Methodenartikel

Generatie van de Mens Adipose stamcellen via dedifferentieëren Mature Adipocyten in Plafond Culturen

11.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52485

⸱

7 maart 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1IUCPQ Research Center, 2CHU de Québec Research Center, 3Laval University

In dit artikel

Samenvatting

Volwassen adipocyten kunnen een overvloedige bron van stamcellen vertegenwoordigen door dedifferentiatie, wat leidt tot een homogene populatie van fibroblast-achtige cellen. Collagenase-digestie wordt gebruikt om volwassen adipocyten uit menselijk vet te isoleren. Het doel van ons protocol is om multipotente, dedifferentieerde vetcellen te verkrijgen uit menselijke volwassen adipocyten.

Samenvatting

Volwassen adipocyten hebben aangetoond dat ze hun fenotype kunnen omkeren in fibroblast-achtige cellen in vitro door middel van een techniek genaamd plafondcultuur. Volwassen adipocyten kunnen ook worden geïsoleerd uit vers vetweefsel voor depot-specifieke karakterisering van hun functie en metabole eigenschappen. Hier beschrijven we een goed gevestigd protocol om volwassen adipocyten uit vetweefsels te isoleren door middel van collagenase-digestie, en daaropvolgende stappen om plafondculturen uit te voeren. Kort samengevat, worden vetweefsels geïncubeerd in een Krebs-Ringer-Henseleit buffer die collagenase bevat om de weefselmatrix te verstoren. Drijvende volwassen adipocyten worden verzameld op het bovenste oppervlak van de buffer. Volwassen cellen worden geplaatst in een T25-kolf die volledig is gevuld met media en omgekeerd geïncubeerd gedurende een week. Een alternatieve 6-well plaat cultuur benadering maakt de karakterisering van adipocyten mogelijk die dedifferentiatie ondergaan. Adipocytmorfologie verandert drastisch gedurende de cultuurtijd. Immunofluorescence kan eenvoudig worden uitgevoerd op slides gekweekt in 6-well platen, zoals gedemonstreerd door FABP4 immunofluorescence kleuring. FABP4 eiwit is aanwezig in volwassen adipocyten maar wordt onderdrukt tijdens dedifferentiatie van vetcellen. Dedifferentiatie van volwassen adipocyten kan een nieuwe weg vertegenwoordigen voor celtherapie en weefsel engineering.

Inleiding

In vitro dedifferentiatie van volwassen adipocyten wordt bereikt door een techniek die plafondcultuur wordt genoemd1. Vanwege hun natuurlijke neiging om te zweven in waterige oplossingen, hechten geïsoleerde volwassen adipocyten zich aan het oppervlak van een omgekeerde kolf die volledig gevuld is met kweekmedium. Na een paar dagen wijzigen cellen hun sferische morfologie en worden ze fibroblast-achtige cellen. De resulterende cellen, genaamd gededifferentieerde vet (DFAT) cellen, zijn multipotent2. Onderzoeksartikelen over dedifferentiatie van adipocyten, vooral over menselijke cellen, zijn beperkt. Ze hebben echter al interessante informatie opgeleverd over multipotentie, celfenotype en replicatieve capaciteit van DFAT-cellen2. Volwassen adipocyten afkomstig van verschillende vetcompartimenten zijn met succes gededifferentieerd, inclusief die afkomstig van menselijk visceraal en subcutaan vetweefsel2-4. Naast deze depots hebben Kishimoto en medewerkers vetweefsel uit de buccale vetkussens genomen en adipocyten gededifferentieerd tot DFAT-cellen5. Matsumoto en medewerkers hebben met succes subcutane DFAT-cellen gegenereerd van patiënten die een breed leeftijdsbereik dekken, en de meerderheid van de cellen had een hoge proliferatiesnelheid en minder dan 6% senescentie, zelfs na 10 passages in cultuur2.

