De Multi-orgel Chip - Een Microfluïdische platform voor lange termijn Multi-weefsel Coculture

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om primaire cellen, weefselmodellen en punchbiopten gedurende maximaal 28 dagen te cocultiveren in een microfluïdische multi-orgaan chip. Humane dermale microvasculaire endotheelcellen, leveraggregaten en huidbiopten werden met succes gecombineerd in een gemeenschappelijke mediacirculatie.

Samenvatting

De steeds groeiende hoeveelheid nieuwe stoffen die op de markt worden gebracht en de beperkte voorspelbaarheid van huidige in vitro testsystemen heeft geleid tot een grote behoefte aan nieuwe oplossingen voor stoffentesten. Veel geneesmiddelen die van de markt zijn gehaald vanwege door geneesmiddelen veroorzaakte leverbeschadiging, onthulden hun toxische potentie pas na meerdere doses van chronisch testen bij mensen. Echter, een gecontroleerde micro-omgeving is cruciaal voor langetermijnexperimenten met meerdere doseringen, aangezien zelfs kleine veranderingen in extracellulaire omstandigheden de celfysiologie sterk kunnen beïnvloeden. We concentreerden ons binnen ons onderzoeksprogramma op het genereren van een microgeëngineerde bioreactor, die dynamisch kan worden geperfundeerd door een pomp op de chip en minimaal twee kweekruimtes combineert voor multi-orgaan toepassingen. Dit circulatiesysteem bootst de in vivo omstandigheden van primaire celculturen beter na en verzekert een stabieler, meer meetbaar extracellulair signaalrelais naar de cellen.

Voor demonstratiedoeleinden werden humane leverequivalenten, gegenereerd door het aggregeren van gedifferentieerde HepaRG-cellen met humane stellaatcellen in druppelplaten, gecocultiveerd met humane huidbiopsies gedurende maximaal 28 dagen in de microbioreactor. Het gebruik van celkweekinserts maakt het mogelijk om de huid te kweken op een lucht-vloeistof-interface, waardoor plaatselijke stoffenblootstelling mogelijk is. Het microbioreactorsysteem is in staat om deze coculturen te ondersteunen bij bijna fysiologische vloeistofstroom en volume-tot-vloeistof verhoudingen, wat stabiele en organotypische kweekomstandigheden garandeert. De mogelijkheid van langdurige culturen maakt herhaalde blootstelling aan stoffen mogelijk. Bovendien levert een vascularisatie van het microfluïdische kanaalcircuit met humane dermale microvasculaire endotheelcellen een fysiologisch relevantere vasculaire model.

Inleiding

Voor monolaag of suspensie celkweek assays voor de ontwikkeling van geneesmiddelen zijn niet de menselijke cellulaire micro emuleren en derhalve leiden tot een snelle dedifferentiatie en functieverlies in primaire humane celculturen. Tissue modellen met hogere fysiologische relevantie nodig om de werkzaamheid en veiligheid van verbindingen voorspellen alvorens toegang verleent klinische proeven. Onlangs standaard in vitro celkweek technieken hebben twee-dimensionale monolaagkweken richting driedimensionale meercellige modellen doel de in vivo weefsel micro nabootsen. Deze systemen hebben reeds aangetoond belangrijke verbeteringen naar meer nauwkeurige voorspelling van het werkingsmechanisme van verbindingen ^1,2. Bovendien passen de in vitro kweekomstandigheden om de zeer gespecialiseerde behoeften van cellen van bijzonder belang.

Onder standaard in vitro omstandigheden, verschillende belangrijke cultuur parameters, zoals nutriënten en zuurstof, verwijdering van producten accumuleren en mechanische kracht die op de cellen vaak niet goed worden geregeld in de meeste gevallen. Veel organen bezitten fysiologisch relevante concentratiegradiënten van stoffen en opgeloste zuurstof. Echter, deze sterk gereguleerd en geoptimaliseerd omstandigheden in duidelijke tegenstelling tot de oncontroleerbare diffusiegradiënten rond weefsels onder in vitro omstandigheden, leidt tot een zeer instabiele omgeving en beperken celontwikkeling ^3. Aldus regelmatiger en vooral meer kwantificeerbare in vitro omstandigheden moeten cellen levensvatbaar en gedifferentieerde houden gedurende langere perioden. Doorbloed systemen, waarbij middelgrote onderdelen regelmatig worden verwijderd en vervangen, zijn vaak beter gekarakteriseerd en controleerbaar zijn dan de statische culturen met betrekking tot de directe omgeving van de weefsels. Onder statische omstandigheden, diffusiegradiënten cel afscheidingen en kweekmedium voedingsstoffenkunnen gekweekte cellen ³ omringen. Introductie goed gekarakteriseerde medium stroomsnelheden rond de weefsels kan de cel afscheidingen te mengen met het rijke medium door perfusie. Dit maakt het genereren van gedefinieerde cellulaire micromilieus, een stabiele cellulaire fenotype en metaboliserende enzym expressie gedurende de gehele test duration ^4.

