Zebravis Keratocyte Explantaten naar Collective Cel Migratie en reepithelialization in Cutane Wound Healing Bestudeer

Samenvatting

Zebravis keratocyten migreren celvellen van explantaten en verschaffen een in vitro model voor de studie van de mechanismen van collectieve celmigratie in de context van epitheliale wondgenezing. Deze protocollen detail een effectieve manier om primaire explantkweken stellen voor gebruik in collectieve celmigratie assays.

Samenvatting

Vanwege hun unieke beweeglijke eigenschappen, vis keratocyten losgekoppeld van explantkweken zijn lang gebruikt om de mechanismen van cel migratie te bestuderen. Wanneer echter explantaten worden vastgesteld, deze cellen gezamenlijk bewegen ook behoud vele eigenschappen die afzonderlijke keratocyten een aantrekkelijke model migratie studeren: hoge snelheden van motiliteit uitgebreide actine-rijk lamellen met een loodrechte actine kabel, en betrekkelijk constante snelheid en trekrichting. In het begin van explantaten, de snelle onderlinge omzetting van cellen migreren individueel met die migreren collectief maakt de studie van de rol van cel-cel adhesie bij het bepalen van de wijze van migratie, en benadrukt de moleculaire banden tussen de twee modi van de migratie. Cellen in latere explantaten verliezen hun vermogen om snel en gezamenlijk migreren als epitheliale naar mesenchymale overgang plaatsvindt en genen geassocieerd met wondgenezing en ontsteking op differentiële expressie. Aldus kan keratocyte explantaten dienen als een in vitro model voor de reepithelialization die tijdens cutane wondgenezing en een uniek systeem om mechanismen van collectieve celmigratie te onderzoeken in het kader van een bepaald programma van genexpressie verandert vertegenwoordigen. Verschillende mutant en transgene zebravis lijnen beschikbaar, waardoor explantaten worden vastgesteld uit vis met verschillende genetische achtergronden. Hierdoor kan de rol van de verschillende eiwitten in deze processen uniek worden aangepakt. De hier beschreven protocollen beschrijven een eenvoudige en effectieve methode voor het vaststellen van deze explantkweken voor gebruik in verschillende assays inzake collectieve celmigratie.

Inleiding

Studies van celmotiliteit traditioneel geconcentreerd op individuele migrerende cellen. Keratocyten gekweekte uit vis en amfibie explants hebben bewezen een krachtig model systeem om de mechanismen van celbeweeglijkheid bestuderen met behulp van zowel experimentele en wiskundige modellering benadert ^1-6 zijn. Experimenten op individueel migrerende cellen wordt bevorderd door de snelle, glijden beweging van de cellen, terwijl een gelijkmatige vorm, snelheid en richting. In vivo cellen bewegen vaak samen met behoud van cel-cel contacten, vooral tijdens de embryogenese, wondheling en metastase. Zo collectieve cel migratie is een groeiende en steeds meer prominente gebied van onderzoek binnen het gebied van de cel migratie. De collectieve migratie van deze cellen is onlangs beschreven ⁷ en het heeft vele unieke eigenschappen die het een krachtig systeem van collectieve cel migratie te bestuderen in een wondgenezing model te maken.

ove_content "> Wanneer schalen worden geplukt van een verdoofde volwassen zebravissen, blijft wat epitheelweefsel op de onderkant van de schaal. Als kweekmedium wordt toegevoegd, deze epitheelcellen of keratocyten, migreren snel collectief eenheid van de schaal. De explantaatkweek kan worden gezien als een epitheliale wondgenezing model, waarin de cellen migreren van het explantaat zoals zij in de voorlopige matrix van een wondbed een intact epitheel herstellen. Recente gegevens suggereren dat deze ex vivo kweken bootst vele functies van in vivo wondgenezing in volwassen zebravissen. wondsluiting bekijken ⁸ vertalen naar een migratie snelheid vergelijkbaar met die waargenomen in de ex vivo systeem ^7. Bovendien, in een in vivo model wondgenezing, behandeling met warfarine suggereert dat hemostase heeft geen effect op koers van genezing, terwijl behandeling met hydrocortison immuunrespons verminderen niet reepithelialization ⁸ vertragen . Zoals de zebravis bloedt niet wanneer de schaal wordt verwijderd uit het dier, hemostase is geen grote speler. Hoewel we immuuncellen gevonden in explantaten, hebben we de effecten zij zouden kunnen hebben op collectieve celmigratie niet onderzocht.