DFAT-cellen zijn met succes opnieuw gedifferentieerd in verschillende lijnen, waaronder adipogene, osteogene, chondrogene en neurogene lijnen2,3,6. Deze cellen drukken verschillende embryonale stamcelmarkers uit, zoals Nanog en de vier geïdentificeerde pluripotente factoren Oct4, c-myc, Klf4 en Sox23. Ze drukken ook markers uit die specifiek zijn voor elk van de drie kiembanden7. Bovendien zijn DFAT-cellen vergelijkbaar met beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (BM-afgeleide MSC) op basis van hun epigenetische signatuur3. Door de stamcelcapaciteit van DFAT-cellen te benutten, hebben veel groepen hun potentieel onderzocht om verschillende ziekten te behandelen of te verbeteren8,9. Verbeteringen van pathologische toestanden, zoals infarct cardiaal weefsel, ruggenmergletsel en urethrale sfincterdisfunctie, zijn waargenomen bij injecties met DFAT-cellen in rattenmodellen van ziekten10-12.

Naast de stamceleigenschappen van DFAT-cellen, kunnen ze een nieuw cellulair model vertegenwoordigen voor studies naar adipocytenfysiologie. De 3T3-L1-cellijn wordt vaak voor dit doel gebruikt, aangezien deze cellen differentiëren tot adhesieve, lipide-opslaande adipocyten onder adipogene stimulatie13. Deze cellen zijn echter afkomstig van muis embryoweefsel13. Ook kan depot-specificiteit niet worden onderzocht met dit model en het geeft mogelijk niet volledig de menselijke adipocytenfysiologie weer14. Andere laboratoria werken met geïsoleerde vetcellen uit muis vetdepots, maar vetverdeling is niet dimorf bij muizen en de anatomische configuratie van de buikholte van de knaagdieren verhindert directe extrapolatie naar mensen15. Om adipocyten te bestuderen in de context van de fysiopathologie van menselijke obesitas, is het noodzakelijk om rekening te houden met de verdeling van lichaamsvet en depot-specifieke verschillen16. Sommige beperkingen van primaire preadipocytenculturen, inclusief de hoeveelheid cellen verkregen uit vetweefselbiopsiemonsters en hun senescentie na een paar passages in cultuur, hebben de behoefte aan alternatieve modellen gecreëerd. Perrini en medewerkers onderzochten depot-specificiteit in genexpressie van DFAT-cellen afkomstig van visceraal en subcutaan vet en vergeleken ze met adipogene stamcellen (ASC) uit hetzelfde vetdepot. Ze toonden aan dat verschillen in genexpressie en functie voornamelijk tussen depots werden gevonden in plaats van tussen celtypen, wat suggereert dat DFAT-cellen fysiologisch dicht bij ASC uit hetzelfde depot zijn. DFAT-cellen kunnen een interessante alternatieve optie vertegenwoordigen voor beschikbare modellen voor studies over vetverdeling in de fysiopathologie van menselijke obesitas. Bovendien is plafondcultuur een veelbelovende methode om volwassen stamcellen te verkrijgen voor weefselengineeringdoeleinden.

Hier beschrijven we collagenase-digestie, een veelgebruikte techniek om volwassen adipocyten te isoleren uit subcutane en/of viscerale vetmonsters17, en de daaropvolgende stappen om plafondcultuur uit te voeren en deze cellen te dedifferentiëren in multipotente, fibroblast-achtige cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethische verklaring: Het project is goedgekeurd door Research Ethics Committee IUCPQ goedgekeurd voorafgaand aan de rekrutering van patiënten. Voor de toepassing van dit artikel / video, we verkregen weefsels van 2 patiënten: 1) een 62-jarige mannelijke patiënt met een BMI van 50,7 kg / m 2 en 2) een 35-jarige vrouwelijke patiënt met een BMI van 57 kg / m2. Experimenten kan met beide vetcompartimenten, maar zijn beperkt tot een vet compartiment voor de doeleinden van deze video. Technische aspecten van de video werden uitgevoerd met patiënten 1 en FABP4 immunofluorescentie werd uitgevoerd met gededifferentieerde cellen van patiënt 2.

