Onderzoek van Rapid Dopamine Dynamics met Fast scan cyclische voltammetrie Tijdens intra-orale Tastant Administration in Awake Rats

Samenvatting

Snelle schommelingen in extracellulair dopamine (DA) bemiddelen zowel beloningsverwerking als gemotiveerd gedrag bij zoogdieren. Dit manuscript beschrijft het gecombineerde gebruik van snelle scancyclische voltammetrie (FSCV) en intra-orale toediening van smaakstoffen om te bepalen hoe smaakstoffen de snelle dopamine-afgifte bij wakkere, vrij bewegende ratten veranderen.

Samenvatting

Snelle, phasic dopamine (DA) release in de hersenen van zoogdieren speelt een cruciale rol in beloningsverwerking, leerversterking en motivationele controle. Fast scan cyclic voltammetry (FSCV) is een elektrochemische techniek met hoge ruimtelijke en temporele (sub-seconde) resolutie die is gebruikt om phasic DA release in verschillende soorten preparaties te onderzoeken. In vitro experimenten in enkele cellen en hersensneden en in vivo experimenten in verdoofde knaagdieren zijn gebruikt om mechanismen te identificeren die dopamine release en opname mediëren onder normale omstandigheden en in ziektemodellen. In de afgelopen 20 jaar hebben in vivo FSCV experimenten in wakkere, vrij bewegende knaagdieren ook inzicht geboden in dopaminerge mechanismen in beloningsverwerking en beloningsleren. Een groot voordeel van de wakkere, vrij bewegende voorbereiding is de mogelijkheid om snelle DA schommelingen te onderzoeken die tijdgebonden zijn aan specifieke gedragsgebeurtenissen of aan belonings- of cuepresentatie. Echter, een beperking van gecombineerde gedrags- en voltammetrie-experimenten is de moeilijkheid om DA effecten die specifiek zijn voor primaire belonende of aversieve stimuli te scheiden van mede-optredende DA schommelingen die beloningsgericht of ander motorisch gedrag mediëren. Hier beschrijven we een gecombineerde methode met in vivo FSCV en intra-orale infusie in een wakkere rat om DA reacties op orale smaken direct te onderzoeken. In deze experimenten worden orale smaken direct in de mondholte van de rat geïnfuseerd – waardoor beloningsgericht gedrag en vrijwillig drinkgedrag worden omzeild – waardoor een directe onderzoek van DA reacties op smaak stimuli mogelijk is.

Inleiding

Fasieke DA-afgifte speelt een belangrijke rol bij het mediëren van beloningsgericht gedrag ^[1-3]. Het is echter vaak ingewikkeld om te isoleren en te bestuderen hoe een primaire beloning de fasische DA-afgifte verandert, vanwege mede optredende gedrags- of cognitieve processen die ook in staat zijn om de fasische DA-afgifte te veranderen - zoals besluitvormingsprocessen of beloningsgericht motorisch gedrag om de beloning te verkrijgen. In het huidige werk isoleren we fasische DA-responsen op smaken door gebruik te maken van in vivo fast-scan cyclische voltammetrie (FSCV) gecombineerd met de afgifte van smaken via intraorale canules. Deze techniek omzeilt keuze en actie en stelt ons in staat om extracellulaire DA-afgifte te onderzoeken tijdens directe infusie van een smaakstof op het gehemelte van een rat.