De hier gepresenteerde protocol beschrijft hoe zebravis keratocyte explantkweken dat consistentie en reproduceerbaarheid voor gebruik in vele biologische assays kan verzekeren. Deze explantkweken zijn bijzonder dwingend in vitro model voor collectieve celmigratie om verschillende redenen. Ten eerste, de zebravis keratocyten zijn primaire cellen die worden gebruikt binnen enkele uren na oprichting explantkweken. Daarom zijn deze cellen niet de morfologische en genexpressie veranderingen geassocieerd met een passage van primaire cellen ^9-13 ondergaan. Ten tweede, dit systeem is een model voor de studie van reepithelialization reactie op verwonding ¹⁴ en het kader van de respons op verwonding, een epitheliale naar mesenchymale transition (EMT) wordt geïnitieerd zoals blijkt uit veranderingen in genexpressie en herschikkingen van het cytoskelet ^14,15. Zo hebben de achtergrond veranderingen in genexpressie en motiliteit die voorkomen in onbehandelde cellen gekarakteriseerd en een context verandert met behandeling interpreteren. Bovendien, de vis keratocyte en de menselijke keratinocyt functioneel gelijkwaardig; zowel de primaire epitheelcellen van hun respectieve soorten en spelen een belangrijke rol in epitheliale wondgenezing. Ten derde, volwassen zebravissen winnen erkenning als modelsysteem voor diverse humane ziekten waaronder ^16-18 melanoom en andere kankers ^19-21, cutane wondgenezing ^8,14 en weefselregeneratie ^22-24.

Technische voordelen van dit model systeem zijn even overtuigend. Een groeiend aantal mutant en transgene lijnen zijn verkrijgbaar bij non-profit, gecentraliseerde faciliteiten. Met name de zebravis Mutation Project (ZMP) En het Wellcome Trust Sanger Institute beoogt een knockout allel in elk eiwit coderende gen in de zebravis genoom maken. Momenteel hebben zij gemuteerde 11.892 genen, ongeveer 45% van het genoom, met 24.088 allelen gekarakteriseerd. Daarnaast ZMP accepteert voorstellen en zal knock-outs kosteloos te genereren. Recente werkwijzen gen knockdown in larven en volwassen zebravissen ^25-28 flexibiliteit bieden om de functie van ontwikkelings belangrijk genen waarvoor transgene benaderingen problematisch of onpraktisch bestuderen.

Vanwege hun extreem hoge snelheden van beweeglijkheid van ~ 145 um / uur kort na instelling van culturen ²⁹ kunnen assays snel af (gewoonlijk 24 uur of minder). Zoals experimenten snel kan worden afgerond en culturen groeien goed bij RT, een aantal van de technische hindernissen in verband met zoogdiercellen migratie assays waarbij videomicroscopie worden vermeden. Bovendien, in de leeftijd van aanscherping onderzoeksbudgetten, zebrafachtig zijn gemakkelijk en goedkoop onderhouden.

De structuur en het gedrag van de explantatie is complex. Als de vis niet bloeden wanneer de schaal wordt verwijderd, is het onwaarschijnlijk dat meer dan de oppervlakkige epidermale lagen worden verwijderd met de schaal. Keratocyten lijken het overheersende celtype in het explantaat wanneer weegschaal eerst worden verwijderd uit de vis als de meeste cellen blijken vlek met een anti-E-cadherine antilichaam ^14. Bovendien is er geen bewijs van fibroblasten in de initiële kweek zoals beoordeeld door de afwezigheid van vimentine kleuring met immunofluorescentie ^14. Echter, met herhaalde schaal verwijderen, lijken er tal van neutrofielen in de explantatie (zie video 1). We hebben deze cellen zoals neutrofielen gebaseerd op morfologische waarnemingen van hun grootte, snel motiliteit en de migratie van de cellaag die bij blootstelling aan LPS (gegevens niet getoond). Bovendien, deze cellen vlek helder with een antilichaam tegen neutrofiel cytosol factor en met een verscheidenheid van secundaire IgG antilichamen, wat aangeeft dat zij over grote FcR op hun oppervlak (gegevens niet getoond). Meerdere cellagen aanwezig zijn binnen de explantatie. Confocale microscopie onthult de aanwezigheid van een enkele laag bij bovenrand meer dan twee lagen van keratocyten nabij de schaal neutrofielen zichtbaar boven, onder en tussen de cellen keratocyte vellen.