Recente ontwikkelingen in meerdere organen chip (MOC) gebaseerde systemen combineren de voordelen van een gecontroleerde mediumstroom rondom gemanipuleerde weefsel met kleine en middelgrote celmassa eisen microschaal bioreactoren, wat tot een verminderde hoeveelheid stoffen, die tijdens het testen. Meerdere microfluïdische systemen voor weefselkweek zijn tot nu toe ^5,6 beschreven. Tissue-to-vloeistof verhoudingen binnen deze systemen spelen een bijzonder cruciale rol in het simuleren van fysiologisch relevante cellulaire overspraak. Vanwege technische beperkingen, zoals het gebruik van externe pompen en media reservoirs, the totale circulerende media volume in de meeste systemen is te groot in vergelijking met het weefsel volumes. De groep Schuler et al. Waren de eersten die een regime goede verblijftijden van stoffen in de celkweek compartimenten en in vivo relevante weefsel naar fluïdum ratio ^7,8 ontwikkelen. Dit werd bereikt door het schalen van de externe reservoir tot een 96-well plaat, ook dat de "andere weefsels" compartiment. Om de circulerende media volume binnen onze MOC platform minimaliseren, we geïntegreerd een peristaltische on-chip micropomp, waardoor de noodzaak voor externe media circuits. Dit micropump kan het systeem op een instelbaar aantal media stroomsnelheden en schuifspanning tarieven ^9. Microfluïde kanaalsysteem van 500 urn breedte, 100 urn hoogte verbindt twee gestandaardiseerde weefselkweek ruimten, elk ter grootte van een enkel putje van een plaat met 96 putjes. Vasthouden aan de maten van de industrie standaard well plaaten maakt de integratie van reeds bestaande weefsel modellen die in de transwell formaat. Bovendien is de verticale positie van celkweek inserts transwell is instelbaar, zodat de teelt van weefselmodellen die niet alleen direct worden blootgesteld aan de stroming, maar kan ook worden opgetild en afgeschermd van de onderliggende stroom. Op dezelfde interface van culturen lucht-vloeistof haalbaar zijn met behulp van dit systeem.

De MOC platform is vervaardigd uit een polydimethylsiloxaan (PDMS) laag 2 mm hoog en een glas microscoop dia met een voetafdruk van 75 x 25 mm ^2, die permanent worden verbonden door lage druk plasma-oxidatie aan de vloeistofdichte microfluïdisch circuit vormen. De PDMS laag met de respectievelijke kanalen en celcultuur compartimenten wordt geproduceerd door standaard zachte lithografie en replica gieten ^9. De microfluïdische ontwerp van de MOC gebruikt tijdens dit onderzoek bestond uit twee afzonderlijke microfluidische schakelingen per chip, elk met twee cel cultuur compartimenten met elkaar verbonden door een kanaal systeem 100 micrometer hoog. Hierdoor kon de prestaties van twee afzonderlijke twee-weefsel cocultures behulp van een multi-orgaan chip. Pompen van frequenties werden aangepast tot middelgrote debieten van 40 pl / min opleveren.

Deze twee-weefsel MOC verstrekt ontwerp de mogelijkheid om een ​​lever sferoïde een huid punch biopsie in aparte ruimten cultuur coculture, zij het in een gecombineerde media circuit onder fysiologische stroomomstandigheden. Gedifferentieerde HepaRG cellen werden samen samengevoegd met humane hepatische stellaatcellen (HHSteC) in een verhouding van 24: 1 tot homogeen sferoïden te vormen. Deze verhouding werd gevonden optimaal te zijn, zoals waargenomen in eerdere experimenten ^10, ofschoon bijna tweemaal zoveel hepatocyten werden vergeleken met de in vivo situatie. De huid werd gekweekt bij een lucht-vloeistof-interface in een transwell celkweek insert, waardoor plaatselijke blootstelling stof. Deze weefselmodellen werden samen gekweekt gedurende 28 degen in het MOC aan de volledigheid van dit systeem te demonstreren. Bovendien werd de microfluïdische kanaal circuit van de chips volledig bedekt met humane dermale microvasculaire endotheelcellen (HDMEC) nauwer simuleren het vaatstelsel.

Protocol

OPMERKING: Human juveniele voorhuid werd verkregen met informed consent en ethiek goedkeuring (Ethisch Comité Charité University Medicine, Berlijn, Duitsland), in overeenstemming met de relevante wetten, van een pediatrische chirurgie na routine besnijdenissen.

