Methodenartikel

Eiwitzuivering Techniek dat Detectie van sumoylation en Ubiquitinering van Budding gist kinetochoor Eiwitten Ndc10 en Ndc80 Maakt

DOI:

10.3791/52482

⸱

3 mei 2015

 ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institute of Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript beschrijft de detectie van sumoylation en ubiquitinering van kinetochoor eiwitten, Ndc10 en Ndc80, in de gist Saccharomyces cerevisiae.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Post-translationele modificaties (PTM), zoals fosforylering, methylering, acetylering, ubiquitinatie en sumoylation, regelen de cellulaire functie van verschillende proteïnen. PTMs van kinetochore eiwitten die associëren met centromere DNA bemiddelen trouw chromosoom segregatie naar genoom stabiliteit te handhaven. Biochemische benaderingen zoals massaspectrometrie en Western blot-analyse worden meestal gebruikt voor de identificatie van PTMs. Hier wordt een eiwitzuivering werkwijze beschreven die de detectie van zowel sumoylation en ubiquitinering van het kinetochore eiwitten, Ndc10 en Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae toelaat. Een stam die uitdrukt polyhistidine-Flag-gelabeld Smt3 (HF-Smt3) en Myc-gelabeld Ndc10 of Ndc80 werd gebouwd en gebruikt voor onze studies. Voor detectie van sumoylation, we bedacht een protocol om affiniteit te zuiveren His-tag sumoylated eiwitten met behulp van nikkel kralen en gebruikt western blot analyse met anti-Myc antilichaam aan sumoylated Ndc10 een detecterennd Ndc80. Voor detectie van ubiquitinatie, ontwierpen we een protocol voor immunoprecipitatie van Myc-tagged eiwitten en gebruikt western blot-analyse met anti-Ub-antilichaam aan te tonen dat Ndc10 en Ndc80 worden ubiquitinated. Onze resultaten tonen dat epitoop-gelabeld eiwit van belang in de His-vlag hebben Smt3 stam vergemakkelijkt de detectie van meerdere PTMs. Toekomstige studies moeten toelaten benutting van deze techniek eiwit interacties die afhankelijk zijn van een specifieke PTM identificeren en te karakteriseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubiquitination en sumoylation laat de vervoeging van ubiquitine en Kleine Ubiquitine-achtige modifier (SUMO; Smt3 in S. cerevisiae 1) tot een doelwit eiwit, respectievelijk. PTMs van kinetochore eiwitten invloed op hun cellulair niveau en eiwit-eiwit interacties tijdens de verschillende fasen van de celcyclus trouw chromosoom segregatie te garanderen. Zo zijn cellulaire niveaus van Cse4 / CENP-A en buitenste kinetochoor eiwit Dsn1 geregeld door ubiquitine gemedieerde proteolyse te zorgen genoomstabiliteit 2-5. Destabilisatie van onjuiste kinetochoor-microtubule bijlagen vereist de IPL1 / Aurora B kinase, die Dam1 en Ndc80 complexen die rechtstreeks interageren met microtubules 6-8 fosforyleert. Ondanks de identificatie van meer dan zeventig kinetochore eiwitten, zijn er weinig studies die de wijzigingen van deze eiwitten met PTM's, bijvoorbeeld ubiquitine en SUMO onderzoeken. Een belangrijke beperking is de mogelijkheid om de PTM bewarens tijdens de zuivering en het gebrek aan aangepaste antilichamen voor detectie van PTMs zoals sumoylation, fosforylering, methylering, en anderen. Karakterisering van sumoylated kinetochoor eiwitten Ndc10, Cep3, Bir1 en Ndc80 gebruikt een aangepaste antilichaam 9. Daarnaast is Ndc10 geïmpliceerd als een substraat voor ubiquitinering 10. Human Hec1 (Ndc80 in S. cerevisiae) wordt ook substraat voor ubiquitinering, gereguleerd door APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Daarom Ndc10 en Ndc80 zijn goede kandidaten voor de optimalisatie van het protocol bij zowel sumoylation en ubiquitinering te detecteren in S. cerevisiae.