Op vroege tijdstippen cellen op de rand van de meerlaagse explantaat polariseren, initiëren collectieve migratie van keratocyten van het explantaat op beginsnelheden van ~ 145 um / uur. Het gebied dat door de explantatie snel toe, wat leidt tot cel verspreiden, spanning in het vel, en een verminderde snelheid van tevoren van de voorrand. Rapid interconversies tussen leider en volger cellen worden waargenomen op de voorste rand tijdens de vorming en de sluiting van spontaan gevormde gaten in de plaat ^7. Aangezien deEMT proces gestart met de explantatie blijft, het vel fragmenten en de keratocyten verliezen hun gespecialiseerde, snelle beweeglijkheid. Genexpressie en morfologische veranderingen overeenstemming met EMT, wondgenezing en ontstekingsreacties optreden binnen 7 dagen kweken met explantaten wordt nog gedurende ongeveer 10 dagen ¹⁴ beschouwd.

Protocol

Dit protocol voldoet aan de AVMA Dierenwelzijn Principes voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) in het Midwesten University goedgekeurd.

1. Voorbereiding van de anesthesie, apparatuur, & Media

1. Dechloreren ongeveer 1,5 liter leidingwater met behulp van een commercieel dechlorinating middel (verkrijgbaar bij dierenwinkels) of door te laten water staan ​​voor 24 uur. Verkrijgen drie 1 L bekers en vul elk met 500 ml gedechloreerd water. Label één voor het bewaren van vis vóór elke procedure en één voor herstel. Om de derde beker, 100 ug / ml tricaïne methaansulfonaat; wordt dit de beker waarin vis zal worden verdoofd.
2. Vul een ondiepe bak met ijs, warm het kweekmedium (RPMI 1640, 10% FBS (foetaal serum), 50 ug / ml gentamycine, 100 ug / ml kanamycine, 25 mM HEPES) aan RT, en het verzamelen van een pincet schoon juwelier. Schoon pincet door immerzingen de tips in 70% ethanol en passeren een bunsenbrander, waardoor de ethanol te branden uit.
3. Beslissen of de procedure zal worden uitgevoerd zonder vergroting, met een commerciële, table-top verlichte vergrootglas met 2 - 10x vergroting, of dissectiemicroscoop (geheel afhankelijk van persoonlijke voorkeur).

2. Vaststellen explantkweken

1. Vang het gewenste aantal vissen en plaats in een bedrijf beker. Transfer een enkele vis aan de anesthesie beker; is het het beste om de vissen afzonderlijk verdoven.
2. De effecten van de verdoving door naar het zwemmen en kieuw beweging van de vis. Als anesthesie vordert, kieuw beweging vertraagt ​​en de vis zal onregelmatig en vaak ondersteboven zwemmen; beschouwen vis verdoofd zodra kieuw beweging ophoudt. Laat de vis niet voor langere tijd achter in de anesthesie bad, omdat dit kan leiden tot de dood van de vis.
3. Verwijder vis uit de narcose beker en overdrachtom ijs, het plaatsen van de vis horizontaal met de staart geconfronteerd met de hand houden van de pincet. Als ervaren met de techniek en als er meerdere vissen worden gebruikt om explantaten maken, overwogen om de volgende vissen in de anesthesie bekerglas op dit moment.
4. Om schilfers te verwijderen, positie pincet parallel aan de vis met tip aan de rand van de schaal. Druk platte kant van de pincet enigszins in de zijkant van de vis te veroorzaken de schaal verheffen van het lichaam van de vis. Pak schaal met een pincet, plukken, en plaats (zonder inversie) in weefselkweek schotel. Herhaal de procedure verwijdert maximaal 12 schalen van een grote volwassen (6 aan elke kant), het vermijden van de kieuw gebied, de laterale lijn en vinnen.
5. Leg de vis in het herstel bekerglas en om te garanderen dat herstelt van de effecten van narcose. Op dit moment kan vissen worden overgebracht naar een afzonderlijke tank. Laat de vis om te herstellen gedurende ten minste 21 dagen voor volledige schaal regeneratie.
6. Afhankelijk van deexperimenteel ontwerp, plaatsen tot 20 schalen per plastic 35 mm weefselkweek behandeld gerecht of 4-6 schalen per glazen bodem schotel. Laat schalen te houden aan de schotel voordat voorzichtig toevoegen van media, zodat er geen schubben van de schotel los.
   OPMERKING: Met ervaring kunnen meerdere vissen worden verwerkt voordat medium wordt toegevoegd aan de eerste schotel.
7. Voeg 1,2 ml van complete media (zie 1.2 hierboven) in elke 35 mm schaal.
8. Bij voorkeur explantkweken incuberen bij 28 ° C in 5% _CO2 gedurende de gewenste tijdsduur met of zonder verdere behandeling. Als alternatief, incubeer culturen op een verwarmde microscoop podium of in een live celcultuurkamer voor video-microscopie.