1. Productie van Tissue-equivalenten voor de teelt in de MOC

1. Aggregeren HepaRG en HHSteC in opknoping druppel platen aan de lever bolletjes te genereren.
   1. Om de trypsine van HepaRG cellen gekweekt in celkweek flessen bereiken (75 ^cm2), verwijder het medium uit confluente monolaag gedifferentieerde kweken, wassen met PBS tweemaal en 3 ml 0,05% trypsine / EDTA. Incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 ° C en stop de reactie door toevoeging van 6 ml trypsine remmer.
   2. Centrifugeer HepaRG cellen bij 150 g gedurende 5 minuten, verwijder supernatant, resuspendeer de celpellet in 1 ml HepaRG celkweekmedium, en tellen cellen. Cellevensvatbaarheid moet> 90% zijn.
   3. InOm de trypsine van HHSteC cellen te bereiken, verwijder het medium uit monolaagculturen, wassen met PBS twee keer, en voeg 3 ml van 0,05% trypsine / EDTA. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C en stop de reactie door toevoeging van 6 ml trypsine remmer.
   4. Centrifugeer de HHSteC cellen bij 150 g gedurende 5 minuten, verwijder supernatant, resuspendeer de celpellet in 1 ml HepaRG celkweekmedium, en tellen cellen.
   5. Combineer HepaRG en HHSteC in een verhouding van 24: 1 in HepaRG celkweekmedium. Hiervoor celaantallen aanpassen door verdunning celsuspensies in HepaRG celkweekmedium en voeg 1 x 10 ⁵ cellen / ml HHSteC 4,8 x 10 ⁶ cellen / ml HepaRG cellen. Meng zorgvuldig.
   6. Bereid een hangende druppel plaat door toevoeging van 2 ml PBS om de hangende druppel en ontvanger plaat.
   7. Pipetteer 20 ul van de celsuspensie in elk putje van de hangende druppel plaat. Bereiden altijd ongeveer 10% meer hangende daalt dan je nodig hebt om aggregaten te halen, zoals sommige aggregaten zijn verloren during van de procedure. Plaats de plaat zorgvuldig in een 37 ° C incubator. Wacht 48 uur voor de sferoïden te vormen.
   8. Om de sferoïden te halen, moet u pipetpunten met brede punt uitgangen gebruikt of knip de uiteinden van 1 ml pipet tips met een steriel mes om de opening 2 tot 3 mm verbreden. Gebruik deze pipet tips om de bolletjes te behandelen zonder verstoring van hen.
   9. Afwassen sferoïden voorzichtig uit de hangende druppel plaat door herhaaldelijk toevoegen van 1 ml medium naar de top van de putjes van de hangende druppel plaat met een pipet. Was de plaat totdat alle bolletjes zijn afgevallen. Sferoïden zijn iets schijfvormig met een gemiddelde diameter van 300 tot 400 urn en een hoogte van 200 tot 300 urn op dit punt.
   10. Verzamel de bolletjes in de ontvanger plaat en overbrengen naar 24 goed ultra-lage bevestigingsplaten met een maximum van 20 bolletjes per putje met behulp van de voorbereide pipet tips. Pas de media delen in elk putje 0,5 ml. Gebruik 20 aggregaten te INOkeningen een MOC circuit om een miniaturisatie snelheid van 1 / 100.000 met betrekking tot in vivo cel aantallen te verkrijgen.
   11. Incubeer de sferoïden bij 37 ° C en 5% _CO2 tot gebruik in de MOC. Laat de bolletjes niet bewaren langer dan drie dagen voor het gebruik om de vergelijkbaarheid te verzekeren. Cultiveren aggregaten ten minste één dag in ultra-lage bevestigingsplaten aan de homogene bolletjes halen.
2. Streven een van de twee benaderingen van huidweefsel equivalenten te genereren: het gebruik van punch biopten (1.2.1) of het gebruik van kant en klare in vitro weefsel modellen (1.3.1).
   1. Snij transwells met een gloeilamp mes onder de beugel op 96-well celkweek inserts en winkel te bereiden onder steriele omstandigheden tot verder gebruik.
   2. Steriliseren voorhuid monsters in 80% ethanol voor 30 sec en snijd de ring geopend. Monsters moeten een gemiddelde hoogte van 2 mm.
   3. Gebruik een biopsie punch om biopten van 4,5 mm diameter gesneden op een gelijk miniaturiza verkrijgentie ratio voor zowel de lever en de huid. Laad de biopten in de voorbereide 96-wells transwell inserts met een pincet. Zorg ervoor dat de biopten te positioneren met de epidermale zijde naar boven.
   4. Plaats celkweek inserts met biopsieën in een ontvanger plaat met HepaRG celkweekmedium en opslag bij 37 ° C en 5% _CO2 tot gebruik in de MOC. Slaan geen monsters langer dan 2 tot 3 uur.
3. Integreren en klaar verkrijgbaar in vitro huidmodellen, gekocht bij verschillende leveranciers, in het MOC, en zorg ervoor dat ze in 96-well transwell formaat. Met de door de verkoper of, indien een co-cultuur met een ander weefsel in een verdere stap wordt overwogen, gebruikt een minimaal medium met ondersteuning voor weefsels geleverd celkweekmedium. Test de respectievelijke minimaal medium voorafgaande statische experimenten zijn vermogen om de weefsels te ondersteunen.
   1. Ophalen huid modellen uit de houder plaat en snijd de 96-well inserts onder de beugel met een gloeilamp mes.
   2. Plaats de inserts terug de ontvanger plaat en opslag bij 37 ° C en 5% _CO2 tot gebruik in de MOC. Slaan geen monsters langer dan een dag.

2. MOC Fabrication

1. Meng de PDMS en verharder in een verhouding van 10: 1 (v / v) en plaats het mengsel onder vacuüm gedurende 15 minuten om luchtbellen te verwijderen.
2. Ondertussen behandeling van een polycarbonaat plaat met siliconenrubber toevoegsel bij 80 ° C gedurende 20 min.
3. Plaats Teflon schroeven in de respectievelijke gaten van de cover-plaat om de vier PDMS-vrije celcultuur compartimenten en de zes PDMS membranen, 500 micrometer dik te maken, van de micropomp.
4. Steek de bereide afdekplaat aan de meester mal van de twee microvasculaire circuits en injecteer de ontgaste PDMS. Zorg dat er geen luchtbellen te integreren in het systeem. Als er bellen ontstaan, probeer dan om ze te verwijderen door het kantelen van het apparaat.
5. Incubeer het systeem bij 80 ° C gedurende 60 min om de PDMS-laag harden.
6. Verwijder de meester mal en de Teflon schroeven uit het apparaat en bond de PDMS laag om een glasplaatje met een 75 x 25 mm ² voetafdruk met behulp van lage druk plasma oxidatie.
7. Schroef speciale thread MOC adapters om alle vier de celcultuur compartimenten van de cover-plaat.
8. Sluit spuiten met kweekmedium aan vrouwelijke Luer x ¼-28 mannelijke adapters en schroef ze aan de MOC-adapters van de cover-plaat.
9. Injecteren het medium in de microfluïdische circuit door herhaaldelijk naar beneden te duwen en te trekken tot de spuiten plunjers.
10. Controleer de juiste vulling van de kanalen met medium onder de microscoop.

