Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Met behulp van de muis Mammary tumorcellen Core Biology Begrippen les te geven: A Simple Lab Module

12.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52528

⸱

18 juni 2015

 ,  , 
1Department of Natural Sciences, Marymount Manhattan College

In dit artikel

Samenvatting

Een haalbaar laboratoriummodule voor biologiestudenten die geavanceerde cellulaire en moleculaire concepten onderzoekt met behulp van dierlijke celkweek wordt beschreven. Studenten kweken, karakteriseren en manipuleren een borstkankercelmodel door blootstelling aan chemotherapiemiddelen. Celviabiliteit wordt bepaald door celtelling met behulp van zowel een standaard- als een nieuwe methode.

Samenvatting

Studenten biologie aan de universiteit moeten een verscheidenheid aan concepten en technieken uit de cellulaire en moleculaire biologie leren, begrijpen en toepassen ter voorbereiding op biomedische, graduate en professionele programma's of carrières in de wetenschap. Om dit aan te pakken, werd een eenvoudig laboratoriummodule bedacht om de concepten van celdeling, cellulaire communicatie en kanker te leren door de toepassing van dierlijke celkweektechnieken. Hier wordt de muis mammaire tumor (MMT) cellijn gebruikt om borstkanker te modelleren. Studenten leren deze dierlijke cellen te laten groeien en te karakteriseren in cultuur en testen de effecten van traditionele en niet-traditionele chemotherapie-middelen op celproliferatie. Specifiek bepalen studenten de optimale celconcentratie voor het plateren en kweken van cellen, leren hoe ze drugoplossingen bereiden en verdunnen, identificeren de beste dosering en behandelingstijd van de antiproliferatieve middelen en bepalen de snelheid van celdood als reactie op verschillende behandelingen. De module gebruikt zowel een standaard celtellingstechniek met behulp van een hemocytometer als een nieuwe celtellingsmethode met behulp van microscoopsoftware. De experimentele procedure leent zich voor open-ended inquiry aangezien studenten kritische stappen van het protocol kunnen wijzigen, inclusief het testen van homeopathische middelen en vrij verkrijgbare medicijnen. Kortom, deze labmodule vereist dat studenten het wetenschappelijke proces gebruiken om hun kennis van de celcyclus, cellulaire signaalroutes, kanker en behandelingsmethoden toe te passen, terwijl ze een reeks laboratoriumvaardigheden ontwikkelen, inclusief celkweek en analyse van experimentele gegevens, die niet routinematig worden onderwezen in de ondergraduaatklas.

Inleiding

Vaak in undergraduate algemene biologie cursussen, de onderwerpen van de regulatie van de celcyclus en kanker worden aangestipt, maar niet in detail onderzocht, omdat de breedte van de inhoud van deze cursussen laat weinig tijd voor diepte. Daarnaast worden gegradueerde biologiestudenten niet typisch blootgesteld aan geavanceerde technieken in verband met dierlijke celkweek. Om studenten te helpen ontwikkelen van een dieper begrip van deze concepten, terwijl de toepassing en het analyseren van wat ze geleerd hebben, werd een laboratorium activiteit ontwikkeld als een wijziging van het Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) uitgebreid laboratorium activiteit 1. Het laboratorium module gebruikt een stapsgewijze experimentele strategie die ook groeien en karakteriseren van een kankercel model, het ontwikkelen en uitvoeren celtelling werkwijzen vaststelling optimale tijdsverloop en doseringen voor behandeling van cellen met anti-proliferatieve middelen, en het identificeren van afwijkende cel-signalerende routes . Het experiment laat ook openen-ended onderzoek.