FSCV is een elektrochemische techniek met hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor metingen van DA-afgifte in een discreet lokaal gebied (ongeveer 100 µm) mogelijk zijn op een schaal van minder dan een seconde (resolutie van 10 Hz). De combinatie van intra-orale afgifte en FSCV biedt het voordeel om snelle, 'real-time' DA-responsen op een smaakstof te observeren, wat niet kan worden onderzocht met conventionele microdialysemethoden. Bovendien vindt fasische DA-afgifte als reactie op beloningen of beloningsgerelateerde signalen plaats bij concentraties tussen de 20-100 nM, wat boven de 10-20 nM detectiedrempel voor FSCV ligt ^[4]. De hoge ruimtelijke resolutie van FSCV maakt ook opnames mogelijk van subregio's van kleine hersengebieden, zoals de kern van de nucleus accumbens (NAc). FSCV gecombineerd met intraorale infusies van smaken is dus een ideaal model voor het bestuderen van hoe smaken of andere stimuli de fasische DA-afgifte veranderen bij wakkere, gedragende dieren. Inderdaad hebben deze technieken experimenten mogelijk gemaakt die onderzoeken hoe belonende en aversieve smaken de extracellulaire DA-afgifte veranderen ^[5].

In het afgelopen decennium zijn FSCV-analyses met succes gecombineerd met intraveneuze toediening van geneesmiddelen ^[6] en ratten-zelftoedieningsparadigma's ^{[7, 8]} om de rol van fasische DA-mechanismen in drugsverslavingsmodellen te identificeren. Daarnaast is gecombineerde intraorale afgifte met FSCV gebruikt om te onderzoeken hoe smaaksignalen gekoppeld aan cocaïnebeschikbaarheid de fasische DA-afgifte en gedragsresponsen die emotionele affectie weerspiegelen, moduleren ^[3]. Deze gecombineerde intraorale en FSCV-methodologie kan ook krachtig worden gebruikt om fasische DA-responsen te onderzoeken op smaakstoffen, zoals menthol en orale zoetstoffen, die worden toegevoegd aan sigaretten en oplosbare tabaksproducten ^[9-11]. Hoewel veel van de smaakstoffen die aan tabaksproducten worden toegevoegd, appetitief zijn ^[9-11], is het onbekend of deze smaakstoffen de fasische DA-afgifte verhogen op een manier die consistent is met een belonende hedonische valentie. Inderdaad kunnen smaakstoffen die aan sigaretten en oplosbare tabaksproducten worden toegevoegd, directe effecten hebben op het DA-beloningssysteem en kunnen ze door middel van dopaminerge mechanismen inwerken op de belonende valentie van sigaretten en andere tabaksproducten. Intraorale afgifte gecombineerd met FSCV kan dus nieuw inzicht bieden in hoe smaakstoffen de snelle DA-afgifte moduleren. Het gebruik van gecombineerde intra-orale en in vivo FSCV-methodologie, en de gegevens verkregen uit dergelijke studies, kunnen ook toekomstige studies faciliteren om te bepalen hoe smaakstoffen en nicotine interageren om DA-signalering te veranderen en mogelijk nicotineversterking te moduleren. Verder kunnen de gegevens uit dergelijke studies worden gebruikt om regelgevende beslissingen over smaakstoffen in tabaksproducten te informeren.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de National Institutes of Health (NIH) Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Yale University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).