3. endothelialisering van de MOC

1. Vóór het MOC, flush elk MOC circuit met endotheelcellen groeimedium endothelializing en incubeer het statisch gedurende drie dagen bij 37 ° C en 5% _CO2.
   1. Steriliseren de MOC met behulp van een ethanol vegen en leg ze onder een laminaire stroming bankje. Ikn Bovendien steriliseren twee paar pincetten en twee hexagonale sleutels voor verder gebruik.
   2. Draai de doppen van de weefselkweek compartiment van de MOC met behulp van de zeshoekige sleutels en verwijder de doppen met behulp van de tang. Nadat de drager, schroefdoppen terug naar het MOC dezelfde manier.
2. Om de trypsine van humane dermale microvasculaire endotheelcellen (HDMEC) bereiken, verwijder het medium uit de monolaag culturen wassen met PBS tweemaal en 3 ml 0,05% trypsine / EDTA. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C en stop de reactie door toevoeging van 6 ml trypsine remmer.
3. Centrifugeer de HDMEC bij 220 xg gedurende 5 minuten, verwijder supernatant, resuspendeer de celpellet in 1 ml van endotheliale celgroei medium en tellen cellen. Cellevensvatbaarheid moet> 90% zijn.
4. Stel het aantal cellen in de celsuspensie tot een eindconcentratie van 2 x 10 ⁷ cellen / ml te verdunnen met endothele celgroei medium en breng 250 ui aanEen 1 ml spuit. Breng deze concentratie van cellen om de MOC aan de miniaturisatie van 1 / 100.000 voor alle organen te houden.
5. Sluit de spuit aan een vrouwelijke Luer x ¼-28 male adapter, de lucht te verdrijven uit deze montage, en schroef het om een ​​speciale thread MOC adapter. Sluit de adapter aan één van de twee compartimenten van elk MOC circuit.
6. Sluit een lege injectiespuit op dezelfde manier het tweede compartiment van het MOC circuit.
7. Injecteer de cellen gelijkmatig door naar beneden te duwen en te trekken tot de twee injectiespuitzuigers meerdere malen in een opeenvolgende manier. Controleer de infusie van cellen onder de microscoop.
8. Incubeer de MOC bij 37 ° C en 5% _CO2 onder statische omstandigheden gedurende 3 uur om de cellen te hechten aan de kanaalwanden.
9. Verwijder de chip uit de incubator, plaats het onder een laminaire stroming bankje, en vervang het spuiten en de MOC-adapters met een speciale draad MOC celcultuur kamers.
10. Voeg 400 ul van vers medium tot een comcompartiment van elk MOC circuit en laat het spoelen door de kanalen door hydrostatische druk. Daarna vervangt het medium in beide compartimenten met 300 pl vers medium.
11. Sluit de compartimenten met behulp van caps, zoals beschreven in 3.1.2.
12. Sluit de chip aan de controle pompunit. Stel de pomp- snelheid op een frequentie van 0.475 Hz en cultiveren de chip bij 37 ° C en 5% _CO2.
13. Vervang het medium van elke MOC plaats elke 1-2 dagen en toezicht op de celmorfologie met lichtmicroscopie.

4. Laden van de Chip

1. Plaats de MOC onder de laminaire stroming bank en open deze, zoals beschreven in stap 3.1.2.
2. Verwijder de media uit de weefselkweek compartimenten en het vervangen met 300 ul van verse HepaRG celcultuurmedium.
3. Transfer 20 voorgevormde sferoiden een weefselkweek compartiment van elke MOC circuit met behulp van de pipet tips met een brede opening (zie stappen 1.1.8 / 9). Sluiten Cap behulp van een tang en zeshoekige toetsen.
4. Transfer 96-well celkweek inserts met huid equivalenten om de resterende weefselkweek compartiment van elke MOC circuit met behulp van een tang. Zorg belvorming onder het membraan van de huidequivalent voorkomen. Om dit te doen, plaatst transwells op een iets gekanteld hoek en duw naar beneden. Verwijder overtollig medium rond de transwell geduwd up van onderen met een pipet.
5. Sluit de dop met behulp van een tang en zeshoekige toetsen.

5. Aansluiten van de chip naar de Pump Control Unit

1. Stel operationele parameters in de regeleenheden de gewenste waarden. Wijzigen luchtdruk van 0 tot 8000 mbar, vacuüm van 0 tot -800 mbar en pompen frequentie 0,24-2,4 Hz. Stel de pompen richting met de klok mee of tegen de klok in.
2. Verwijder de MOC die weefsel equivalent van onder de laminaire stroming bank en sluit deze aan op de controle pompunits.
3. Naar aanleiding van de numeration op de buizen, plaatst luchtdruk slang aan op de respectieve beslag op de MOC.
4. Cultiveren MOC bij 37 ° C en 5% _CO2 in een incubator of in het geval van levende weefsel imaging, gebruikt de MOC steun om de chip te verwarmen tot 37 ° C en cultiveren van de chip buiten de incubator. Gebruik de verwarmde steun aan cellen in het MOC kweken onder een standaard microscoop.

6. Het uitvoeren van Media Exchanges, bemonsteren media en de blootstelling aan stoffen

1. Routinematige media uitwisseling elke dag of om de andere dag, gezien de aard van het weefsel gekweekt en de metabole activiteit van de cellen.
   1. Haal de MOC uit de incubator en observeer het onder de microscoop om media debieten beheersen en controleren op vervuiling.
   2. Koppel de MOC uit de pompregelunit door de stekker van de luchtdruk slang. Steriliseren de MOC met behulp van ethanol doekjes en zet het onder de laminaire stroming bankje.
   3. Open de weefselkweek compingartment die de lever sferoïden, zoals beschreven in stap 3.1.2.
   4. Verwijder tot 200 pi van het compartiment met een pipet zonder verstoring van de sferoïden en bewaar het medium in een lege put van een deep-well plaat. Direct Analyseer de media monster of sluit de deep-well plaat en bewaar de media monsters bij -80 ° C voor verdere analyse.
   5. Vervang het medium van de MOC met maximaal 250 ul vers celcultuurmedium en sluit het deksel. Het verschil in de hoeveelheid medium verwijderd en vervangen rekeningen verlies bij kleine hoeveelheden lekt uit de chip bij het sluiten van het systeem.
   6. Open de dop van de weefselkweek compartiment houdt de huid equivalenten op dit punt om te controleren of het weefsel intact. Zorg luchtbellen niet in te brengen. Sluit de dop.
   7. Sluit de slang van de pompregelunit het MOC, volgens stap 5.3, en plaats het MOC in een incubator.