De meeste technieken vereist voor deze activiteit kan worden bereikt in een typisch biologisch onderwijs laboratorium. De activiteit begint met de leerlingen het karakteriseren van de morfologie en groei van de muis borsttumor (MMT) cellijn, een model voor menselijke borstkanker 2. Borstkanker werd gekozen als het model van kanker als gevolg van de prevalentie in de bevolking, de bekendheid van de college-leeftijd studenten, en de wijdverbreide beschikbare gegevens. De MMT cellijn werd speciaal gekozen omdat het gemakkelijk verkrijgbaar, goed gekarakteriseerde, een korte verdubbelingstijd en gemakkelijk te kweken. Daarnaast MMT cellen hormoongevoelige die overeenkomt met meeste vrouwelijke borstkanker. Studenten identificeerden afwijkende cel-signaalroutes in de MMT cellen door de cellen te behandelen met chemotherapie geneesmiddelen waarvan het werkingsmechanisme staat established.The concentratie van de geneesmiddelen en de lengte van de behandeling worden gevarieerd zodat leerlingenhet effect van deze variabelen op de snelheid van celdeling evalueren. De sleutel voor deze activiteit assay is de bepaling van cellevensvatbaarheid, slechts sprake celtelling, via een van twee methoden. Elke methode is afhankelijk van sterke microscopie vaardigheden. Leerlingen bepalen cellevensvatbaarheid met behulp van een standaard, hemocytometer werkwijze en een nieuwe photomicroscopy werkwijze en stelt. Op basis van hun bevindingen kunnen zij voorstellen en test modificaties de activiteit. Studenten vervolgens vertegenwoordigen hun gegevens en interpreteren van de resultaten om hun hypothese te verfijnen en ontwikkelen van nieuwe experimentele strategieën.

Dit laboratorium activiteit is geschikt voor eerstejaars of tweedejaars niveau studenten hoofdvak in de biologische wetenschappen. Het is gecondenseerd in een week lab module die in een eerste jaar kan worden afgerond, algemene biologie of tweede jaar, cellulaire / moleculaire biologie natuurlijk. Vaardigheden die nodig zijn voor een goede uitvoering van de activiteiten omvatten elementaire rekenkunde en algebra, bekendheid met een reeks van core laboratorium vaardigheden (bv, pipetteren, oplossing maken, steriele techniek), data-analyse, basis licht microscopie en time management, samen met een instructeur kennis van celcultuur en spreadsheet-software. Reagentia die nodig zijn een dier cellijn model voor kanker (bijv muizenborsttumorvirus cellen, MMT 2), chemotherapie middelen (bijvoorbeeld tamoxifen, curcumine, metformine en aspirine), trypan blauw en celcultuur media (bijvoorbeeld Eagle's Minimaal Essentieel Medium ; EMEM) met de juiste supplementen (bijv donor paard en foetaal runderserum). Instrumenten die nodig zijn onder meer een omgekeerde lichtmicroscoop met digitale camera gehechtheid, computer, 100 mm en 24 goed weefselkweek platen, CO 2 incubator (of gelijkwaardig), bioveiligheid kast (BSC; Klasse II), hemocytometer en digitale microscopie software.

Er zijn goede voorbeelden van specifieke lab activiteiten die afhankelijk diercelcultuur Teach studenten over concepten in celbiologie 3. Maar veel nodig leveringen of technieken die niet gemakkelijk toegankelijk (bv radioactieve isotopen, levend dierlijk weefsel, geavanceerde imaging apparatuur 1,4,5), beschrijven protocollen die vrij geavanceerde (bijv, geschikt voor een 400-niveau cursus 6) zijn, of vereisen multi-week of semester lang projecten 6,7. De laboactiviteit beschreven is eenvoudig en kan worden uitgevoerd in een enkele week gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur.

Kortom, dit lab module daadwerkelijk invoert of versterkt de begrippen celcyclus, cellulaire signaalwegen en kanker terwijl onderwijzen basis- en geavanceerde laboratorium vaardigheden experimentele data-analyse, de wijze van diercelcultuur en wetenschappelijke proces. Het laboratorium-module is eenvoudig en economisch toegankelijk en biedt flexibiliteit en mogelijkheid voor open-ended onderzoek. De activiteit stimuleert student creativiteitdoor een template experimentele strategie die fungeert als gids maar geen recept. Belangrijker nog, de activiteit voldoet aan alle domeinen van het leren Blooms taxonomie 8 als het vereist herinneren, begrip, het toepassen, analyseren, evalueren en het creëren door het betrekken van studenten in een proces dat ze uit het handboek en in de wereld van het wetenschappelijk onderzoek trekt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Opmerkingen: Gedrag alle werkzaamheden met cellen en celcultuur reagentia in een klasse II bioveiligheid kast (BSC) 9. MMT cellen worden geclassificeerd als Biosafety Level I, zoals ze laag tot matig biologische risico's opleveren. Breng een goede reiniging en ontsmetting procedures om de BSC tussen toepassingen (bijvoorbeeld ultraviolet licht, 70% ethanol vegen).