Om de identificatie van sumoylation faciliteren, we geconstrueerd stammen die HF-Smt3 en Myc-gelabeld Ndc10 of Ndc80 uiten. Het gebruik van epitooplabels (HF: His6-vlag) minimaliseert de achtergrond door cross-reactiviteit die vaak wordt waargenomen bij polyklonaal serum opgewekt tegen een kandidaat eiwit. We bedachten een protocol affiniteitzuiveren HF-Smt3 conjugaten en vervolgens gebruikt commerciële anti-Flag en anti-Myc antilichamen om de aanwezigheid van sumolyated Ndc10 en Ndc80 in het gezuiverde preparaat Smt3 detecteren. Voor ubiquitination, we bedacht een aangepaste immunoprecipitatie protocol dat ubiquitinatie van de Myc-gelabelde kinetochoor eiwitten bewaart en uitgevoerd western blot analyse met commerciële anti-Ub antilichaam aan ubiquitinering van Ndc10 en Ndc80 detecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Groei van gistcellen

  1. Inoculeer gistcellen in 30 ml YPD (tabel 1) in een kolf. Incubeer bij 30 ° C geïncubeerd onder schudden.
  2. Verdun de cellen tot een optische dichtheid van 0,2 bij 600 nm (OD 600 = 0,2) in 50 ml YPD en incubeer bij 30 ° C onder schudden.
  3. Groeien de cultuur een optische dichtheid van 1,0 bij 600 nm (OD 600 = 1,0).
  4. Centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 2.000 xg en de supernatant weggegooid.
  5. Resuspendeer de celpellet in 40 ml steriel water en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2000 xg om de cellen te wassen. Verwijder het supernatant en bewaar de celpellet bij -20 ° C.

2. Winning van Proteins

  1. Resuspendeer cellen in 0,5 ml ijskoude buffer guanidine (tabel 1) voor pull-down assay gebruik van Ni-NTA superflow korrels of buffer A (tabel 1) voor immunoprecipitatie. Blijf buizen op ijs te allen tijde.
  2. Transfer naar 2 ml schroefdop buis.
  3. Voeg hetzelfde volume van glazen kralen (Table of Materials).
  4. Bead-winnen van de cellen in een mini bead beater (Table of Materials) gedurende 2 min bij kamertemperatuur en plaats op ijs gedurende 2-3 minuten. Herhaal dit drie maal.
  5. Vortex op hoge snelheid bij 4 ° C gedurende 30-60 min. Controleer de cellen door visualisatie onder de microscoop dat de cellen zijn gelyseerd.
    Opmerking: gelyseerde cellen worden weergegeven als donkere geesten en het gebrek aan een grens of gedefinieerde vorm. Optimaal ten minste 80% van de cellen worden gelyseerd.
  6. Prik een gat in de bodem van de buis met behulp van een punaise en plaats in een verzameling 15 ml conische buis (schroefdop moet los).
  7. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 min naar het lysaat te verzamelen.
  8. Breng het lysaat naar een microcentrifuge buis.
  9. Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C om de geëxtraheerde eiwitten te verzamelen.
  10. Meet de concentratie van de geëxtraheerde eiwitten met het eiwit ASSAy kit (Table of Materials) en normaliseren alle extracten dezelfde hoeveelheid eiwit. Breng het totale volume met geschikte buffer 1 ml.
    Opmerking: Ongeveer 5 mg totaal eiwit wordt verkregen uit 50 OD 600 cellen.
  11. Opslaan 50 pl (250 ug eiwit wanneer de totale proteïne geëxtraheerd uit stap 2,10 is 5 mg) als geheel celextract (WCE). Voeg 50 ul van 2 x Laemmli monsterbuffer (Tabel 1) en incubeer bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min. Belasting 10 pi van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse).