7. Analyseer Daily Media Monsters en Perform Online Analyse

1. Analyseer weefselkweek prestaties on-line met behulp van live cell imaging of offline, door analyse van de dagelijkse media monsters. Voer de laatste door standaard routine enzymatische assays (bijv lactaat dehydrogenase (LDH) activiteit) of ELISA (bijvoorbeeld albumine concentratie). Een online analyse wordt hierna beschreven.
2. Verwijder de media van het endotheel MOC, zoals beschreven in de stappen 6.1.1 tot en met 6.1.4, en te vervangen in zowel weefselkweek compartimenten met 200 ul van 10 ug / ml fluorofor geconjugeerd geacetyleerd low-density lipoproteïne (LDL) oplossing (verdund in celcultuurmedia).
3. Sluit de doppen. Sluit de MOC de pompregelunit, volgens stap 5.3 en pomp gedurende 30 minuten bij 0,475 Hz tot de oplossing gelijkmatig binnen het microfluïdische circuit verdelen.
4. Stop de pompen en incubeer de MOC statisch gedurende 3,5 uur bij 37 ° C en 5% _CO2.
5. Vergelijkbare to stap 7.2, verwijder de geacetyleerd LDL-oplossing van beide compartimenten en te vervangen door 400 ul vers medium in een van de twee compartimenten.
6. Wacht 3 tot 5 min te laten de hydrostatische druk drijven het medium door de microfluïdische kanaal circuit.
7. Vervang het medium dat door is gestroomd met 300 ul vers medium en ook de tweede weefselkweek compartiment te vullen met 300 ul van vers medium.
8. Sluit de MOC, volgens stap 3.1.2. Zet die onder een fluorescentie microscoop en observeren celgroei en levensvatbaarheid.
9. Plaats de gekleurde MOC terug in de couveuse te blijven telen. Verwijder de vlek lekt uit de cellen met elkaar volgende media vervanging.

8. Ophalen Tissue equivalenten van de MOC en uitvoeren End-point Analyses

1. Ophalen weefselequivalenten van het MOC aan het einde van het experiment eindpunt analyses.
   1. Om de lever en de huid e ophalenquivalents uit de MOC, verwijder de media uit elke weefselkweek compartiment, zoals beschreven in de stappen 6.1.1 tot en met 6.1.4.
   2. Verwijder de inzetstukken 96-well celkweek die de huid tegen de MOC behulp van een tang. Trek het membraan voorzichtig uit de insert door aangrijpende het aan de ene kant met een pincet en trekt het naar beneden. Let er dan op de huid gelijk op dit punt te verliezen.
   3. Bevries het membraan met de huid equivalent in cryo inbedden verbinding en bewaren bij -80 ° C tot verdere analyse.
2. Verwijder de lever equivalenten op dezelfde manier uit de weefselkweek compartiment door pipetteren ze met behulp van cut pipetpuntjes (zie stap 1.1.8 / 9).
   1. De lever sferoiden insluiten in cryo inbedding verbinding. Zorg te veel vloeistof niet over te dragen en te verwijderen overtollige vloeistof met een pipet. Nadat de sferoïden op de inbedding verbinding en verwijderen van het medium nog extra cryo verbinding op de bovenkant van de sferoïden deze volledig omsluiten.
   2. Bevries de lever equivalenten en bewaren bij -80 ° C tot verdere analyse.
3. Voer eindpuntanalyse hierdoor de weefselequivalenten in een cryo-microtoom tot 8 urn en kleuring voor weefselspecifieke merkers, zoals beschreven in eerdere protocollen ^10.

Resultaten

Standaard in vitro weefselculturen worden uitgevoerd onder statische omstandigheden, beperkt de diffusie van zuurstof en voedingsstoffen naar de weefsels. Vloeibare systemen, waaruit blijkt verbeterde aanbod kenmerken, worden vaak gehinderd door hun grote medium eisen, met niet-fysiologisch hoge medium om weefsel ratio's. Aldus zijn metabolieten verdund en cellen niet in staat hun omgeving conditioneren. De in deze studie MOC verbindt twee afzonderlijke weefselkweek compartimenten, elk ter grootte van een enkel putje van een standaard 96-putjesplaat, met een microfluïdische kanaalsysteem. De kleine omvang van het systeem en de integratie van de pomp op de chip kan het systeem werken bij media volume van slechts 200 tot 800 pl. Dit komt overeen met een totale systemische medium weefsel verhouding van 8: 1 tot 31: 1, respectievelijk, de lever en huidweefsel hulpkweken (met een totaal volume weefsel van ongeveer 26 ui). De totale extra-cellulair volume vloeistof in een man met een gewicht van 73 kg 14,6 L, waarvan de intercapillary fluïdum volume 5,1 L, leidt tot een fysiologische extracellulaire vloeistof weefsel verhouding van 1: 4. Daarom is de hoeveelheid media in het circulatiesysteem van het MOC nog groter dan bij de fysiologische toestand; En toch is de kleinste media weefselverhouding dusver gerapporteerd voor meerdere orgaansystemen ^5. Als industriestandaard weefselkweek formaten worden bewaard, onderzoekers zijn in staat om de bestaande en reeds gevalideerde statische weefsel modellen combineren binnen een gemeenschappelijke vloeistofstroom. Figuur 1 toont het schema van een experimentele set-up van mogelijke MOC enkele weefsel of multi-weefsel cocultures. Primaire weefselbiopten en in vitro -generated weefsel equivalenten van cellijnen of primaire cellen kunnen worden gekweekt, hetzij met behulp van 96-well celkweek inserts of door ze rechtstreeks te plaatsen in de weefselkweek compartimenten. Als het kanaal systeem onderling verbinden van de celcultuur compartimenten is slechts 100 μm hoog is, zal het weefsel equivalent van meer dan deze dimensies binnen de cultuur compartimenten worden gehouden. De endothelialisering van de MOC circuit met primaire HDMECs maakt een verdere stap voorwaarts in de richting van meer fysiologische kweekomstandigheden door een biologische vasculaire structuur.

