High Precision zink isotoopmetingen Toegepast op Mouse Organs

Samenvatting

We presenteren de techniek om met hoge precisie zink-isotoopverhoudingen in muizenorganen te meten.

Samenvatting

We presenteren een procedure om te meten met een hoge precisie zink isotopenverhoudingen in muis organen. Zinc bestaat uit 5 stabiele isotopen ⁽⁶⁴ Zn, ⁶⁶ Zn, ⁶⁷ Zn, ⁶⁸ Zn en ⁷⁰ Zn) die natuurlijk gefractioneerd tussen muis organen. We tonen eerst hoe de verschillende organen te lossen teneinde de Zn atomen vrij; Deze stap wordt uitgevoerd door een mengsel van HNO ₃ en H ₂ O _2. Vervolgens zuiveren de zinkatomen van alle andere elementen, met name van isobare interferenties (bijvoorbeeld Ni) door anion-uitwisselingschromatografie in een verdunde HBr / HNO ₃ medium. Deze eerste twee stappen worden uitgevoerd in een schone laboratorium met behulp van zeer zuivere chemicaliën. Tenslotte worden de isotoop verhoudingen gemeten met een multi-collector inductief gekoppeld plasma massa spectrometer, in lage resolutie. De monsters worden geïnjecteerd met een sproeikamer en isotopische fractionering geïnduceerd door de massaspectrometer is correctieted door vergelijking van de verhouding van de monsters aan het formaat van een standaard (standaard bracketing techniek). Deze volledige typische procedure produceert een isotoop verhouding met een 50 ppm (2 sd) reproduceerbaarheid.

Inleiding

De meting van hoge precisie (meer dan 100 ppm / atomaire massa-eenheid) zink stabiele isotopensamenstelling alleen mogelijk gedurende ongeveer 15 jaar door de ontwikkeling van multi-collector plasma-source massaspectrometers en is sindsdien vooral toegepast in Earth en planetaire wetenschappen. De toepassingen op medisch gebied zijn nieuw en bezitten een groot potentieel als biomarkers voor ziekten die het metabolisme van zink (bijvoorbeeld ziekte van Alzheimer) te wijzigen. Dit artikel meldt een methode voor het meten met een hoge precisie de natuurlijke stabiele isotoop verhoudingen van zink in verschillende muis organen. Hetzelfde zou gelden voor menselijke monsters. De werkwijze omvat het oplossen van de organen, de chemische zuivering van zink uit de rest van de atomen en de analyse van de isotopenverhouding een massaspectrometer.

De kwaliteit van Zn isotoopmetingen is afhankelijk van de kwaliteit van de chemische zuivering (zuiverheid Zn, lage lege compingared de hoeveelheid Zn in het monster, hoge chemische opbrengst van de procedure) en de controle van de instrumentele voorspanning. De hoge zuiverheid van het uiteindelijke Zn fractie zijn nodig om isobare interferenties als niet-isobare interferentie die een matrix effect te verwijderen. Isobaric nucliden creëren directe storingen (bv ⁶⁴ Ni). Non-isobare interferenties genereren zogenaamde "matrix" effect en pas analytische nauwkeurigheid van de metingen door het veranderen van de toestand van de ionisatie in vergelijking met de zuiver zink standaard waaraan de monsters worden vergeleken met ^1. Een lage blank (<10 ng) aan dat er geen contaminatie van monsters door externe Zn dat doen neigen de gemeten isotopensamenstelling. Aangezien Zn isotopen tijdens ionenwisselingschromatografie ² kan worden gefractioneerd, het verzamelen van de Zn atomen wordt voorkomen dat isotopische fractionering optreedt, hetgeen inhoudt dat de chemische procedure een volledige opbrengst moeten. Tenslotte wordt de correctie van de instrumentele isotopenfractionatie tijdens de massaspectrometrie meting uitgevoerd via de "standaard bracketingprogramma" methode.

Daarom is de belangrijkste problemen bij het ​​verkrijgen nauwkeurige metingen bestuurt de uitwendige besmetting (bijv laag spatie), waardoor een volledige opbrengst chemische zuivering die vrij van andere atomen of moleculen, en tegen de instrumentele isotopische fractionering op de massaspectrometer. In dit document zullen we ons analyseprotocol beschrijven Zn scheiden van de muis organen en de massa-spectrometrie metingen.