1. Grow MMT cellen

  1. Groeien cellen in 10 cm weefselkweekschalen met 10 ml voedselrijk medium dat bestaat uit Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM glutamine en 1% Antimycoticum / Antibioticum (10 eenheden penicilline , 100 pg streptomycine, 0,25 ug amfotericine B). Ontwikkel cellen in een bevochtigde 5% CO 2 kamer, bij 37 ° C. Plate cellen bij een dichtheid van 3,6 x 10 6 cellen / cm 2 (zie Tellen cellen in stap 2).
  2. Vervang de helft van de celkweek media met verse media elke 48 uur UNLess anders vermeld. Controleer levensvatbaarheid en morfologie cel door onderzoek met een omgekeerde fase contrast lichtmicroscoop.
    1. Opmerking en karakteriseren van cellen voor omvang, structuur, vorm, organisatie en het geschatte aantal onder 100 - 200X vergroting. Op deze dichtheid, moeten de cellen in één vlak verschijnen, niet samengeklonterd boven elkaar en in de directe nabijheid. Elke cel bestaat uit een dikke, bolvormige kern met een dunne, lange, vertakte uitsteeksels uitbreiding ervan dat een punt komen (zie figuur 1).
  3. Verdeel cellen wanneer ze een celdichtheid van 7,2 x 10 6 cellen / cm2 bereikt. Cellen vertonen een verdubbeling van 1,8 x 10 6 cellen / cm 2 per 24 uur. Wijs cellen Passage X (Px) om het aantal keren dat ze zijn gesplitst duiden.
    1. Bij generation 3 (dwz na drie passages, P3), oogsten, telling en de plaat cellen op een 24 well weefselkweek plaat bij een dichtheid van 3,6 x 10 6 cellen / cm 2.
  4. Bekijk cellen elke dag en opnemen van digitale microfoto. NB en beschrijf cel morfologie (dat wil zeggen, grootte, vorm, licht reflecterende eigenschappen). Bepaal cel verdubbeling tijd door het tellen van cellen en regelmatig met betrekking verstreken tijd om het aantal cellen.

2. Count MMT Cells

Opmerking: Tel cellen om te bepalen of de cellen moeten worden subcultuur, het opzetten van een experiment of levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Er zijn twee methoden hier gepresenteerd.