1) Pre-operatieve Voorbereidingen

1. Orale oplossing voorbereiding
   1. Maak oplossingen van 10% sucrose en 0,005% L-menthol in gedeïoniseerd water (pH 7,4). Bewaar deze oplossingen in gesloten containers, bij KT, en remake elke 2 weken, om degradatie te voorkomen.
2. Elektrode ijkoplossingen
   1. Maak Tris buffer (pH 7,4) op elk moment voorafgaand aan de kalibratie. De oplossing bestaat uit 12,0 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,20 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1,20 mM _MgCl2 en 2,00 mM Na ₂ SO _4.
   2. Maak een voorraad oplossing van 10 mM dopamine (DA; dopamine hydrochloride) in 0,1 M perchloorzuur. De perchloorzuur helpt oxidatie van dopamine voorkomene. Bewaar deze voorraad oplossing bij -20 ° C en gebruik voor maximaal 6 maanden. Maak verschillende fracties van de DA voorraad oplossing voor opslag voor elk monster slechts één keer gebruiken.
   3. Van de 10 mM stock DA, verdunde oplossingen in Tris-buffer met concentraties van 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62,5 nM, en 31,25 nM.
   4. Voor pH kalibratie, worden de oplossingen van Tris-buffer met pH van 7,2, 7,3, 7,5 en 7,6. Dit oplossingen pH verschuivingen die kunnen optreden tijdens het in vivo experiment nabootsen verschaffen.
3. Elektrode fabricage
   1. Door vacuüm zuigen, zuigen een T-650 carbon fiber (7 um diameter) in een borosilicaat glazen capillair (lengte 10 mm, buitendiameter 0,6 mm, binnendiameter 0,4 mm).
   2. Plaats glazen capillaire gevuld met koolstofvezel in een verticale elektrode puller. Voor initiële parameters, stelt u de kachel naar 55,0 en uitschakelen van de magneet. Echter, kan verdere optimalisatie nodig zijn dat enerzijds verwarming en magnetische instellingen variëren frOM lab tot lab.
      Opmerking: De elektrode dient tenminste 5,5 cm lang (met inbegrip tapsheid), zodat het gemakkelijk kan passen in de micromanipulator en toegevoegd ten minste 6,9 ​​mm onder dura in de rattenhersenen is. Indien de elektrode te kort zal opnames van ventrale gedeelte van de nucleus accumbens niet haalbaar. Anderzijds dient de totale lengte elektrode maximaal 6,5 cm anders te lang om te passen in de micromanipulator zijn.
   3. Met behulp van een lichtmicroscoop, snijd het blootgestelde koolstofvezel zodat deze zich 75-100 urn na afloop van het glas. Controleer of de elektrode heeft een zeer strakke, nauwelijks waarneembaar, afdichting tussen het glas elektrode en koolstofvezel, die minimale ruis zal produceren tijdens de daaropvolgende opname. Gooi de elektrode of er merkbare scheurtjes in het glas of de afdichting los, wat duidt op een slechte afdichting. Voor meer gedetailleerde instructies te zien [12] en [13].
4. Montage van de elektrode in de microfoonromanipulator
   1. Verkrijg een 3 in, 30G draad dat is geïsoleerd over de halve lengte van de draad en gebruik een borsteltje een dunne laag zilver verf rechtstreeks op de draad. Direct na het aanbrengen zilververf, steek de draad in het gat op de top van de elektrode naar een fysieke en elektrische verbinding met de koolstof vezel. Onder een microscoop voor dat de zilverdraad contact maakt met de koolstofvezel.
   2. Bevestig de zilveren draad en de elektrode aan de micromanipulator met behulp van warmte krimpen.
   3. Plaats de bereide koolstofvezel elektrode in gezuiverd isopropylalcohol (IPA) gedurende ten minste 10 min aan het elektrodeoppervlak reinigen en latere gevoeligheid voor dopamine verhogen. Na weken in IPA, spoel de koolstofvezel met leidingwater om de IPA te verwijderen.
5. Referentie-elektrode fabricage
   1. Neem een ​​13 mm zilverdraad met een ongeveer 6 mm Ag / Ag Cl mesh (7 mm zilverdraad alleen, 6 mm mesh, een diameter van 0,4 mm),snijd het zilver gedeelte tot ca. de helft van zijn oorspronkelijke lengte en soldeer de zilveren gedeelte van de draad aan een gouden pin.
   2. Breng epoxy over het soldeer op de pen.
   3. Dompel de Ag / Ag Cl gaas uiteinde in een 5% copolymeer van polytetrafluorethyleen en perfluor-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonzuur 5 maal, met 30 min perioden luchtdrogen tussen de dip.
   4. Laat de coating Ag / Ag Cl mesh aan de lucht drogen O / N.
   5. Behandeling in een oven bij 120 * C gedurende 1 uur.