De extractie wordt gedaan met behulp van een lage hoeveelheid verdunde zuren (HBr / HNO ₃ media) op micro-kolommen (0,5 pi en 0,1 pl) van anionenwisselingshars. Het heeft een volledige opbrengst en de metingen extern reproduceerbaarheid beter dan 50 ppm op ⁶⁶ Zn / Zn ⁶⁴ verhouding. Een ander voordeel van het method is dat het zeer snel. De werkwijze is dus zeer goed aangepast aan de medische wetenschappen, waarbij men moet een groot aantal monsters in vergelijking met geosciences, wanneer deze analytische methoden ontwikkeld analyseren.

Protocol

OPMERKING: procedures waarbij dieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Université Paris Diderot.

1. Voorbereiding van Materialen

1. Sub-kook destilleren 1 L van de zuren _(HNO3, HBr) om ze te zuiveren van verontreinigingen.
2. Reinig de bekers en tip adapter in een hete (~ 100 ° C) geconcentreerd HNO ₃ zuurbad ten minste twee dagen.
3. Was de pipetpunten in een koude 3 N HNO ₃ bath enkele dagen en spoel individueel driemaal met gedeïoniseerd water.

2. Monstervoorbereiding

1. Verdoven de muizen door intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine. Beoordelen verdoving door de teen knijpen methode.
2. Verzamel het bloed door een cardiale punctuur in de aanwezigheid van heparine in 1,5 ml buizen.
3. Scheid het plasma van bloedcellen door centrifugeren (10 min, 1500 x g) en giet het plasma polypropyleen cryogenic flacons met polypropyleen tips.
4. Verwijder de resterende bloed van organen door het snijden van de leverader en het injecteren van DPBS door het hart. Beoordelen van de dood van de muis door cervicale dislocatie.
5. Oogst de organen met steriele roestvrijstalen instrumenten, hen te bevrijden van de omliggende vet indien aanwezig, en snap-vries ze in polypropyleen cryogene flesjes.

3. Chemische Zuivering

1. Eerst Los de monsters in een mengsel van ~ 1 ml geconcentreerde (30%) H ₂ O ₂ en ~ 1 ml geconcentreerde (~ 15 M) HNO _3. Doe al deze stappen in een zuurkast.
   1. Plaats het gehele orgaan van belang in een 15 ml Teflon beker. Voeg vervolgens de H ₂ O ₂ / _HNO3 aan de beker ^5. Houd het bekerglas geopend gedurende enkele minuten om spatten als gevolg van de reactie van de oxidatie van de organische stof en de afgifte van CO ₂ voorkomen.
   2. Tot slot zet de beker op een hete plaat bij about 100 ° C gedurende enkele uren of totdat de oplossing helder is.
2. Open het bekerglas en drogen van de oplossing op een hete plaat bij ongeveer 100 ° C.
3. Zodra het monster droog is, voeg 1 ml van 1,5 N HBr om de monsters; Sluit het bekerglas en laten smelten op een hete plaat bij 100 ° C gedurende enkele uren.
4. Ondertussen bereidt de 500 pi kolommen.
   1. Voeg 500 ul van de AG1X8 200-400 mesh hars om de kolom en zet het op de kolom rek met een prullenbak beker eronder. Was de hars door afwisselende: 5 ml van 18,2 MQ ⋅ cm water, 5 ml 0,5 N HNO _3, 5 ml water, 5 ml 0,5 N HNO _3, en 5 ml water. Conditioneer de hars met 5 ml van 1,5 N HBr.
5. Verwijder de bekers uit de hete plaat en leg ze in een ultrasoon bad voor ongeveer 30 minuten, en laat de bekers afkoelen tot kamertemperatuur.
6. Zodra de beker wordt gekoeld en de hars wordt gewassen, opent de beker. Zet de tip adapter aan tHij spuit, voeg een pipet tip; pipet de 1 ml van het monster en te laden op de hars (heel langzaam om de hars niet te ageren).
7. Nadat alle vloeistof door de kolom, voeg 5 ml van 1,5 N HBr.
8. Zodra de 5 ml van 1,5 N HBr pass kolom vervangt de prullenbak bekerglas met een schone beker 15 ml.
9. Voeg 5 ml 0,5 N HNO ₃ 2,5 ml per keer. In dit stadium Zn wordt uit de hars geëlueerd.
10. Zodra 5 ml van HNO ₃ gaat door de kolom, verwijder de beker en plaats het op een hete plaat bij 100 ° C tot gedroogd.
11. Verwijder de kolom uit de kolom houder; trash de hars (gebruik een nieuwe hars voor elk monster).
12. Zodra het monster droog is, herhaalt het protocol met hetzelfde volume van zuren op een kleinere kolom (100 pi) en plaats het op een hete plaat tot gedroogd. Het monster is nu klaar voor de massa-spectrometrie.

