Semi-high throughput screening voor Potentiële Droogte-tolerantie in Sla ( Lactuca sativa) Kiemplasmacollecties

Samenvatting

Dit protocol is ontwikkeld om een grote verzameling kiemplasma van het bladgroente sla (Lactuca sativa L.) te screenen op droogtetolerantie, om een kleine kandidaat pool van sla te identificeren voor gebruik in fysiologische, moleculaire en genetische studies om onderliggende droogtetolerantie kenmerken te identificeren samen met fokprogramma's.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode waarmee een grote collectie van het bladgroene groentegewas sla (Lactuca sativa L.) werd gescreend op waarschijnlijke droogtetolerante eigenschappen. Beschikbaarheid van zoet water voor landbouwgebruik is een groeiende zorg in de Verenigde Staten en in veel regio's van de wereld. Kortetermijn droogte-evenementen, samen met regelgevende interventie in de regulering van waterbeschikbaarheid, gekoppeld aan de dreiging van langetermijn klimaatsveranderingen die kunnen leiden tot verminderde neerslag in veel belangrijke landbouwgebieden, heeft de noodzaak vergroot om de ontwikkeling van gewassen te versnellen die zijn aangepast voor verbeterde watergebruiksefficiëntie om de productie in de komende jaren te behouden of uit te breiden. Dit protocol is niet bedoeld als een stapsgewijze handleiding voor het identificeren op fysiologisch of moleculair niveau van droogtetolerante eigenschappen in sla, maar is eerder een methode die is ontwikkeld en verfijnd door het screenen van duizenden verschillende slasoorten. De aard van dit screen is gedeeltelijk gebaseerd op gestroomlijnde metingen die zich richten op slechts drie indicatoren voor waterstress: relatieve waterinhoud van bladeren, verwelking en differentiële plantengroei na droogtestress. Het doel van het snel screenen van een grote germplasm-collectie is om het kandidaatpool te verkleinen tot een punt waarop meer intensieve fysiologische, moleculaire en genetische methoden kunnen worden toegepast om specifieke droogtetolerante eigenschappen in het laboratorium of veld te identificeren. Kandidaten kunnen ook direct worden opgenomen in veredelingsprogramma's als een bron van droogtetolerante eigenschappen.

Inleiding

Waterbeschikbaarheid voor irrigatie is al decennialang een zorgpunt in veel delen van de Verenigde Staten en wereldwijd, maar onderzoek naar de reactie op droogtestress, samen met andere abiotische stressen, liep grotendeels achter bij het werk op het gebied van ziekte- en insectenresistentie, op industrieel, academisch en overheidsniveau, grotendeels vanwege een gebrek aan financiering. Waterbeschikbaarheid voor landbouw is historisch gezien alleen een bijzaak geweest op het niveau van beleidsmakers. Recentelijk, als gevolg van verschillende ernstige droogtes in belangrijke landbouwproductiegebieden in zowel de Verenigde Staten als Australië^1,2, is de beschikbaarheid van zoet water in de schijnwerpers komen te staan op zowel nationaal als internationaal niveau, wat heeft geleid tot veel meer middelen die zijn gericht op onderzoek naar de ontwikkeling van droogtetolerante cultivars van de belangrijkste graangewassen. Hoewel deze verschuiving van focus naar de ontwikkeling van droogtetolerante belangrijke gewassen nuttig is, zijn speciale gewassen, net als veel andere gebieden van plantenonderzoek, grotendeels achtergelaten.

Een ernstige droogte beperkt momenteel de groenteproductie in Californië, het grootste productieregio voor Sla (Lactuca sativa L.) in de Verenigde Staten³. Deze kortetermijnweerpatronen in combinatie met wetgevende en gerechtelijke actie, samen met langetermijnklimaatverandering^4,5 hebben gecombineerd om het water dat beschikbaar is voor landbouw in veel van de meest productieve regio's van Californië te verminderen. Slaproductie in Californië vertegenwoordigt een industrie van 1,5 miljard dollar en is goed voor bijna 80% van de slaproductie in de Verenigde Staten³. Bladgroenten hebben een hoog bladwatergehalte en sla, in het bijzonder, heeft een ondiep wortelsysteem^6,7 wat de gewas kwetsbaar maakt voor waterstress. Bij sla, net als bij alle gewassen, zal de ontwikkeling van droogtetolerante variëteiten steeds belangrijker worden naarmate de beschikbare zoetwatervoorraden voor irrigatie beperkter worden⁸.