  1. Toepassing van een hemocytometer, een standaardtechniek om cellen te tellen.
    1. Verkrijg een heldere lijn hemocytometer, een oplossing van trypan blauwe kleurstof, een verbinding lichtmicroscoop, steriele reageerbuizen, pipetten en een handmatige celteller 0,2%.
    2. Onder de BSC, pipetteer 10 ml cellen uit een 10 cm weefsel kweekplaat verwijderd. Als cellen worden gekweekt op een 24 wells plaat gebruiken een pipet 1 ml of 1000 ul micropipet om de media te verwijderen.
    3. Trek cel media in de pipet, plaatst u de punt van de pipet tegen de bodem van de schaal en het verdrijven van de media tijdens het schuiven van de pipet tip over de plaat. Herhaal 4-5 keer om los cellen dissociëren klompjes en leiden tot een nauwkeuriger celgetal.
    4. Plaats de verkregen celsuspensie in een 15 ml steriele buisje (of 1 ml microcentrifuge en andere kleine volume buisje). Anders laat de cellen in de oorspronkelijke weefselkweek plaat / goed.
    5. Onder de BSC, combineer 10 pi van de celsuspensie met 10 ul van de trypan blauwe oplossing (1: 1 verhouding) in een niet-steriele microcentrifuge of andere kleine volume buis.
      Opmerking: trypaanblauw is een vitale vlek die niet wordt geabsorbeerd door gezonde levensvatbare cellen. Wanneer cellen worden beschadigd of dood, trypaanblauw kan de cel waardoor dode cellen te tellen in te voeren (aka kleurstof uitsluiting methode). Daarom is onder een microscoop, dode cellen blijken donkerpaars, terwijl levensvatbare cellen zijn een heldere en licht van kleur.
    6. Broedenbij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    7. Plaats het deksel slip op de hemocytometer. Breng 10 gl van de trypan blue-celsuspensie mengsel in de groef. Bekijk de hemocytometer op 100 - 200X vergroting. Een vierhoekige raster blijkt (zie figuur 2).
    8. Tel het aantal levensvatbare cellen (ongekleurd) versus totale cellen in elke gerasterde oppervlak. Gemiddeld de vier roosters en vermenigvuldig dat met 1 x 10 4 cellen / ml te verkrijgen.
      1. Extrapoleer het totale aantal cellen per schaal (of cellen / cm 2). Gebruik dit nummer ofwel wordt de juiste hoeveelheid van de celsuspensie gebruikt in nieuw weefselkweekplaat zaden met de gewenste dichtheid van 3,6 x 10 6 cellen / cm 2 of vast totaal aantal levensvatbare cellen op de plaat of in de put.
        Opmerking: Voor aanvullende begeleiding bij het ​​gebruik van een hemocytometer, zie 10.
  2. Gebruik software en een digitale camera om levensvatbare cellen te tellen.
    1. Zorg voor een digitale camera, de bijbehorende software, een oplossing van trypan blauwe kleurstof, een verbinding lichtmicroscoop, steriele reageerbuizen, pipetten en een computer 0,4%.
      Opmerking: Een Moticam 2000 digitale camera met bijbehorende Motic Software wordt hier toegepast. Elke vergelijkbare camera en software moet voldoende zijn. Zorg ervoor dat de digitale camera software is gekalibreerd op voorhand (volgens het protocol van de fabrikant).
    2. Onder de BSC, gebruik dan een 1 ml pipet of 1000 ul micropipet om de media van het MMT cellen groeien in een 24 well weefselkweek schotel te verwijderen. Was de hechtende cellen door voorzichtig aanleggen van een kleine hoeveelheid (ongeveer 500 ui) uit niet-aangevuld (bijv EMEM zonder toevoegingen) vers medium aan de plaat, weer te verwijderen. Breng 10 pl van 0,2% trypan blauw (gemaakt door verdunning 1: 1 met un-gesupplementeerd EMEM) rechtstreeks naar de bron.
    3. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    4. Bekijk de plaat onder de microscoop op 100 - 200X vergroting wet een digitale camera bevestigd. Plaat kan worden gewassen met ongesupplementeerd media als kleuring met 2% trypaanblauw is te donker.
    5. Open de software op de computer een nd controleren of de software is gekalibreerd om de doelstelling die via het tabblad Instellingen. Een beeld van de FOV moeten verschijnen.
    6. Selecteer het raster op het tabblad Measure. Een raster van pleinen ongeveer 0,005 cm in de breedte zal verschijnen. Rasterkleur informatie naar de oppervlakte van elk vierkant bevestigen.
    7. Kies een bepaald gebied van het raster om cellen te tellen (dat wil zeggen 5 x 9 vierkantjes vierkanten). Selecteer de rechthoek uit het tabblad Measure. Klik op de hoek van een vierkant en sleep de cursor naar de pleinen van de keuze omvatten.
      Opmerking: Een schaduw van groen zal de pleinen van keuze en een witte doos zal verschijnen in de hoek dat de breedte, hoogte, het gebied biedt, en de omtrek van de sectie van de gekozen raster te dekken (zie figuur 3).
    8. Tel het aantal Viable cellen binnen de geconstateerde oppervlakte. Doe hetzelfde voor twee plaatsen in dezelfde put of plaatjes door het bewegen van de plaat onder de microscoop.
    9. Zorg ervoor dat de gemeten gebied is hetzelfde en de vergroting is niet veranderd. Bereken het gemiddelde aantal levensvatbare cellen in het gebied. De oppervlakte van de bron (een 24 wei-plaat, een putje met een oppervlakte van 2 cm2, een 100 mm schaal het gebied is 78,6 cm 2), extrapoleren het aantal levensvatbare cellen van het gebied begrensd in het rooster het totale aantal cellen in het putje (cellen / cm 2).