4. Massa-spectrometrie Measurement

1. Analyseer de Zn isotopen compositie op een multi-collector inductief gekoppeld plasma massaspectrometer (MC-ICP-MS).
   1. Gebruik de machineparameters samengevat in tabel 1.
2. Plaats de Faraday cups te verzamelen aan massa (m / z) van ⁶² Ni, ⁶³ Cu, ⁶⁴ Zn, ⁶⁵ Cu, ⁶⁶ Zn, ⁶⁷ Zn en ⁶⁸ Zn.
3. Bereid een oplossing met 500 ppb Zn in 0,1 M HNO ₃ voor isotoopanalyse.
4. Analyseer de 500 ppb oplossing van Zn door opgespoten chamber met 100 pl / min teflon vernevelaar. Voor elk monster, gemeten 30 scans (1 blok 30 cycli) waarbij de integratietijd van elke scan is 8,389 sec.
5. Corrigeer de achtergrond door het aftrekken van de on-peak zero intensiteiten van een blanco-oplossing (de 0,1 M HNO ₃ oplossing die wordt gebruikt om opnieuw ontbinding van de monsters).
6. Controle en correct mogelijke ⁶⁴ Ni isobare interferentie door meting van de intensiteit van de ⁶² Ni piek.Neem aan dat de ⁶⁴ Ni / ⁶² Ni-verhouding is natuurlijk (0,2548), juist deze waarde van het instrumentale massa bias, en verwijder vervolgens de ⁶⁴ Ni op de massa 64 als:
   ⁶⁴ Zn _echte = ⁶⁴ Zn _gemeten - ⁶⁴ Ni = ⁶⁴ Zn _gemeten - ⁽⁶⁴ Ni / ⁶² Ni) _natuurlijke x ⁶² Ni _gemeten.
7. Corrigeer de instrumentale massa vertekening door bracketing elk van de monsters met een 500 ppb standaard oplossing van het JMC Lyon Zn-standaard (of een andere beschikbare standaard, zoals IRMM-3702). Voer de standaard bracketing door ⁶⁶ Zn / Zn ⁶⁴ verhouding van het monster te delen door het gemiddelde van de ⁶⁶ Zn / Zn ⁶⁴ verhouding van de twee standaarden gemeten voor en nadat het monster minus 1 en vermenigvuldigd met 1000 (zie vergelijking 1). Typische externe precisie op de JMC Lyon Zn standaard 0.05 permil / amu (2 standaarddeviatie, 2 sd).

Resultaten

In 1,5 N HBr, voornamelijk zink species (ZnBr3-) vormen sterke complexen met het anion-uitwisselende hars, terwijl de meeste andere elementen geen interactie met de hars. Zink wordt vervolgens hersteld door het medium verdunde _HNO3, veranderen de speciatie van Zn Zn ²⁺ dat vrijkomt uit de hars ^6,7.

Isotopenverhoudingen zijn meestal uitgedrukt in delen per 1.000 afwijkingen ten opzichte van een standaard:

Discussie

De reproduceerbaarheid van de metingen wordt geëvalueerd door middel gerepliceerd analyses van dezelfde monsters tijdens verschillende analytische sessies uitgevoerd. Zo ^6, hebben we dezelfde aardse steen 7 keer herhaald en worden de resultaten weergegeven in tabel 2 verkregen.

Zoals verwacht van de theorie van de isotopische fractionering ¹⁰ en zoals gemeten in elk zonnestelsel materiaal tot nu toe (bijv meteoriet ^11-13, planten

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Multi-collectie inductief gekoppelde plasma massaspectrometer	Thermo-Fisher
Anionenuitwisselingshars AG1 X8 200-400	Bio-Rad	140-1443-MSDS
Teflon bekers	Savillex	200-015-12
In eigen huis gemaakte teflon kolommen gemaakt met krimpbaar teflon