2) Gecombineerde Intraoral Chirurgie en Intracranial Canulatie Surgery (Ongeveer 75 min)

1. Oral katheter fabricage
   1. Maak de orale catheter en steriliseer ethyleenoxide sterilisatie, ten minste 10 dagen voorafgaand aan de operatie.
   2. Snijd PE 100 slang in 6 cm lang segmenten.
   3. Een soldeerbout smelten ene uiteinde van de PE buis en direct drukken tegen een vast oppervlak om de PE buis afkoelen. Het resultaat moet makenEen kleine, platte schijf aan één uiteinde van de PE buis en mag niet worden geflensd. Gebruik een naald (18 G) of duw pin om een ​​gat in het midden van deze schijf te creëren.
   4. Aan het andere uiteinde van de PE buis, stevig plaatst het stompe uiteinde van een 18 G naald in de buis.
   5. Met een standaardpapier perforator punch verscheidene cirkelvormige stukken van een plaat polytetrafluorethyleen (3,18 mm dikte, 6 mm in diameter) met polytetrafluorethyleen ringen maken.
   6. Een gat in het midden van de ring. Neem de naald bevestigd aan de PE-buizen en duw het door de wasmachine. Zodra de naald door en schuift de ring aan de onderzijde van de PE buis zodat deze strak tegen de ring.
2. Kaakchirurgie
   1. Na het steriliseren van de chirurgische instrumenten canule (bijgesneden tot 2,5 mm onder het voetstuk vóór sterilisatie), en referentie-elektrode, verdoven de rat met een intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg).
      1. After 5 min, breng dan een schadelijke stimulus proef (voet of staartknijptest) om het niveau van anesthesie beoordelen. Als het onderwerp toont een fysieke reactie op de schadelijke stimulus-test (terugdeinzen reactie, verhoging van de luchtwegen of de hartslag), het beheer van een ketamine boost van 10% tot 15% van de oorspronkelijke dosis en herhaal de schadelijke stimulus protocol boven.
   2. Nadat de rat volledig verdoofd en vertoont geen reactie op de schadelijke stimulus test gebruikt dierlijk tondeuse bont van de rat scheren van de ogen tot ongeveer 2 mm achter de oren. Plaats de rat op een dunne water recirculatie verwarming pad om de lichaamstemperatuur tijdens de operatie te handhaven. Breng eye smeermiddel. Dien de niet-steroïdale anti-inflammatoire (NSAID) drugs, Carprofen (5 mg / kg), door intraperitoneale injectie Vóór alle insnijdingen en voorafgaand aan het inbrengen intraorale canules. Gebruik aseptische techniek te allen tijde.
   3. Breng betadine gevolgd door 70% ethanol om de huid te reinigen. Herhaal dit 3 keer.
   4. Place de rat op zijn rug, en de monding met een steriel wattenstaafje openen. Vind de eerste bovenste molaar.
   5. Steek de naald in het weefsel tussen de wang en de eerste bovenste molaire totdat de naald verlaat net achter en mediaal van de oren.
   6. Prik de naald door de huid tot aan de PE-slang verlaat de huid en is toegankelijk.
   7. Trek de canule (aangrijpend door de canule zelf en niet de naald) en zet de polytetrafluorethyleen wasmachine in de kiezen, zodat de katheter op zijn plaats blijft.