3. Behandel MMT Cellen met anti-proliferatieve Agents

  1. Bereid oplossingen van de geselecteerde anti-proliferatieve therapeutische agentia (tamoxifen, curcumine en metformine) en optionele geneesmiddel aspirine onder de BSC.
    1. Los curcumine en tamoxifen in 100% ethanol om een ​​voorraad concentratie van 27 mm te genereren. Los metformine en aspirine in unsupplemented EMEM een voorraad concentratie van 500 mM en 15 mm te genereren, respectievelijk.
  2. Opzetten van een dosis-respons.
    1. Behandel MMT cellen met de drie anti-proliferatieve therapeutische agentia (tamoxifen, curcumine en metformine) en optionele geneesmiddelen (aspirine) bij variërende concentraties om 96 uur een dosis-respons curve te genereren. Aanvankelijk toedienen alle drugs in een reeks concentraties gebaseerd op gepubliceerde verslagen 1,11-16 en in concentraties groter of kleiner dan die uitgegeven.
      Opmerking: Een dosisrespons bepaalt de minimale concentratie van een geneesmiddel noodzakelijk om de gewenste resultaten. Hier het gewenste resultaat is een vermindering van celproliferatie in vergelijking met de controle.
      1. Voor tamoxifen en curcumine, gebruik concentraties (en overeenkomstige volumes) van 0,054 mM (1 pi), 0,108 mM (2 ui), 0,162 mM (3 pl) en 0,216 mM (4 pl).
      2. Voor metformine gebruiken concentraties (en de bijbehorende volumes) van 2 mm (2 pl), 4 mM (4 pl), 6 mM (6 pl), 8 mM (8 ui) en 10 mM (10 ui).
      3. Voor aspirine gebruik concentraties (en overeenkomstige volumes) van 0,030 mM (1 pi), 0,060 mM (2 ui), 0,099 mM (3,3 ui), 0,150 mM (5 ul) en 0,216 mM (6,7 ui).
    2. Split MMT cellen van de 10 cm schaal op een 24 puts plaat bij een concentratie van 3,6 x 10 6 cellen / cm 2. Bepaal de initiële celconcentratie van zowel cel-telmethoden (stap 2). Bel deze nieuwe 24 goed plaat van cellen "Dag Split".
    3. 24 uur na cel plating, behandelen MMT cellen met elk van de anti-proliferatieve therapeutische agentia, tamoxifen, curcumine, metformine en aspirine, bij de in fase 3.2.1 concentraties. Raadpleeg dit als "Dag 0".
      1. Zoals elk putje kan een maximum van 500 ul van de media, gebruik micropipetten met steriele micropipet tips en een nieuwe tip elke keer een nieuw goed wordt behandeld om te voorkomen cr houdenoss verontreiniging. Met twee putjes als controles: cellen gekweekt in afwezigheid van behandeling met geneesmiddelen (negatieve controle) en gekweekt in aanwezigheid van 100% ethanol (oplosmiddel).
    4. Groeien cellen en opnieuw toedienen van drugs aan de beschreven concentraties wanneer de cellen om de andere dag gevoed worden (zie stap 1.2) voor 96 uur (tot dag 4) op dag 1 -. 4 van de behandeling, in acht nemen van de cellen onder de microscoop en tel gebruik de werkwijze in stap 2,2 (zie figuur 4).
    5. Herhaal het experiment ten minste drie keer.
    6. Bepaal de optimale concentratie van elk geneesmiddel door grafieken de relatie tussen cellevensvatbaarheid en geneesmiddeldosering over de lengte van het experiment (zie figuur 5).
  3. Opzetten van een Time Course.
    1. Behandel MMT cellen met de drie anti-proliferatieve therapeutische agentia (tamoxifen, curcumine en metformine) met een vaste concentratie variërende tijdsperioden. Gebruik de optimale concentratie identified door de dosis-respons experimenten (zie stap 3.2).
      1. Gebruik de volgende concentraties: 0,216 mM tamoxifen, 0,216 mM curcumine en 10 mM metformine.
        Opmerking: tijdsverloop bepaalt de hoeveelheid tijd die nodig is voor een geneesmiddel zijn optimale gewenste resultaat. Hier, het gewenste resultaat is een vermindering van celproliferatie in vergelijking met de controle.
    2. Split MMT cellen van de 10 cm schaal op een 24 puts plaat bij een concentratie van 3,6 x 10 6 cellen / cm 2. Bepaal de initiële celconcentratie van zowel cel-telmethoden (stap 2). Bel deze nieuwe 24 goed plaat van cellen "Dag Split".
    3. 24 uur na cel plating, behandelen MMT cellen met elk van de anti-proliferatieve therapeutische agentia, tamoxifen, curcumine, metformine en aspirine, bij de optimale concentraties die in stap 3.2. Raadpleeg dit als "Dag 0".
      1. Aangezien elke put kan maximaal 500 gl medium op, use micropipetten met steriele micropipet tips en een nieuwe tip elke keer een nieuw goed wordt behandeld om kruisbesmetting te voorkomen.
      2. Met twee putjes als controles: cellen gekweekt in afwezigheid van behandeling met geneesmiddelen (negatieve controle) en gekweekt in aanwezigheid van 100% ethanol (oplosmiddel).
  4. Groeien cellen en opnieuw toedienen van drugs in de gekozen concentratie wanneer de cellen om de andere dag gevoed worden (zie stap 1.2) voor 96 uur (tot dag 4). Op dag 1-4 van de behandeling, observeert de cellen onder de microscoop en tel volgens de methode in stap 2,2 (zie figuur 4).
  5. Herhaal het experiment ten minste drie keer.
  6. Bepaal de optimale belichtingstijd van MMT cellen aan elk geneesmiddel door grafieken de relatie tussen levensvatbaarheid en duur (tijd) drugsbehandelingen cellen in de geschikte concentratie (zie Figuur 6).