1. monster verwerking

  1. Vraag chirurgen om vetweefsel te verzamelen van de omental en onderhuids vet compartimenten ten tijde van de laparoscopische bariatrische chirurgie.
  2. Brengen snel vet monsters naar het laboratorium bij RT en direct te verwerken.
  3. Voer vertering in het laboratorium, in een niet-steriele atmosfeer. Decellen zal uiteindelijk worden overgebracht naar de kweekkamer en gekweekt onder steriele omstandigheden. Om besmetting te voorkomen, te bereiden KRH buffer met gedistilleerd en gefilterd water en volgen door een filtratie (0,22 pm filter) voorafgaand aan de spijsvertering. Grondig reinigen buizen met ethanol voorafgaande overdracht in de celkweek kap voor kolf en plaat voorbereiding.
  4. Plaats vetweefsel op een vooraf gewogen gerecht en opnemen gewicht. Bevestig een klein stukje van elk weefselmonster (minder dan 1 cm2) in 10% formaline buffer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur voor inbedden in paraffine. Gebruik deze ingebed monster voor immunohistochemie experimenten (techniek niet getoond).
  5. Plaats een stuk in een 50 ml buis en kort vriezen in vloeibare stikstof voor opslag bij -80 ° C voor verdere studies in gehele vetweefsel (bv genexpressie - techniek niet getoond).

2. Collagenase Spijsvertering

  1. Leg de resterende vetweefsel stuk in een 50 ml tuvoor vertering.
  2. Voeg 4 ml KRH-WB aangevuld met collagenase (350 U / ml) per gram monster in de destructiebuis.
  3. Hak vetweefsel met een schaar.
  4. Plaats gehakt vetweefsel suspensie in een shaker, 37 ° C, rpm maximaal 90, voor een 45 minuten durende incubatie (maximaal 1 uur).

3. Zuivering van Adipocyten en preadipocyten

  1. Giet de doorschijnende oplossing met weinig stukjes vet door een 400 uM nylon gaas in een plastic beker.
  2. Met een pincet, wrijf de cel voorbereiding op het nylon gaas en was met 5 ml KRH-WB.
  3. Fijn overdracht van de gefiltreerde celsuspensie in een 50 ml buis met de plastic buis erin en een 60 cc spuit bevestigd aan de slang uiteinde.
  4. Laat de suspensie met volwassen adipocyten staan ​​voor ongeveer 10 minuten, waardoor de cellen aan de bovenzijde van de buffer bereiken flotatie.
  5. Langzaam zuigen de buffer op de bodem van de buis met behulp 60cc syringe afzuiging.
  6. Voeg 20 ml KRH-WB te wassen. Herhaal vanaf stap 3.4 voor 2 extra wasbeurten.
  7. Verzamel de buffer de adipocyten suspensie tot een eindvolume van 5 of 10 ml te brengen, afhankelijk van hoeveelheid cellen. Na te streven met stappen in paragraaf 5.
  8. Herstel de stromale vasculaire fractie uit de verzamelde met 60 cc spuit door centrifugatie (3000 rpm, kamertemperatuur, 5 minuten) voor primaire celkweek desgewenst buffer (techniek niet getoond).

4. Volwassen Adipocyte celgetal

  1. Load 10 ul van zacht geschud adipocyt suspensie in een telkamer (haemocytometer). Voeren celgetal in viervoud.
  2. Bereken aantal geïsoleerde volwassen cellen.

5. Volwassen Adipocyte dedifferentiation in T-25 Kolf

  1. Vul een 25 cm 2 weefselkweek kolf tot ¾ van het volume met DMEM / F12-20% kalf serum.
  2. Volgens celgetal, giet 500.000 volwassen cellen in de kolf.
  3. Vul de kolf compleet met een 50 ml buis met medium en verwijder zo veel bubbels als mogelijk.
  4. Schroef de ongeventileerde dop op de fles.
  5. Reinig de kolf met ethanol voorafgaand aan de incubatie om besmetting te voorkomen.
  6. Incubeer de fles op zijn kop voor een week zonder het aan te raken om beweging in de cultuur die cellulaire hechting kunnen verstoren te voorkomen.
  7. Voorafgaand aan het omkeren van de kolf bij 7 dagen van omgekeerde cultuur, voorzichtig manipuleren van de kolf en verwijder alle medium in de kolf door aspiratie, het vermijden van abrupte bewegingen.
  8. Voeg 12 ml van DMEM-F12-20% kalfsserum en cultiveren cellen met standaard technieken. Een gefiltreerd ontluchtingsdop worden toegevoegd aan de kolf.