      Let op: Het snijden van de ring in een trapezium vorm en het veiligstellen van het tegen de kiezen met de platte kant naar de wang maakt deze stap gemakkelijker.
   8. Neem een ​​andere polytetrafluorethyleen wasmachine en schuif deze over de blootliggende naald, een daling van de kunststof buizen en aanliggen tegen de incisie.
   9. Om de polytetrafluorethyleen wasmachine te beveiligen, gebruiken gesteriliseerd band naar een driehoekige "vlag" te creëren, zodat de wasmachine niet omhoog schuiven. Bevestig het wassener tegen de huid van de rat en de gesteriliseerde tape.
   10. Snijd de blootgestelde katheter om 2-4 cm van de slang boven het hoofd van de rat wordt blootgesteld.
   11. Herhaal stap 2.2.1 tot 2.2.10 voor de andere kant van de mond.
3. Intracraniële chirurgie voor voltametrie
   1. Plaats de rat in de stereotaxische frame en reinigen de hoofdhuid van het dier met behulp van een tweetraps scrub (een betadine scrub, gevolgd door een 70% ethanol scrub, uit te voeren met een 3-cyclus herhaling).
   2. Gebruik gesteriliseerde naald neus pincet en chirurgische schaar een sectie 15 x 15 mm van de hoofdhuid weefsel weg te snijden.
   3. Reinig het oppervlak van de schedel met behulp van gesteriliseerde katoen tip applicators. Verder reinigen de schedel door toepassing 2-3 druppels van 3% waterstofperoxide.
   4. Gebruik een stereotaxisch boor 3 kleine (1 mm diameter) gaten in de schedel voor daaropvolgende inbrengen van schroeven, 1 gat voor de gids canule, 1 gat voor de stimulerende elektrode en 1 gat voor de verwijzing uitverkorenen makenreed.
   5. Voor opnames in de NAc kern, de positie van de gids canule op 1,2 mm anterior en 1,4 mm lateraal van Bregma. Laat de canule apparaat totdat de plastic basis is gelijk met de schedel.
   6. Plaats de gesteriliseerde referentie-elektrode in de contralaterale hemisfeer naar de gids canule. Verlaag de verwijzing van ongeveer 2 mm onder de dura.
   7. Plaats de stimulerende elektrode van 5,2 mm posterior en 1,0 mm lateraal van Bregma en neergelaten 8,0 mm onder dura het ventrale tegmentale gebied (VTA) te verkrijgen.
   8. Gebruik een gesteriliseerde kleine chirurgische schroevendraaier om de schroeven vast aan de schedel. Steek dan de referentie-elektrode, het stimuleren van de elektrode, en begeleiden canule. Tot slot, veilige opslag van alle onderdelen met behulp van cranioplastic cement.
   9. Voor de eerste 48 uur post-operatieve zorg, bestuurt de niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel (NSAID) Carprofen door subcutane injectie (5 mg / kg). Laat minstens 1 week voor de volledige chirurgische herstel voorafgaand aan het uitvoeren voltammetry opname.
      1. Tijdens de post-operatieve zorg, flush orale catheters dagelijks met water. Zorgen voor voedsel verzadigd in water voor 2 dagen om het dier te helpen bij het kauwen en eten. Voorzie dagelijkse controle op mogelijke tekenen van stress pijn (door milde infectie of dehydratie) en passende maatregelen indien nodig (inclusief toediening van fluïda, topische toediening van antiseptica en of NSAID Carprofen toediening van 5 mg / kg).