4. Het Lab Module

Opmerking: De volgende is een 5-daagselab periodiciteit van de lab module. Figuur 7 is een stroomschema van hoe het programma zou leiden binnen de 5 dagen. Voor deze activiteit in vijf dagen te vullen ofwel een tijdsverloop of een dosis response curve wordt gegenereerd. Er is niet genoeg tijd om beide curves te genereren. Een dosis respons-experiment wordt hieronder beschreven. Een tijdsverloop experiment kan eenvoudig worden verwisseld

  1. Splits de klas in groepen: één groep stelt een dosis-respons en de andere een tijdsverloop kiezen voor een concentratie in het midden van de voorgenomen concentratie dosis-respons.
    1. Handhaaf voldoende culturen en drugs voorraden bij passende concentraties. Tenzij anders vermeld, voeren alle werkzaamheden onder de BSC.
  2. Dag 1
    1. Direct studenten om media te maken en te groeien cellen (zoals in stap 1).
    2. Als studenten krijgen een voorraad van MMT cellen op een 10 cm plaat, direct de studenten om celcultuur media voorbereiden en geven een tutorial in het gebruik van de hemocytometer, digitale microscopie en de digitale camera microscopie software (zoals in stap 2).
    3. Kalibreer de programmatuur aan die op de microscoopdoelstellingen (bijvoorbeeld 4X, 10X, 20X) nu gebruik protocol van de fabrikant.
  3. Dag 2
    1. Laat de leerlingen bevestigen totale aantal cellen en levensvatbaarheid van de cellen (zoals in stap 2).
    2. Laat leerlingentelling cellen op 100 mm schaal met behulp van zowel de microscopie en software hemocytometer methoden bevestigen soortgelijke resultaten worden verkregen.
    3. Direct studenten een 24 putjesplaat en spleet cellen uit de 100 mm schotel naar de 24 well platen in de gewenste startcel plating densiteit (zoals in stap 1). Dit wordt beschouwd als Dag van Split. Plaats de 24 goed plaat in een celkweek incubator voor 24 uur.
  4. Dag 3
    1. Grow MMT cellen voor 24 uur op een 24 wells plaat. Laat de leerlingen in acht cellen onder de microscoop en te tellen met behulp van microscopie software (zoals in stap 2).
    2. Geef de student / teben monsters van de behandeling van kanker drug voorraden. Laat ze bereiden en verdun de oorspronkelijke voorraad-oplossing (zoals in stap 3). Voeg de verscheidene concentraties van de geneesmiddelen hun cellen om een ​​dosis respons curve vast te stellen. Dit heet Day 0.
    3. Incubeer cellen (stap 1,2) met middelen voor maximaal 48 uur.
  5. Dag 4
    1. Laat de leerlingen observeren behandelde cellen na 24 uur. Dit is Dag 1.
    2. Count elk putje met behulp van microscopie software. Neem foto van elk putje zodat tellen kan buiten het laboratorium worden uitgevoerd (zoals in stap 2).
    3. Incubeer cellen (stap 1,2) met middelen voor nog eens 24 uur.
      Opmerking: Instructor biedt extra tutorials en reviews van data-analyse en grafische presentatie. Studenten leren cijfers, percelen, en statistische analyse te maken voor de volgende dag van het verzamelen van gegevens.
  6. Dag 5
    1. Laat studenten behandelde cellen na 48 uur, Dag 2.
    2. Tel elkeook met behulp van microscopie software. Neem foto van elk putje zodat tellen kan buiten het laboratorium worden uitgevoerd (zoals in stap 2).
    3. Oogst en laat cellen voor het tellen van de traditionele hemocytometer werkwijze kan nagaan student vermogen om effectief gebruik van de microscopie software methode (zoals in stap 2).
      Opmerking: Verzamel gegevens en conclusies te trekken of te herzien hypotheses, dienovereenkomstig.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Groeiende MMT cellen en vergelijking telmethoden.

