Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

Summary

Het doel van dit protocol is om de techniek van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om specifieke typen neurale cellen te sorteren voor daaropvolgende analyse van celtype-specifieke genexpressie, epigenetische markers en/of eiwitexpressie.

Abstract

De hersenen bestaat uit vier primaire celtypen inclusief neuronen, astrocyten, microglia en oligodendrocyten. Hoewel zij niet het meest voorkomende celtype in de hersenen, neuronen de meest bestudeerde van deze celtypen gezien hun directe rol in gedrag beïnvloeden. Andere celtypen in de hersenen beïnvloeden ook neuronale functie en gedrag via de signaalmoleculen ze produceren. Neuroscientists moet de interactie tussen celsoorten inzicht in de hersenen beter begrijpen hoe deze interacties beïnvloeden neurale functie en ziekte. Tot op heden de meest voorkomende werkwijze voor het analyseren eiwit of genexpressie gebruikt de homogenisering van hele weefselmonsters, meestal bloed, en zonder acht te slaan celtype. Deze aanpak is een informatieve aanpak voor de behandeling van algemene veranderingen in gen of eiwit expressie die neurale functie en het gedrag kunnen beïnvloeden; echter, deze analysemethode leent zich niet tot een beter begrip van de cel-type-specifieke genexpressie en het effect van cel-tot-cel communicatie op neurale functie. Analyse van behavioral epigenetica heeft een oppervlakte van groeiende aandacht die wordt onderzocht is hoe wijzigingen van het desoxyribonucleïnezuur (DNA) structuur langetermijneffect genexpressie en gedrag; echter, deze informatie alleen relevant indien geanalyseerd in een celtype-specifieke wijze gezien de differentiële lijn en dus epigenetische markers die aanwezig zijn op bepaalde genen van afzonderlijke neurale celtypes kunnen zijn. De Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) techniek hierna beschreven is een eenvoudige en effectieve manier om afzonderlijke neurale cellen te isoleren voor daaropvolgende analyse van genexpressie, eiwitexpressie of epigenetische modificaties van DNA. Deze techniek kan ook worden gemodificeerd om specifiekere neurale celtypes te isoleren in de hersenen voor daaropvolgende celtype-specifieke analyse.