3) Voltammetrische Recordings in Awake, vrij bewegende rat

1. Het verlagen van de elektrode en het verwerven van een DA training set.
   1. Op de dag van het experiment, check de doorgankelijkheid van de mondelinge canule door het inbrengen van 200 ul water en observeren orofaciale reacties (om te controleren of de rat proeft het water).
   2. Bevestig de FSCV headstage aan de rat door het invoegen van de stimulerende elektrode (aan de headstage) in de bipolaire stimulerende elektrode cannula (de rat). Zo is de headstage (geminiaturiseerde stroom-spanningsomzetter) meteen contact met het bipolaire stimulerende elektrode.
   3. Verwijder de dummy canule de canule inrichting en twee druppels 50% heparineoplossing toepassing in de canule. Vervolgens plaatst voorzichtig een dummy canule (iets langer de dummy canule die eerder werd verwijderd) geven bloedstolsels of gliale littekenvorming die heeft plaatsgevonden, waarbij carbon fiber elektroden die vervolgens tijdens het experiment wordt ingevoegd breken duidelijk. Verleng de canule voor het opruimen stolsels 3-4 mm onder de schedel (minimaal 2 mm boven de opname site).
   4. Plaats de micromanipulator, met een elektrode in de gids canule en plaats de omega-ring in een "gesloten" stand.
   5. Sluit de referentie-elektrode draad van de headstage naar de juiste pin. Sluit vervolgens de werkende elektrode draad van de micromanipulator naar de juiste draad op de headstage.
   6. Laat de elecvertrad tot ongeveer 4-4,5 mm onder de schedel.
   7. Gebruik een potentiostaat een driehoekige golfvorm (400 V / s, -0,4 tot 1,3 V) toegepast. Breng de golfvorm aan de elektrode bij 60 Hz gedurende tenminste 10 minuten, wijzig de golfvorm toepassingsfrequentie tot 10 Hz voor daaropvolgende experimentele opnamen.
      Opmerking: De 60 Hz golfvorm applicatie stap produceert een stabiele koolstofvezel oppervlak en zal helpen voorkomen dat elektrische drift
   8. Breng elektrische stimulatie van de VTA gebruik van eigen frequenties (10-60 Hz) pulsen (10-30 pulsen) en stromen (50 tot 150 uA) allemaal met een pulsduur van 2 ms / fase verschillende concentraties DA afgifte en pH roepen verschuivingen. Verwerven ten minste 5 verschillende concentraties van DA vrijkomen en 5 verschillende pH verschuivingen. Wait (2-3 min minimum) tussen prikkels om voor vesiculaire herladen [14].
      Opmerking: Het is belangrijk om prikkels die DA concentraties over het gehele bereik dat tijdens de volgende zal worden verzameld produceren verkrijgenexperiment, omdat ze zullen worden gebruikt als een training set voor Principal Component Analysis (zie paragraaf 5.1).
   9. Laat de elektrode in de NAc kern (6.3 mm ventraal Dura). Vervolgens laat de elektrode in stappen van 100 um in de kern tot NAc DA afgifte voorbijgaande verschijnselen vertoont bij een frequentie van ten minste 1 per minuut.
   10. Sluit de slang (inwendige diameter 1/32 ", buitendiameter 3/32") om een ​​20 ml injectiespuit bevestigd aan een spuitpomp. Aan het andere uiteinde van de buis, gebruikt een afgeschuinde 23 G naald om de buis verbinden met canule van de rat. Zorg ervoor dat de slang volledig gevuld is met de gewenste tastant en controleer dat er geen luchtbellen aanwezig in de slang.
       Opmerking: Meestal toedienen van een kleine hoeveelheid tastant in de mond van de rat voorafgaand aan het opnemen zodat de eerste infusie opnemen geeft de volledige infusie bedrag en geen resterend water of lucht in de slang. Bovendien, dit maakt het dier tevoren enige ervaring hebben with de tastant sinds roman tastants, zelfs appetitive degenen, kan aversieve in eerste instantie te wijten zijn aan de nieuwigheid.
   11. Voor het verzamelen van gegevens, bezielen 200 ul tastant (6,5 sec met behulp van een pomp en eerder beschreven buizen). Infundeer de tastant om de 1-3 min. Infundeer een totaal van 25 keer per tastant. Elke infusie levert 200 ul oplossing.
   12. Als er meerdere tastants worden geleverd in een enkel experiment, spoelt de mondelinge katheter met water na het verzamelen van gegevens voor één tastant en wacht minstens 20 minuten voor het inbrengen van de nieuwe tastant.
   13. Na de DA opnamesessie, voor te bereiden op histologische verificatie door het creëren van een klein letsel aan de opname plaats. Om de carbon fiber elektrode voor volgende kalibratie te behouden, de eerste trek de elektrode en verwijder de micromanipulator. Maak dan gebruik van een nieuw micromanipulator met een glas micro-elektrode en een wolfraam draad (uitbreiding van 100 micrometer voorbij het glas tip) naar dezelfde diepte (onder dura) als de originele carbon fIber micro-elektrode.
   14. Voor histologische verificatie maakt een laesie door toepassing van 3 V in de wolfraamdraad en het verhogen van de spanning in stappen van 1 V, elke 10 seconden totdat de instelling 10 V bereikt.
   15. Als een standaard concentratie curve al is gemaakt met behulp van meerdere koolstofvezel-elektroden, het uitvoeren van de laesie stap boven (3.1.14) met toepassing van de potentiële direct de carbon fiber elektrode.
       Opmerking: Deze laesie methode koolstofvezel aantasten en verhindert verdere kalibratie met die specifieke elektrode.
   16. Euthanaseren het dier met een letale injectie pentobarbital (150 mg / kg, ip).
   17. Verjagen de headcap met de canules met een tang door direct omhoog te trekken op de headcap. Niet draai de headcap aangezien dit onnodige schade aan de hersenen veroorzaken en maakt het een uitdaging om de locatie van de elektrode te identificeren tijdens histologie.
       1. Verwijder de hersenen en plaats in 4% formaline gedurende 3 dagen gevolgd door 30% suCROSE voor 1 week. Maak 30 urn plakjes met behulp van een cryostaat, te monteren op dekglaasjes en onderzocht segmenten onder een lichtmicroscoop om de locatie van de koolstofvezel of wolfraam laesie te identificeren.
          Opmerking: perfusie is optioneel voor 3.1.17.