Muizenborsttumorvirus cellen werden met succes gekweekt en gekarakteriseerd (Figuur 1) en een nieuwe cel telmethode ontwikkeld volgens Motic Software, een digitale camera geassocieerde softwareprogramma voor een microscoop. Deze nieuwe celtelling methode vergeleken met een traditionele telmethode toepassing van een hemocytometer (figuur 2) en is bewezen even nauwkeurig vaststelt celaantal (ta...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een lab module wordt gepresenteerd dat zich richt op een verscheidenheid van onderwerpen in de celbiologie te leren door middel van de geavanceerde technieken van dierlijke celkweek. De module doet dit door het analyseren van de effecten van een aantal anti-proliferatieve stoffen op de vermenigvuldiging van cellen die menselijk borstkankermodel. De primaire test is gebaseerd op de fundamentele techniek celtelling en introduceert een nieuwe manier om cellen microscopische software tellen. De activiteiten die de module ka...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs kregen geen financiële of vergelijkbare steun van Motic.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door de Joseph Alexander Foundation, de ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, en een Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tissue Culture HoodESCO Labculture ReliantClass II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 IncubatorCEDCOModel 1510
Bright-line HemocytometerAmerican Opticalmet twee afzonderlijke rasters
Motic Images PlusMac OSX Verison 2.0 of hoger
Gilson PipetmanRainin instrument co. incP-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture MicroscopeOlympus4 objectief omgekeerd lichtmicroscoop met camera
200 μl Pipet tipsMidSci40200C
1.000 μl Pipet tipsMidSciAVR4
10 ml Seriologische PipettenTPPTP94010
24 well platenCoStar- Tissue Culture Cluster352424 wells, 16 mm well diameter, gesteriliseerd met straling
Trypan Blue Solution 0,4%SigmaT8154100 ml, celkweek getest non-haz
Bright-line Hemacytometer vervangende dekglas, non-hazSigmaZ375357
Muis Mammaire Tumor(MMT) cellenATCCCCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)ATCC30-2003500 ml
Foetaal RundserumSigmaF0926500 ml
Metformine HydrochlorideSigmaPHR1084500 mg
TamoxifenSigmaT5648wit of wit-gele poeder
CurmuminSigmaC1386geel-oranje poeder
AspirienSigmaA2093voldoet aan USP testspecificaties
```

Referenties

  1. Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
  2. Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
  3. Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
  4. Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
  5. Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
  6. Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
  7. Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
  8. Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , Longman, London, England. (2001).
  9. Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
  10. Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. , 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  11. Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
  12. Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
  13. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180(2011).
  14. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
  15. Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865(2012).
  16. Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
  17. Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
  18. Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
  19. Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
  20. Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
  21. Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

CelkweektechniekenCelproliferatie-assayTesten van ChemotherapeuticaTellen met HemocytometerAnalyse met MicroscopiesoftwareConcepten van de CelcyclusCellulaire SignaleringspadenOnderwijs in KankerbiologieOntwikkeling van Laboratoriumvaardigheden
Met behulp van de muis Mammary tumorcellen Core Biology Begrippen les te geven: A Simple Lab Module
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.