6. Volwassen Adipocyte dedifferentiation in een 6-wells plaat

  1. Plaats een dekglaasje op de bodem van elk putje van een 6-well plaat
  2. Voeg een ½ "plastic bus op de top van elke dekglaasje.
  3. Vul putjes met 8 ml 20% kalfsserum-DMEM medium.
  4. Zet een dekglaasje op elke plastic bus.
  5. Steek pipet tip tussen de glijbaan en de buis om cellen te injecteren onder de glijbaan (50.000 cellen per putje).
  6. Incubeer de platen in een standaard celkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende een week.
  7. Reverse dekglaasje met aangehechte cellen in elk putje met 2 ml medium aangevuld met 20% kalfsserum en nastreven cultuur.
  8. Gebruik dekglaasje met cellen die dedifferentiatie voor verschillende doeleinden zoals immunofluorescentie (techniek niet getoond).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Belangrijke morfologische wijzigingen opkomen bij adipocyten vervaldatum binnen dedifferentiatie (figuur 1). Zoals getoond in Figuur 2, werden cellen die dedifferentiatie gekleurd met een anti-FABP4 antilichaam voor fluorescentieanalyse. Cellen met een ronde morfologie sprak de FABP4 eiwit, terwijl de meerderheid van de fibroblast-achtige cellen niet. Na dedifferentiation, kan DFAT cellen worden gekweekt met standaard procedures voor de verschillende passages. We zijn in staat om meer d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dedifferentiatie van rijpe adipocyten het plafond cultuur techniek is een nieuwe benadering adipose stamcellen verkregen uit een klein monster van natief vetweefsel. Gebaseerd op onze ervaring en die van anderen 2, een gram weefsel is voldoende om een 25-cm2 kolf plaat en een populatie van cellen DFAT waarvoor homogeniteit is aangetoond door Poloni en medewerkers 3 verkrijgen. Adipocyten dedifferentiation lijkt mogelijk met cellen uit een donor, onafhankelijk van hun leeftijd, geslacht e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (371697-2011, AT). De auteurs willen de hulp van bariatrische chirurgen Drs S. Biron, F-S. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau, evenals Christine Racine en Caroline Gagnon van de IUCPQ Tissue Bank, erkennen. We danken de heer Jacques Cadorette van de audiovisuele diensten van de IUCPQ voor het opnemen en bewerken van de video.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bovine serum albumineSigmaA7906
AdenosineSigmaA4036
Ascorbic acidSigmaA0278
NaClElke merk kan worden gebruikt
KClElke merk kan worden gebruikt
CaCl2Elke merk kan worden gebruikt
MgCl2Elke merk kan worden gebruikt
KH2PO4Elke merk kan worden gebruikt
HEPESElke merk kan worden gebruikt
GlucoseElke merk kan worden gebruikt
Type I collagenaseWorthington Biochemical CorpLS-004196
DMEM/F-12, HEPES, geen fenolroodGibco-Life Technologies11039-021Aan het medium toevoegen: 20% calf serum, gentamicine (50 µg/ml) en fungizone (2,5 µg/ml)
Calf Serum, met ijzer aangevuld, van formule-gevoede kalverenSigmaC8056-500 ml
1/2 In plastic bushingIberville2704-CPSKU:1000120918 (Home Depot)
Vloeibare stikstofLinde
Formaline oplossing, neutraal gebufferd, 10%SIGMAHT501128
Steriele pincetten
Steriele schaar
60 cc spuitenBD Syringe
Kunststof buis
Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH)Bereid stock buffer als volgt: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2,5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Pas pH aan tot 7,4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)Voeg de volgende componenten vers toe aan KRH buffer: 4% bovien serum albumine, 5 mM glucose, 0,1 µM adenosine, 560 µM ascorbinezuur
KRH-WB aangevuld met Type I collagenaseVoeg 350 U/ml Type I collagenase toe
T25 ongeventileerde dop weefselkweekkolfSarsted of andere merk
6-well weefselkweekplaatBD Falcon of andere merk
Microscoop dekglas 22x22Fisherbrand12-542-B
Steriele bekers

Referenties

  1. Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
  2. Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
  3. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  4. Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892(2013).
  5. Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
  6. Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
  7. Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
  8. Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
  9. Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
  10. Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
  11. Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
  12. Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
  13. Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
  14. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  15. Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
  16. Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
  17. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
  18. Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ceiling CultureCollagenase digestieWeefselisolatieDedifferentiatieprocesFABP4 immunofluorescentieCelmorfologieTissue EngineeringCeltherapie

Gerelateerde artikelen