4) elektrode kalibratie

1. De stroomcel een actuele concentratie conversiefactor maken.
   1. Om elektrode gevoeligheid bepalen kalibreren elektroden na elk experiment met een flow "T-cell" -apparaat. Laat de elektrode in de "t-cell" tijdens Tris buffer, pH oplossingen of DA oplossingen overspoelde het elektrodeoppervlak (met een snelheid van 2 ml / min). Gebruik zes posities luchtsolenoïde aandrijving heen en weer schakelen tussen de buffer en pH of DA oplossing.
   2. Voor elke kalibratie, verzamelen voltammetrische data gedurende 5 sec toepassing van Tris buffer (baseline), gevolgd door 5 sec toepassing van pH of DA-oplossing, gevolgd door 20 sec eenOEPASSING Tris buffer (30 sec totale bestand). Herhaal elke run 3 keer voor elke kalibratie standaard concentratie, tegenwicht tussen de verschillende concentraties van elke norm.
   3. Voor elk monster collectie, meet de piek DA of-pH opgewekte stroom. Het gemiddelde van de piekstroom over elke proef om een ​​concentratie versus piekstroom relatie te verkrijgen. Voor meer gedetailleerde instructies te zien [12] en [13].

5) Data Analysis

1. Met behulp van een training in principal component analyse (PCA)
   Opmerking: Bij een voltammetrie experiment, wordt als output stroom, die het gevolg is van dopamine oxidatie en reductie, pH verschuivingen en elektrochemische ruis. PCA maakt scheiding van deze factoren zodat men de gewenste componenten (DA en pH) kunnen isoleren en andere componenten die de gewenste signalen zouden kunnen vervalsen (voor een nadere beschrijving zie ^{15, 16).}
   1. Wijs een kalibratiefactor aan The uitgangsstroom (ongeveer 5-10 nA / gM) na PCA om concentraties van de analyten te bepalen.
   2. Gebruik de training set verkregen tijdens een experiment om te "trainen" de PSO model te scheiden DA, pH, en andere factoren. PCA is van vastgestelde cyclische voltammogrammen training (in paragraaf 3.1.8 ingezameld) en bepaalt welke essentiële kenmerken van het voltammogram kan worden gebruikt om elke tijdens de in vivo voltammetrie opnames verzameld analyt identificeren.
   3. Om het aantal van de belangrijkste componenten te blijven bepalen, gebruik dan een Malinowski F-toets. Gewoonlijk houdt slechts 2 of 3 hoofdcomponenten die normaal vertellen over 95-99% van de variantie in de data. Voor verdere discussie over de uitvoering van de Malinowski F-test, zie ^17.
      Opmerking: Zodra het aantal componenten bepaald, de PCA analyse daadwerkelijk zal de gemeten voltammogrammen projecteren van DA en pH training stelt op de belangrijkste componenten die zijn behouden.Het resultaat is een dataset die is gefilterd zodat alleen DA (of pH) gegevens blijven en de overgebleven data die niet lijken DA of pH wordt verwijderd (zie Representatieve resultaten voor de verwachte productie). Voor een verdere gedetailleerde uitleg en stapsgewijze instructies voor het gebruik van PCA voor voltammetrische analyse zien Materials blad en ^{16, 17.}

