VWR73520-986 
GlycerolThermo Fisher Scientific IncNC0542269
BioFlux microfluidic systemFluxionBioflux 200 system
Bioflux 24-channel plateFluxion910-0004
PBS (Gibco)Thermo Fisher Scientific Inc10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen) InvitrogenL7012
Confocal Laser Scanning MicroscopeLeciaSPE or eqivalent system
Epifluorescence MicroscopeMultiple choicesMultiple choices
Pyrosequencing facilitiesMultiple choicesMultiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol SolutionFisher Scientific04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80 °CMultiple choicesMultiple choices
Tips (20, 200, and 1,000 μl)Multiple choicesMultiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl)Multiple choicesMultiple choices
Software
Bioflux dedicated softwareBioflux
ImarisBitplane
Leica SPELeica
ImageJFreeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2Freeware (http://www.comstat.dk/)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
  2. Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
  3. Jakubovics, N. S., Kolenbrander,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oral BiofilmsMicrofluidic SystemHigh throughput In VitroMulti species BiofilmsConfocal MicroscopyBiofilm ArchitectureSaliva based MediaStreptococcus VeillonellaDNA Extraction AnalysisLive Dead Staining

Related Articles