Figuur 1:. Schematische weergave van MOC culturen Tissue equivalenten worden bereid onder standaard in vitro omstandigheden, geënt in het MOC en gecultiveerd als één cultuur of cocultures onder dynamische omstandigheden. Dagelijks media monsters en eindpunt analyses worden uitgevoerd. Luchtdruk naar de pomp te rijden wordt toegepast door de drie blauwe buizen aangesloten op de MOC van boven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Na het endotheel protocol wordt een confluente HDMEC dekking van de microfluïdische kanaal circuit verkregen binnen vier dagen dynamische cultuur, zie figuur 2. Cellen gemakkelijk aan de wanden van de MOC kanaal maakt een confluente monolaag en langwerpig langs de afschuiving stress (Figuur 2B). Voorts cellen de gehele omtrek van de kanalen, zoals eerder vermeld ^9. Geen verdere wijziging endotheliale morfologie werd waargenomen na vier dagen kweken tot het eind van de cultuur.

Figuur 2:. Endotheel MOC kanalen humane dermale microvasculaire endotheelcellen (HDMEC) vormde een confluente monolaag in de microfluïdische circuit. Cellen werden gekleurd met geacetyleerd LDL na 23 dagen van de MOC cultuur. (A) Het hele microvascular circuit was bedekt met cellen en (B) cellen verlengd langs de schuifspanning. Schaalbalken: (A) 1,000 urn en (B) 100 urn.

In een verder experiment consistent schijfvormige levercel sferoïden gevormd uit HepaRG en HHSteC gedurende twee dagen opknoping druppel cultuur, dit modelsysteem eerder gerapporteerd als geschikt voor geneesmiddelmetabolisme studies ^11-13. Ter demonstratie, een weefselkweek compartiment van elke MOC circuit werd geënt met 20 sferoïden in 96-well celkweek inserts en weefsels werden gekweekt gedurende 14 dagen onder dynamische omstandigheden met een niet-endotheel MOC. Elk aantal aggregaten of hoeveelheid primair materiaal kan geïntegreerd worden hetzij rechtstreeks in de compartimenten of via celkweek inserts. Immunofluorescentiekleuring van de bolletjes na het ophalen van de MOC toont een sterke, homogene uitdrukking voor liVer-typische cytokeratine 18/08 en fase I enzymen cytochroom P450 3A4 en 7A1 (figuur 3A en 3B). Kleuring van canaliculaire transporter multi-drug resistentie eiwit 2 (MRP-2) onthulde een gepolariseerde fenotype en de aanwezigheid van rudimentaire galcanaliculi-achtige netwerken (Figuur 3C).

Figuur 3 :. Kweken van menselijke kunstmatige lever micro-weefsels in het MOC. Lever aggregaten gekweekt voor 14 dagen in het MOC werden gekleurd voor (A) cytokeratin 8/18 (rood) en (B) cytochroom P450 3A4 (rood) en 7A1 (groen). (C) Expressie van canaliculair transporter MRP-2 (groen), blauw nucleaire kleuring. Schaalbalken: 100 micrometer.

Omdat de productie van albumine is een essentiële voorwaarde van leverweefsel culturen heeft been geselecteerd om de lever-typische activiteit in de MOC bewaken. Analyseren dagelijkse media monsters albumine productie toont een aanzienlijke toename productiesnelheid in MOC kweken vergeleken met statische kweken (figuur 4) en waarden in de literatuur ^11. De toename van de eiwitsynthese snelheid kan worden toegeschreven aan de verhoogde zuurstof en voedingsstoffen in MOC culturen. Vandaar de MOC kan lever aggregaten gedurende een kweekperiode van 14 dagen handhaven in metabolisch actieve toestand, verbetering lever typische gedrag, zoals albumine productie.

Figuur 4: Veertien dagen lever spheroïde prestaties in de MOC albumine productie van de lever enkele weefsel culturen in het MOC en in statische cultuur.. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM (n = 4).

Subsystemic herhaalde dosis toxiciteit testen van chede chemicaliën en cosmetica bij dieren vergt 21 tot 28 dagen na de blootstelling, zoals gedefinieerd door de OESO-richtsnoer nr. 410 "herhaalde dosis huidtoxiciteit: 21/28-daagse studie." Long-term huid-lever cocultures zijn hier een voorbeeld voor maximaal 28 dagen om te gaan met regelgeving. Een lucht-vloeistof interface is voorzien voor latere blootstelling van de huid stof door het cultiveren huidbiopsies in 96-well celkweek inserts. De co-cultuur experiment wordt exemplarisch uitgevoerd endotheel MOC te bewijzen of drie weefsel coculture in een gecombineerde media circuit levensvatbare en metabolisch actief dan 28 dagen kan worden bewaard.

Analyse van de LDH-activiteit in de media supematanten bleek een gestaag dalende gedurende de eerste acht dagen van de cultuur, die op ongeveer 80 U / l daarna (Figuur 5) constant bleef. Dit geeft een kunstmatig maar stabiele omzet weefsel in het systeem op latere tijdstippen. Vergelijking van de drie-weefsel coculture lever enkelvoudige-Tissue en lever-endotheelcellen coculture experimenten, kan een significant af LDH niveau ligt, vooral tijdens de eerste dagen van kweken zonder de huid. Celdood in deze eerste periode van hoge LDH activiteit kwamen voornamelijk in de huid kweek compartiment, zoals huid enige weefsel MOC kweken bleek (gegevens niet getoond). Dit kan te wijten zijn aan het gewonde gebied rond de biopsie als gevolg van het ponsen van de huid.