3. Helderveld en Video Microscopie

1. Positie gerechten bevatten cel vellen op de microscoop podium en in eerste instantie richten met behulp van de 4X objectief.
   OPMERKING: hogere vergrotingen kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het experiment. Markeren van de locatie vanelke cel en / of de oriëntatie van de schotel op het podium zal vergemakkelijken het maken van opnamen in de tijd met de lakens in ongeveer dezelfde oriëntatie.
2. Verwijder gerechten uit de couveuse en een foto op verschillende tijdstippen, volgens elke experimentele protocol en plaats terug in de couveuse als alleen stilstaande beelden zijn nodig over de experimentele periode.
3. Tijdens het uitvoeren van video-microscopie, let dan op het volgende:
   1. Plaats de schaal / opkomende cellaag binnen het gezichtsveld zodanig dat de migrerende cellaag blijft het gezichtsveld voor de duur van de video.
      LET OP: Dit kan enige ervaring in het observeren van hoe cellen migreren van onder de schaal te nemen. Voor korte video's, dit is minder groot probleem dan voor langere video's.
   2. Voor kortere termijnen, incuberen bij kamertemperatuur. Voor langere termijnen (18+ uur), gebruik maken van een verwarmd podium of een incubatiekamer om op temperatuur te houden, pH-balans, en om verdamping van de cultuur m minimaliserenedium.

4. Fixatie voor Immunofluorescentiemicroscopie

1. Bereid en voorverwarmen alle oplossingen tot 28 ° C. Om keratocyten bekijken onder fluorescentie, groeien explantkweken zoals hierboven met behulp van een glazen bodem 35 mm weefselkweekschalen beschreven. U kunt ook gebruik maken van glazen kamer dia's.
2. Voeg 0,8 ml van 4% paraformaldehyde in 1,1 x PBS elk gerecht. Laat de cultuur media niet eerst te verwijderen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min zuigen vervolgens de oplossing te verwijderen.
3. Voeg 0,8 ml van 4% paraformaldehyde in 1,1 x PBS elk gerecht. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min zuigen vervolgens de oplossing te verwijderen.
4. Tenzij met externe liganden of externe epitopen permeabilize cellen door toevoeging van 0,5 ml 0,2% Triton X-100 in 1X PBS. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min zuigen vervolgens de oplossing te verwijderen.
5. Voeg 0,5 ml van 1% BSA in 1x PBS en incubeer gedurende 1 uur (bij kamertemperatuur) of O / N (bij 4 ° C).
   OPMERKING: Afhankelijk van de experimentele omstandigheden, phalloidin worden toegevoegd in deze stap.
6. Na incubatie, aspireren om de oplossing te verwijderen en doorgaan met antilichaamkleuring. Alternatief, slaan de kweekschalen door toevoegen van ten minste 1-2 ml van 1% BSA in 1x PBS gedurende 3-4 weken bij 4 ° C.