Resultaten

FSCV gecombineerd met intra-orale katheter implantatie werd gebruikt om te onderzoeken hoe sucrose, een appetitive tastant, moduleert fasische DA release in de NAc kern. Vóór tastant infusie elektrische stimulatie (150 uA, 60 Hz, 24 pulsen, aangeduid met het rode balk) van het VTA produceert sterke toename driefase DA afgifte in de NAc (figuur 1) Figuur 1 toont een kleurenplot met potentiaal op. de y-as de tijd op de x-as en stroom (weergegeven als valse kleur) op de z-as. Onder de kleur plot is DA conc...

Discussie

Intraorale tastant levering gecombineerd met FSCV maakt analyse van de "real-time" DA reacties op orale smaakstoffen. Er zijn drie belangrijke stappen in het protocol die zijn vereist voor succesvolle DA metingen. Ten eerste goede implantatie van de orale katheter kritisch voor afgifte van smaakstoffen. Ervoor zorgen dat de katheter achter de eerste kies is geplaatst en ingeklemd in plaats voorkomt dat de catheter verliest doorgankelijkheid en voorkomt onbedoelde verwijdering door het dier. Spoelen van de kath...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Stimulating electrode	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	bij het bestellen, vraag om een 22 mm snede onder het voetstuk
Cannula voor elektrode	BioAnalytical Systems	MD-2251
Glazen capillair	A-M systems	624503
Koolstofvezel	Thornel	T650
Elektrodetrekker	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	DS4
Heat shrink	3M	FP-301
Geïsoleerde draden voor elektroden	Squires electronics	Aangepast	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
Epoxy	ITW Devcon	14250	"5 minute epoxy"
Copolymeer van perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octeen-sulfonzuur en tetrafluorethyleen	Ion Power	LQ-1105	d.w.z., Nafion
Zilververf	GC Electronics	22-023
Voeding	BK Precision	9110
Buis voor intra-orale katheters	Intramedic	427426	PE 100, I.D. = 0,86 mm; O.D. = 1,52 mm
Buis voor intra-orale infusie	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Spuitpomp voor flow cell	Pump Systems Inc.	NE 1000
Chirurgisch cement	Dentsply Caulk	675571 en 675572
Luchtactuator	VICI	A60	6 positie digitale klepinterface
Digitale klepinterface	VICI	DVI	230 VAC
Quad hoofdtrap	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI voeding	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI breakout box	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Voeding voor tastant spuitpomp	Med Associates	SG-504
Tastant spuitpomp	Med Associates	PHM-107
Wolfraam microelektrode	MicroProbes	WE30030.5A3
Zilverdraad referentie met AgCl	InVivo Metric	E255A
Sucrose	Sigma	80497
Magnesiumchloride	Sigma	M8266
Natriumchloride	Sigma	S7653
Perchloorzuur	Sigma	244252
Zoutzuur (4 M)	Sigma	54435
Natriumhydroxide	Sigma	306576
Waterstofperoxide	Sigma	H1009
Dopaminehydrochloride	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	University of North Carolina-Chapel Hill		Software aanvragen: klik hier voor link naar software aanvraagpagina