Figuur 5: Vijftien dagen weefsel prestaties in de MOC LDH-activiteit in de media supernatanten van de lever enkele weefsel culturen (MOC Li), lever culturen in endotheel MOC (MOC Li-Va) en de lever-huid cocultures in endotheel MOC (MOC Li. -va-Sk). Gegevens zijn gemiddelden ± SEM (n = 4).

Gedurende de 28 dagen cultuur periode lever sferoïden gehecht aan de bodem van de MOC eennd cellen is gegroeid uit, de vorming van een meerlaags verbinding tussen aangrenzende bolletjes. Dit leverde weefsel functionaliteit niet belemmeren. Eindpuntanalyse door immunofluorescentie bleek dat lever sferoïden nog metabolisch actief na 28 dagen MOC coculture zoals door cytochroom P450 3A4 kleuring (figuur 6A). HHSteC werden gedurende de gehele lever gelijk verdeeld, zoals door vimentine kleuring (Figuur 6B). Een toename vimentine kleurintensiteit kan worden waargenomen in gebieden waar de cellen van sferoïden gegroeid. Kleuring voor von Willebrand factor (vWF) aan dat endotheliale cellen niet diep was doorgedrongen in het weefsel, maar waren in direct contact cel-cel met de buitenste hepatocyten (figuur 6C).

Immunohistochemie kleuring van de huid biopten toonden expressie van tenascine C en collageen IV in de basale membraan (figuur 6D), terwijl kleuring van de statische controle toonde elevated niveaus van tenascine C (figuur 6E). Tenascin C is aangetoond tijdens wondgenezing, ontstekingsprocessen en fibrose opgereguleerd, suggereert geïnduceerde fibrotische processen statisch, maar dynamische culturen ^14,15.

Stabiele levensvatbaarheid en functie van weefsels na een 28 dagen co-cultuur in het MOC cel bewijzen dat het systeem kan een combinatie van tot drie weefsels in een gemeenschappelijk medium circuit handhaven. Primaire cellen, evenals weefselmodellen en biopsieën kunnen gelijktijdig worden gekweekt in het MOC systeem.

Figuur 6:. Prestatie van multi-weefselcultures gedurende 28 dagen equivalenten lever en huid biopten werden een endotheel MOC en celfunctionaliteit gekweekt werd aangetoond door immunokleuring van (A) Fase I enzymen cytochroom P4503A4 (rood), (B) vimentine (rood), (C) cytokeratin 8/18 (rood) en vWF (groen) in het leverweefsel. Huidbiopsies gecocultiveerd gedurende 28 dagen (D) in de MOC of (E) onder statische omstandigheden werden gekleurd voor tenascin c (rood) en collageen IV (groen), blauw nucleaire kleuring. (F) H & E kleuring van de huid na 28 dagen van MOC cultuur. Schaalbalken: 100 micrometer.

Discussie

De MOC platform hier beschreven staat voor een stabiele en krachtige tool voor het kweken van weefsels van verschillende oorsprong bij dynamisch medium stroom omstandigheden gedurende langere perioden cultuur ^10,16. In dit voorbeeld werd het platform gebruikt om primaire cellen (HDMEC), weefselequivalenten gegenereerd uit een cellijn (lever aggregaten), en een co-cultuur van de genoemde met een weefselbiopsie cultiveren. De MOC kon drie weefsel coculture houden tot 28 dagen in een gecombineerd medium circuit. Naar beste weten van de auteurs, dit is de eerste keer dat een multi-weefsel coculture zoals biopsies, primaire cellen en cellijnen werd uitgevoerd gedurende vier weken.

Een van de belangrijkste nadelen van microfluïdische systemen is de affiniteit van kleine moleculen hechten aan het oppervlaktemateriaal van de fluïdumkringloop. Het oppervlak volumeverhouding bijzonder hoog in microfluïdische systemen, dit effect wordt nog meer uitgesproken ¹⁷ . De stabiele HDMEC dekking van de kanalen, hier geïntroduceerd, kunnen fungeren als een biologische barrière voorkomen van de hechting van moleculen aan het MOC. Bovendien kan het dienen als hemocompatibele vat van bloed circulatie, waardoor bloedstolling. Echter, het gebruik van volbloed als medium vervanging niet mogelijk een volledig vascularisatie van het orgaan equivalenten nog niet bereikt. Bestaand werk op de vascularisatie van in vitro -generated weefsels is veelbelovend en begeleidt de weg vrij voor verdere studies ^18,19.

Het is bekend dat hepatocyten neiging om hun lever-specifieke functies verliezen over tijd onder statische tweedimensionale in vitro kweekomstandigheden ^20. Enzymen zoals cytochroom P450 familie, zijn van bijzonder belang is indien het metabolisme van een bepaald geneesmiddel te bestuderen. Cytochroom P450 3A4, een enzym met betrekking tot de biotransformatie van vele xenobiotica en cytochroom P450 7A, which is betrokken bij galzuur synthese werden uitgedrukt in lever aggregaten gekweekt in MOC dan 14 dagen. Dit geeft aan het behoud van een metabolisch actief fenotype, waardoor het metabolisme studies. De verhoogde albumine productiesnelheid van aggregaten in het MOC in vergelijking met statische culturen is een extra aanwijzing voor een adequate kweekomstandigheden. De albumine productiesnelheden waargenomen tijdens deze studie waren vergelijkbaar of zelfs hoger dan eerder gerapporteerde waarden verkregen door microfluïdische chips met HepG2 cellen ^21-23 echter waarden niet die van primaire menselijke hepatocytculturen ²⁴ te bereiken. Bovendien is het MOC systeem in zijn tijdelijke indeling laat geen afzonderlijke scheiding van gal. Cellen in totaal gepolariseerd en gevormd galcanaliculi structuren, zoals getoond door MRP-2 kleuring. Echter zijn deze kanaaltjes niet op een technisch kanaal verzamelen gal. Deze niet-fysiologische mixing van de gal met het bloed compartiment heeft in een toekomstige herinrichting van het systeem moeten worden aangepakt.