3. Zuivering van HF-Smt3 Conjugaten

  1. Het verkrijgen van de Ni-NTA superflow kralen (Table of Materials) die nodig zijn voor de experimenten (100 pi kralen per monster) door de lage snelheid te centrifugeren (800-1,500 xg) gedurende 1 min. Verwijder het supernatant.
  2. Was kralen 5x met 1 ml PBS (tabel of Materials): Omkeren top-over-onderkant totdat de kralen worden gesuspendeerd, het verzamelen van kralen door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant.
  3. Suspendeer kralen in 1 ml van guanidine buffer (Tabel 1) en aliquot ze in het aantal buizen overeenkomt met monsters te verwerken. Verzamel parels door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant. Meng de kralen goed door het omkeren van de top-over bodem.
    Opmerking: Mix kralen goed door omkeren top-over bodem.
  4. Voor elk monster, voeg 950 ul van de resterende WCE (uit stap 2,11: extractie van eiwitten) aan 100 ui Ni-NTA superflow beads.
  5. Incubeer op een schudapparaat bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur of 's nachts.
  6. Centrifugeer bij 800-1,500 xg gedurende 1 min bij 4 ° C.
  7. Spaar 50 ul als supernatant (SUP). Voeg 50 ul van 2 x Laemmli monsterbuffer en incuberen bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min. Belasting 10 pi van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analtion).
  8. Was parels eenmaal met 1 ml van guanidine buffer gedurende 5-10 minuten op een schudplatform.
  9. Was 5x kralen met 1 ml breken buffer (Tabel 1) gedurende 5-10 minuten op een schudplatform.
  10. Resuspendeer kralen in 90 pl 2 x Laemmli monsterbuffer.
  11. Voeg 10 ul van 1 M imidazool.
    Opmerking: Imidazool helpt de His-gemerkt eiwit uit de Ni-NTA-parels dissociëren vanwege concurrerende wisselwerking tussen imidazool en de kralen.
  12. Incubeer bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min.
  13. Vortex, centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 30 sec. Breng het supernatant naar een nieuwe buis.
  14. Load 10-20 ul van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse).
    Noot: 10-20 pl overeen met 0,5-1,0 mg input als 5 mg WCE gebruikt.

4. Immunoprecipitatie van de Myc-tagged eiwitten kinetochoor

  1. Verkrijgen van anti-c-Myc agarose gel een affiniteittibody (Table of Materials) die nodig zijn voor de experimenten (25 ul van hars per monster) door de lage snelheid te centrifugeren (800-1,500 xg). Verwijder het supernatant.
  2. Was de hars 5x met 1 ml buffer A: Omkeren top-over-bottom totdat de hars wordt gesuspendeerd, het verzamelen van hars door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant.
  3. Suspendeer hars in 1 ml buffer A en aliquot ze in het aantal buizen overeenkomt met monsters te verwerken. Verzamel hars door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant.
    Opmerking: Meng de hars goed door het omkeren van de top-over-bodem.
  4. Voeg 950 pi van het resterende WCE (uit stap 2,11: extractie van eiwitten) tot 25 gl hars.
  5. Incubeer op een schudapparaat bij 4 ° C overnacht.
  6. Centrifugeer bij 800-1,500 xg gedurende 1 min bij 4 ° C.
  7. Spaar 50 ul als supernatant (SUP). Voeg 50 ul van 2 x Laemmli monsterbuffer en incuberen bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min. Ziead 10 ul van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse).
  8. Was de hars 5x met 1 ml buffer A: Omkeren top-over-bottom totdat de hars wordt gesuspendeerd, het verzamelen van hars door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant.
  9. Resuspendeer de hars in 100 pl SUMEB monsterbuffer (Tabel 1).
    Opmerking: SUMEB sample buffer bevat 8 M ureum en 1% SDS (sterke denaturerende voorwaarde).
  10. Incubeer bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min.
  11. Vortex, centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 30 sec. Breng het supernatant naar een nieuwe buis.
  12. Load 10-20 ul van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse).
    Noot: 10-20 pl overeen met 0,5-1,0 mg input als 5 mg WCE gebruikt.