5. Immuunfluorescentie Protocol

1. Bereid primaire en secundaire antilichaam-oplossingen op basis van aanbevelingen van de fabrikant.
   OPMERKING: Als fabrikant aanbevelingen zijn niet beschikbaar, een goed uitgangspunt verdunning van primaire antilichamen (in 1% BSA in 1x PBS) is 1: 500 voor polyklonale en 1: 1.000 voor monoklonale antilichamen; een goed uitgangspunt verwatering voor secundaire antilichamen is 1: 1.000. Pas deze verdunningen van de oorspronkelijke voorraad bij de fabrikant hoger als het signaal zwak is, lager als het signaal is sterk en de achtergrond is een probleem.
2. Zuig het 1% BSA in 1x PBS oplossing. Voeg 0,5 ml primair antilichaam oplossing en incubeer gedurende 1 uur (bij kamertemperatuur) of O / N (bij 4 ° C).
3. Verwijder het primaire antilichaam oplossing, te plaatsen in een schone en gelabelde 1,5 ml microcentrifugebuis en invriezen bij -20 ° C.
   Opmerking: Dit maakt het hergebruik van het primaire antilichaam, indien nodig.
4. Was de schaal 3-5 keer met 1x PBS, het verwijderen en weggooien van de PBS na elke wasbeurt.
5. Voeg 0,5 ml secundair antilichaam oplossing. Voeg desgewenst fluorescentie-gemerkt falloïdine (na aanbevolen concentratie elke fabrikant) tijdens deze stap. Incubeer gedurende 1 uur (bij kamertemperatuur) of O / N (bij 4 ° C).
   OPMERKING: gebruik van fluorescentie-gemerkt falloïdine maakt visualisatie van actine filamenten; We hebben gevonden dat 488-gelabelde phalloidin werkt het best in onze zebravis keratocyten, maar andere fluoroforen worden gebruikt.
6. Verwijderen en het secundaire antilichaam oplossing weggooien.
7. Was de schaal 3-5 keer met 1x PBS, het verwijderen en weggooien van de PBS na elke wasbeurt.
   OPMERKING: Het gerecht kan worden opgeslagen, gedekt uit licht, bij 4 ° C, indien niet in staat te wedijverenw onmiddellijk; zorg ervoor dat 1x PBS wordt toegevoegd in de schaal voor het opslaan om ervoor te zorgen de cellen niet uitdrogen, maar warm aan RT (20 - 30 min), verwijder de PBS net voor u verder gaat met de volgende stap.
8. Wanneer klaar te observeren, voeg 2-3 druppels fixeermiddel, met of zonder DAPI, afhankelijk van de experimentele behoeften in de schaal en laat zitten voor 10 minuten bij kamertemperatuur.
   LET OP: We maken gebruik van een in de handel verkrijgbaar, glycerol op basis van montage medium met DAPI, maar andere montage media kunnen worden gebruikt. Rekening 10 min voor het fixeermiddel te zitten in de schaal vergemakkelijkt verwijdering van de glazen dekglaasje van de bodem van de schaal.
9. Na incubatie knijp aan de zijkanten van de schaal los te maken en verwijderen dekglaasje. Voeg een extra druppel fixeermiddelen op een glasplaatje en plaats het dekglaasje, cellen beneden op de glijbaan.
   OPMERKING: Overweeg het afdichten van de dekglaasje aan de dia met behulp van duidelijke nagellak als de dia moet langer dan 1 moeten worden gehouden - 2 dagen.
10. Let op de dia onder een fluorescentie microscoop.
    NB: De meeste van onze beelden werden genomen met een 40x of 63x objectief met olie-immersie, maar de specifieke objectieflens zal afhangen van het experimentele protocol.

Resultaten

Zoals geïllustreerd in figuur 1, kunnen vellen keratocyten opgemerkt migreren uit onder de omvang binnen uren van vaststelling van explantaatkweek. Af en toe kan een individueel migreren keratocyte die weg heeft gebroken van het collectief migreren plaat in acht worden genomen. Bovendien, als het explantaat werd vastgesteld uit een vis die eerder geplukt, zijn er overvloedige neutrofielen migreren door het vel. Bij periodes langer cultuur, de keratocyte vel fragmenten als cellen ondergaan EMT ^14.

Discussie

De meest kritische stap voor het succes van keratocyte explantaatkweek is waardoor de schaal te houden aan de kweekschaal gedurende ongeveer 2-3 min vóór toevoeging van het kweekmedium. Ongeveer 75% van de schalen zal zich houden en te groeien vellen (het aantal vastgesteld voor elk experiment culturen zullen moeten worden aangepast). Keratocyte vellen geen deel om elke schaal verwijderd uit de vis en in cultuur om verschillende redenen. Eerst DAPI kleuring van explantaten blijkt dat sommige schalen weinig gehechte cell...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1.5 mm dikte is het beste voor het verwijderen van de dekglasjes. 14 mm diameter biedt meer kweekoppervlak.
Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	We vinden dat smalle, fijne pincetten het beste werken voor het verwijderen van schilfers.