Dit protocol legt een methode uit waarbij een eerste screening werd uitgevoerd op een grote verzameling slagermplasma om een pool van potentieel droogtetolerante kandidaatlijnen te identificeren voor gebruik in fysiologische, moleculaire en genetische studies om specifieke droogtetolerantie-eigenschappen te identificeren. Deze kandidaten kunnen ook direct worden gebruikt als bronnen van droogtetolerantie in veredelingsprogramma's om het watergebruiksrendement in commerciële cultivars te verbeteren. Dit protocol werd specifiek ontwikkeld om de uitdagingen aan te pakken die zich voordoen tijdens het verloop van elke screening van een uitgebreide germplasmaverzameling, met name kwesties van ruimtelijke beschikbaarheid en arbeid. Ook werd het protocol zoals gepresenteerd ontwikkeld voor gebruik bij sla, maar is met succes aangepast voor gebruik bij de screening van een verzameling spinaziegermplasma (Spinacia oleracea) voor potentiële droogtetolerantie en zou eenvoudig kunnen worden aangepast om elke bladgroentegewas te screenen.

Een belangrijke overweging voordat een droogtetolerantiescherming wordt gestart, is om te begrijpen wat deze methode wel en niet is. Dit protocol is bedoeld om een snelle methode te vertegenwoordigen waarmee een grote germplasmapoel snel en efficiënt kan worden beperkt tot een beheersbaar aantal kandidaat-germplasma voor gebruik in meer gerichte en grondiger studies om individuele tolerantie-eigenschappen te identificeren. Dit protocol onderwerpt de planten aan een snel opgewekte ernstige waterstress in tegenstelling tot een meer natuurlijk langzaam opgewekte matige continue droogtestress die onder veldcondities zou worden waargenomen. Het type reactie dat binnen de plant wordt geïnduceerd tijdens deze twee soorten waterstress-evenementen (snelle uitdroging versus natuurlijke droogte) is niet identiek⁹ wat zou kunnen leiden tot de uitsluiting van sommige materialen van toekomstige proeven. Deze twee stressgebeurtenissen hebben echter geen overlap¹⁰ en dit protocol zou moeten dienen als een effectieve manier om potentieel droogtetolerant germplasma te identificeren dat zich binnen een grote verzameling bevindt. Dit protocol alleen mag niet worden beschouwd als voldoende om met een hoge mate van zekerheid germplasma te identificeren dat duurzame droogtetolerantie bevat onder veldwaterstress-condities, maar het vertegenwoordigt een belangrijke stap vooruit in het snelle screenen van bladgroene groenten op potentiële droogtetolerantie-eigenschappen.

Protocol

1. De aanplant

1. Vul plug trays (128 cel; 28 x 54 cm met cellen 3 cm in het vierkant en 5 cm diep) met stekker bodem mix. Om te helpen in uniform vullen van cellen comprimeren bodem in elke lade met behulp van een lege stekker lade.
2. Plant slazaad ¼ inch in de diepte 2-3 zaden per cel. Plant alle experimentele lijnen in gerepliceerde trays te bieden zowel een droogte gestresst en controle trays voor de droogte proef.
3. Plaats plug trays in een bodemprofiel zonder gaten.
4. Water bakjes en deksel met omgekeerde bak of plastic koepel. Kieming komt normaal voor in 48-72 uur. Na kieming verwijder het deksel en trays verhuizen naar kas.
   LET OP: Dit protocol kan ook in groeikamers worden uitgevoerd.

2. Groei en Plant Care

1. Water trays als nodig is 1-4 weken na het ontkiemen, normaal gesproken is dit 2-3 keer per week, door het invullen onderste lade en het toestaan ​​van de bodem te verzadigd raken (~ 1 uur) stralen te zitten voor langere tijds in het water, want dit kan een negatieve invloed gezondheid van planten en ontwikkeling van de wortels en kan de droogte scherm beïnvloeden.
2. Bemesten trays eenmaal per week met een commerciële oplosbare 20-20-20 meststof gemengd met een snelheid van 1,5 tl / gal.
3. Dunne laden om één plant per cel 1-2 weken na het ontkiemen.

3. Initiëren Droogtestress

1. Wanneer de planten zijn vier weken oud aparte bakjes in 2 groepen. Behoudens de ene groep tot ernstige waterstress. Gebruik de andere laden als goed bewaterd controles. Water de controlegroep als in stap 2.1 gedurende het experiment. Bij de inleiding van de droogtestress te schorten bemesten alle laden voor de rest van het experiment.
2. De experimentele droogte periode optreedt meer dan een week. Op de eerste dag van de droogtestress trial (Dag 0) vult alle lagere bakken met water en laat de bodem in de stekker trays volledig verzadigd te worden dan drainwater uit trays. Verzadigen van de bodem vlak voor de start van de thij stress-periode zal helpen om elke variatie in bodemvocht tussen individuele cellen in de stekker trays minimaliseren.