5. Western-blotanalyse

  1. Laad de eiwitextracten op 4-12% Bis-Tris gels (Table of Materials) en perform elektroforese bij 120 V gedurende 90 min (Hardlopen buffer: Table of Materials).
  2. Breng de eiwitten van gel naar een nitrocellulosemembraan (Table of Materials) met een overbrenginrichting bij 30 V gedurende 90 min (transfer buffer: Table of Materials).
  3. Blokkeer het membraan in 5% melk / TBST 1x (Tabel 1) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  4. Incubeer het membraan met primair antilichaam (Table of Materials) in 5% melk / TBST 1x overnacht bij 4 ° C. Voor primaire antilichamen gebruikt een verdunning van 1: 1000 (anti-Flag en anti-Ub-antilichamen) of 1: 5000 (anti-Myc-antilichaam).
  5. Was 3x membraan gedurende 10 minuten elk met 1x TBST.
  6. Incubeer het membraan met secundair antilichaam (Table of Materials) in 5% melk / TBST 1x 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Met een 1: 5000 verdunning van secundaire antilichamen.
  7. Was 3x membraan gedurende 10 minuten elk met 1x TBST.
  8. Incubeer membraan met ECL working oplossing (Table of Materials) gedurende 5 min.
  9. Expose het membraan naar blauw gevoelige X-Ray film (Table of Materials) en de ontwikkeling van het gebruik van een automatische ontwikkelaar (Table of Materials).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om sumoylation van kinetochore eiwitten Ndc80 en Ndc10 detecteren stammen met HF-Smt3 en Myc-gelabeld kinetochoor eiwitten (Ndc80 of Ndc10) werden geconstrueerd (Tabel 2), zoals eerder beschreven 9,12. HF-Smt3 conjugaten werden affiniteit gezuiverd onder toepassing van Ni-NTA korrels. Western blot analyse van gezuiverde HF-Smt3 met anti-Flag-antilichaam liet detectie van sumoylated vormen van SUMO substraten die in de controlestam zonder HF-Smt3 (Figuur 1A en 1B,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epitoopaanhangsels zoals HA, Myc, vlag, GST en worden veel gebruikt voor biochemische analyse van eiwitten. Constructie van stammen met HF-Smt3 en Myc-tagged kinetochore eiwitten, zoals Ndc10 en Ndc80, vergemakkelijkt de detectie van PTMs zoals sumoylation en ubiquitinering. HF-Smt3 afbreken assay maakt de detectie van sumoylated kinetochore eiwitten, Ndc10 en Ndc80 (figuur 1). De affiniteit zuivering protocol en western blot analyse met behulp van anti-Flag antilichaam te stellen de specificiteit van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Oliver Kerscher voor ondersteuning en advies en leden van het Basrai-laboratorium voor hun ondersteuning en opmerkingen over het artikel. Dit werk werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Glass beadsBioSpec Products110791050.5 mm diameter
Mini beadbeaterBioSpec Products#6938 cell disrupter
Ni-NTA superflowQiagen30430100 ml
Protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP82151 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbitSigma-AldrichA74701 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouseSigma-AldrichF1804Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14)Santa Cruz Biotechnologysc-789Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10CovanceMMS-150PPrimary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibodyCovanceMMS-258RPrimary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole AbGE Healthcare Life SciencesNA934VSecondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole AbGE Healthcare Life SciencesNA931VSecondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assayBio-Rad500-0116
Nitrocellulose membraneNovexLC20010.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsNovexNP0321BOX1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running BufferNovexNP000220x
NuPAGE Transfer BufferNovexNP0006-120x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34078
10x PBS pH7.4GIBCO70011-044
Blue sensitive X-Ray filmDbioDBOF30003
Automatic developerKodakM35AX-OMAT
NocodazoleSigma-AldrichM140450 mg
MG-132Selleck ChemicalsS261925 mg

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216(2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158(2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van sumoylatiedetectie van ubiquitiniseringNdc10 Ndc80zuivering met nikkelbolletjesimmunoprecipitatiemethodeWestern blot analyseSaccharomyces cerevisiaeepitope tagging

Gerelateerde artikelen