Introduction

Het doel van het hieronder beschreven protocol is om individuele celtypen te isoleren uit een heterogene populatie van hersenweefsel voor de verdere analyse van celtypespecifieke genexpressie, eiwitexpressie of zelfs epigenetische markers. De hersenen bestaan uit veel celtypen die zijn afgeleid van verschillende voorlopercellen en die celtypespecifieke eigenschappen en functies hebben. Ondanks deze verschillen kunnen deze verschillende neurale celtypen vergelijkbare receptoren en intracellulaire signaalmoleculen tot expressie brengen, wat de analyse van deze meer universele eiwitten moeilijk te meten of te interpreteren maakt op een celtypespecifieke manier met conventionele methoden. Neurowetenschappers moeten de functie en activering van deze verschillende celtypen in de hersenen identificeren en hoe ze individueel gedrag kunnen beïnvloeden, aangezien dit uiteindelijk de eerste stap zal zijn om specifiekere geneesmiddelen en therapeutische doelen voor neurologische en neuropsychiatrische ziekten te identificeren. Ondanks dit overkoepelende doel van neurowetenschappelijk onderzoek, kan het moeilijk zijn om individuele neurale celtypen uit de hersenen te isoleren voor de analyse van gen- of eiwitexpressie, de activering van signaalmoleculen of de modificatie van epigenetische markers op DNA. Van de technieken die momenteel worden gebruikt, kan immunohistochemie de expressie van eiwitten op een celtypespecifieke manier identificeren in combinatie met aanvullende kleuring van een celtypespecifieke marker, hoewel dit afhankelijk is van specifieke antilichamen die goed kunnen kleuren voor de eiwitten van belang en het kan moeilijk zijn om te kwantificeren. In situ hybridisatie kan de specifieke lokalisatie van messenger ribonucleïnezuur (mRNA) in individuele cellen in de hersenen identificeren, maar dit is een arbeidsintensief proces dat ook de co-analyse van specifieke celtypen beperkt en alleen toelaat voor de analyse van een of misschien een paar genen van belang. Laser capture microdissectie gebruikt een laser om subpopulaties van cellen te isoleren die via microscopie worden gevisualiseerd; echter, de tijdrovende aard van dit proces en de relatief lage opbrengst kunnen de verdere analyse van eiwitten of mRNA-niveaus aanzienlijk beperken, vooral als de expressie van deze moleculen vanaf het begin laag is. Fluorescerende geactiveerde celsortering (FACS) is een relatief nieuwe techniek op het gebied van neurowetenschappen om individuele celtypen uit de hersenen te isoleren voor verdere analyse van genexpressie¹ en/of epigenetische doelen². Dit proces kan ook worden gebruikt om specifieke soorten neurale cellen te sorteren voor verdere analyse van celtypespecifieke genexpressie, eiwitexpressie of epigenetische markers. FACS wordt al tientallen jaren gebruikt in een aantal medische onderzoeksgebieden zoals kanker en immunologie om verschillende cellen te tellen en te sorteren op basis van fysieke of biochemische kenmerken³. Bovendien is flowcytometrie klassiek gebruikt om eiwitexpressie op celbasis te analyseren, met behulp van specifieke antilichamen. De hieronder beschreven procedure maakt gebruik van klassieke flowcytometrietechnieken om individuele celtypen te isoleren voor verdere analyse van moleculaire biologie-eindpunten. De flowcytometer kan enkele duizenden cellen per seconde analyseren, wat het een snelle en efficiënte alternatief maakt voor de hierboven beschreven technieken. Bovendien kunnen cellen worden geïsoleerd op basis van de cellulaire expressie van een specifiek eiwit (bijvoorbeeld een neurotransmitterreceptor) of een combinatie van twee of meer eiwitten (co-lokalisatie van meerdere eiwitten in een specifiek celtype). Dit stelt de gebruiker in staat om zeer selectieve neurale celtypen te isoleren op basis van hun moleculaire eigenschappen om hun functie in de hersenen te identificeren.

Om FACS uit te voeren, worden neurale cellen bereid in een eencellig suspensie die door een flowcel wordt geleid die de cellen draagt en uitlijnt zodat ze een voor een door een lichtstraal en lasers gaan voor analyse. Een computer verzamelt de gegevens van elke cel en zet deze in een histogram om gespecificeerde parameters (grootte, korreligheid en fluorescentie) te analyseren. Op basis van deze parameters kunnen de cellen onmiddellijk worden gesorteerd in afzonderlijke buizen voor hun herinnering en verdere analyse van elk gewenst eindpunt. Het hieronder beschreven protocol maakt gebruik van drie antilichamen om neuronen te sorteren (met behulp van een Thymocyte antigen 1, Thy1-antilichaam), astrocyten (met behulp van een gliale glutamaattransporter, GLT1-antilichaam) en microglia (met behulp van een cluster van differentiatiemolecuul 11B, CD11b-antilichaam). Dit protocol kan worden gebruikt zoals hieronder beschreven of gewijzigd met verschillende antilichamen, afhankelijk van het celtype dat men zou willen isoleren voor zijn eigen experimenten.