4. Het uitvoeren van de Basis Droogte Stress-scherm met te meten parameters

OPMERKING: De volgende stappen geven aan hoe de drie fysiologische metingen die zullen worden opgenomen in de loop van de droogte scherm terwijl Tabel 1 geeft een overzicht van de metingen die op elke dag van de droogte-stress-proefperiode verzamelen.

1. Meet de Leaf Relative Water Content (RWC) op dag 0, 2, 4 van het proces.
   1. Clip een slaplant uit de lade en verwijder 2 bladeren.
   2. Punch 3 schijven van elk blad met een # 9 kurkboor (~ 1,6 cm diameter). Combineer blad stoten als één monster.
   3. Weeg de bladschijven, dit is het versgewicht (FW) waarde gebruikt voor de RWC berekening, dan plaatst u de schijven in een petri plaat.
   4. Voeg net genoeg gedestilleerd water om de plaat om alleow alle bladschijven te zweven. Dit is om volledig te hydrateren de bladschijven aan gezwollen gewichten te verzamelen voor RWC analyse. Laat de bladschijven te drijven gedurende 24 uur bij KT.
   5. Verwijder de nu volledig gehydrateerde bladschijven van de platen en voorzichtig droog vervolgens van de bladschijven met papieren handdoeken voor het wegen van de schijven. Noteer deze gewichten zo gezwollen gewicht (TW) voor de RWC berekening.
   6. Plaats bladschijven op een papieren doekje of laboratorium filtreerpapier schijf in een open petrischaal en droog in incubator bij 55 ° C gedurende 24 uur.
      OPMERKING: Het papier voorkomt dat de bladschijven van het naleven van de petrischaal tijdens het drogen.
   7. Weeg droog blad schijven en record als droog gewicht (DW), voor RWC berekening.
   8. Bereken RWC behulp Weatherley de formule zoals beschreven door Smart en Bingham ^11,12.
      RWC = (FW-DW / TW-DW) * 100
      FW = vers gewicht, TW = gezwollen gewicht, DW = drooggewicht
   9. Herhaal stap 4.1 voor elke kiemplasma en de behandeling in het proces.
2. Noteer de plant verwelken eenmaal daags beginnend op dag 1 van de droogtestress proces en eindigt wanneer 100% van planten verwelkt, gewoonlijk dag 4 of 5.
3. Herstel fase en groeiverschil
   1. Op dag 6, concluderen de droogte-stress-periode en de gestresste planten voer het herstel fase van het proces. Vul het onderste bakken met water en laat het door droogte benadrukte trays om te genieten gedurende 24 uur vóór het hervatten van de standaard sproeisysteem schema, stap 2.1, als de controle trays.
   2. Laat alle planten om te herstellen voor 10 dagen.
   3. Bij 10 dagen oogsten na de droogte stress het hele bovengrondse deel van elke plant en noteer de versgewicht.

Resultaten

Bij het uitvoeren van een groot scherm om een ​​populatie scheiden van de gewenste experimentele eigenschap, bij dit protocol droogte-stress-respons, de gegenereerde dienovereenkomstig gevarieerd van zeer gegevens wijzen gevoelig waarschijnlijke droogtetolerante en alle punten daartussen. Figuur 1 bevat grafieken die de aard van de resultaten die kunnen worden verwacht van dit protocol. Representatieve cultivars van drie verschillende typen sla (romaine (cos), crisphead en botersla) worden opgenomen in ...

Discussie

Overwegingen van het sample nummer voor het scherm.

Het aantal monsters nodig moet worden gebaseerd op het gewenste gebruik van de gegevens van dit scherm. Als publicatie kwaliteit van de resultaten gewenst zijn, wordt aanbevolen om 3 individuele planten (3 biologische herhalingen) van elke lijn te oogsten en het uitvoeren van een minimum van 2 experimentele herhalingen om voldoende punten te geven voor de kwaliteit van de statistische analyse. Indien het gewenste resultaat ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
plug tray 128	T.O. Plastics Hummert International	11-8595-1	Elke merk plug tray zal werken, maar gebruik dezelfde stijl van trays voor alle proeven.
lower tray (Display tray)	T.O. Plastics Hummert International	11-3305-1
plug/planting mix (Sunshine Mix #5)	Sunshine Hummert International	10-0467-1	Een andere mix kan vervangen moeten worden als dit protocol aangepast wordt aan een andere gewas.  Sunshine mix #4 werd gebruikt in spinazie proeven.
fertilizer (20-20-20)	Jack's: Professional water-soluble fertilizer Hummert International	07-5915-1	Elke meststof kan worden gebruikt, pas het type aan zoals nodig is voor het aanpassen van dit protocol aan specifieke gewasbehoeften.