De aanpassing van de vloeieigenschappen van groot belang ^25, vooral met betrekking tot weefsels gevoelig voor afschuifspanning, zoals de lever. De hoeveelheid schuifspanning waargenomen door het weefsel kan worden aangepast op twee manieren: Ten eerste kan de luchtdruk te duwen langs de membranen van de pomp verlaagd, aflopend piek afschuifspanning waarden in het systeem. Ten tweede kunnen de weefsels worden ingebed in een extracellulaire matrix gelaagdheid of gekweekt in Transwell cultuur inserts. Deze beschermen de weefsels van de onderliggende stroom met een poreus membraan. Deze aanpassingen moeten worden uitgevoerd op individuele basis voor elk orgaan gelijke voordat het MOC experiment. Bij een pulserende werking van 2.4 Hz, bijvoorbeeld, die overeenkomt met een hoge, maar toch fysiologische hartactiviteit van 144 slagen / min bij mensen, de schuifspanning gemeten in dekanalen van de microvasculaire circuit er ongeveer 25 dyn / ^cm2. Dit komt overeen met een fysiologische afschuifspanning aan de bovenkant van de schaal microvasculatuur en is derhalve goed toepasbaar voor experimenten inclusief een endothelialisatie van de kanalen. Aangezien de huidige microfluïdische inrichting van het MOC systeem gepresenteerd uit slechts één media circuit dat de twee compartimenten orgaan, een pomp- snelheid en afschuifspanning snelheid moet worden gekozen voor het gehele systeem. Daarom is een nauwkeurige aanpassing van stroomeigenschappen aan de behoeften van elk afzonderlijk orgaan is niet altijd uitvoerbaar.

Bovendien zorg worden gehouden bij de aanpassing van de cellen naar het gemeenschappelijk medium. Cellen worden gekweekt in de MOC in een gecombineerde media circuit, dus geen afzonderlijke celkweekmedium kan worden gebruikt voor elke weefselmodel, evenals de standaard in vitro celkweek. Een minimale gecombineerde media formulering moet vooraf en t definiërenhij cellen moeten stapsgewijs worden aangepast aan deze nieuwe media. Een aanpassingsprocedure van 80% / 20% oude naar nieuwe media voor twee dagen en vervolgens 50% / 50% gevolgd door 20% / 80%, en een volledige uitwisseling altijd geleid tot redelijke cellevensvatbaarheid en functionaliteit van culturen in onze handen.

De huidige microfluïdische inrichting van het MOC systeem maakt de co-cultuur van maximaal drie weefsels. Een co-cultuur van ten minste tien belangrijkste organen van het menselijk lichaam is nodig om homeostase te bereiken. Daarom is het gepresenteerde systeem kan specifiek weefsel weefsel interacties, maar niet de ware systemische reactie op een stof voorspellen. Een verdere ontwikkeling van de MOC meer organen holtes omvatten overwogen. Bovendien is de geldigheid van het systeem moet worden aangetoond met behulp van een set van referentie-verbindingen. Bij voorkeur worden verbindingen die tijdens klinisch onderzoek (zoals Troglitazone) hebben gefaald moeten worden getest op hun prestaties bij het MOC. Overwegende dat, is een echte validatie van dergelijke complexe systemen nog steeds belemmerd by het gebrek aan standaardisatie met betrekking tot biomarkers en eindpunten voor functionele evaluatie, het verzamelen van meer gegevens over de toxicologische prestaties van deze en soortgelijke systemen zal de betrouwbaarheid en het toepassingsgebied te verbreden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
HepaRG cellen	Biopredic International		ongedifferentieerde cellen
HHSteC	ScienCell Research Laboratories		cellen en alle kweeksupplementen
HepaRG Medium	Sigma-Aldrich		William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicilline 100 µg/ml streptomycine 5 µg/ml humane insuline 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortison-hemisuccinaat
HDMEC Medium	PromoCell		Endotheelcel Groei Medium MV2 met Supplement-Pack MV2 en 1% penicilline-streptomycine
Dimethyl sulfoxide	Carl Roth		voeg 2% toe aan HepaRG media
Trypsine/EDTA	Biowest
Trypsine-remmer	Carl Roth
MAXYMum Recovery Tips	Corning		1.000 µl Pipet Tips Wide Bore
384-Well Hanging Drop Plate	3D Biomatrix		Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate
Weefselkweekkolven	Corning		75 cm2
Ultra-lage aanhechtingsplaat	Corning		24-well
Transwell cellen kweek inzetstukken	Corning		96-well eenheid, 0,4 µm poriegrootte
Deep well platen	Corning		96-well, 1 ml
Biopsie punch	Stusche		4,5 mm
Glas microscoopglaasje	Menzel		afdruk van 75 x 25 mm
Polydimethylsiloxaan	Dow Corning		Sylgard 184
Siliciumrubberadditief	Wacker Chemie		Wacker Primer G790
Slangen voor luchtdruk	SMC Pneumatik GmbH		Polyurethaan-slang, metrisch
Alumin ELISA	Bethyl Laboratories		Human Albumin ELISA Kwantificeringsset
Lactaat dehydrogenase test	Stanbio Laboratory		LDH Liqui-UV kit
Alexa Fluor 594 geacetyleerd LDL	Invitrogen		1 mg/ml