Er zijn enkele voorbehouden om te overwegen bij het bepalen of dit protocol geschikt is voor specifieke experimenten. Een belangrijk voorbehoud kan betrekking hebben op het specifieke celtype dat men zou willen isoleren. In dit protocol zijn de drie antilichamen die worden gebruikt extracellulaire antilichamen, die de experimentator toestaan de celtypen intact te houden tijdens de kleuringsprocedure, waardoor de integriteit van het RNA, DNA en eiwitten binnenin wordt behouden. Het is mogelijk dat men een specifiek neuronaal celtype zou willen isoleren met behulp van een antilichaam dat een eiwit identificeert dat alleen binnenin die specifieke cel wordt tot expressie gebracht. Bijvoorbeeld, men zou dopaminerge neuronen willen isoleren met behulp van een antilichaam voor tyrosine hydroxylase of acetylcholine neuronen met behulp van een antilichaam voor choline acetyltransferase. Deze eiwitten zijn intracellulair en daarom zou fixatie en permeabilisatie van het celmembraan vereist zijn voor vervolgkleuring met de juiste antilichamen. Hoewel dit eerder is gedaan ^4,5, kan dit proces de opbrengst van RNA of DNA uit deze gepermeabiliseerde cellen aanzienlijk verminderen. Een ander voorbehoud kan zijn dat niet alle antilichamen geschikt zijn voor FACS. Bijvoorbeeld, men kan momenteel een antilichaam gebruiken dat erg goed werkt voor western blot, een techniek die de denaturatie van eiwitten vereist. Dit antilichaam is mogelijk niet noodzakelijkerwijs geschikt voor de identificatie van deze celtypen met behulp van FACS, aangezien de eiwitten op geen enkel moment in dit protocol worden gedenatureerd en dus het antilichaam geen manier heeft om zich te binden aan zijn inherente antigeen. Bedrijven verstrekken specificatiebladen die de toepassingen identificeren waarvoor een antilichaam

Protocol

1. Voorbereiding voor weefselcollectie (15 – 30 min)

1. Polijst drie sets glazen Pasteur pipetten in afnemende diameters en nummer ze “1” = ongeveer 1 mm diameter, “2” = ongeveer 0,75 mm diameter, en ”3” = ongeveer 0,50 mm diameter.
2. Resuspendeer gelyofiliseerd Enzym A met alle Buffer A volgens het protocol dat bij de Neural Dissociation Kit wordt geleverd (zie tabel met materialen). Niet mengen. Verdeel de oplossing in 50 µl aliquots en bewaar deze bij -20 ºC voor later gebruik.
3. Maak 1 L myeline verwijderingsbuffer en vacuümfilter voor sterilisatie [myeline verwijderingsbuffer = 1.000 ml van 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), 2 ml van 500 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), en 10 g Runderserumalbumine (BSA)].
4. Snijd nylon gaasblad in kleine 1  x 1 inch (2,5 x 2,5 cm) vierkanten die zullen worden gebruikt voor het filteren van cellulaire restanten en autoclaveer in een kleine beker bedekt met aluminiumfolie.
5. Bereid 1 L wasbuffer voor [wasbuffer = 1.000 ml van 0,1 M PBS, 2 ml van 500 mM EDTA, en 10 g BSA].

2. Weefselcollectie

1. Schakel waterbad in op 37 ºC.
2. Bereid Buffer X uit de Neural Dissociation Kit voor door beta-mercaptoethanol toe te voegen aan Buffer X tot een eindconcentratie van 0,067 mM (voor 4 monsters, voeg 13,5 µl van 50 mM beta-mercaptoethanol toe aan 10 ml van Buffer X).
3. Bereid Enzym Mix 1 voor door 50 µl van Enzym P te mengen met 1.900 µl van Buffer X voor elk monster zoals beschreven in het protocol voor de Neural Dissociation Kit Voorbeeld: voor 4 monsters, meng 200 µl van Enzym P met 7.600 µl van Buffer X.
4. Plaats Buffer X in het waterbad op 37 ºC.
5. Plaats 2 ml koude Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) (zonder Ca⁺⁺ en Mg⁺⁺) in een putje van een steriele 6-putjes kweekplaat voor elk monster dat zal worden verzameld en houd het op ijs voor weefseldisseratie.

3. Weefseldisseratie (45 min – 1 uur)

1. Injecteer het dier met een geschikt volume euthanasieoplossing (commerciële barbituraat-oplossing, bijv. Euthasol), volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en perfuseer al het bloed met koude 0,9% zoutoplossing.
   1. Gebruik een overdosis euthanasieoplossing bij ratten.
   2. Controleer de anesthesie via ademhaling en via teenprik. Wanneer het dier voldoende verdoofd is (geen reactie op de teenprik en diepe, langzame ademhaling), kan de rat worden geperfuseerd.
   3. Snij de borstholte open met een stel zware schaar. Snijd het diafragma door om toegang tot het hart mogelijk te maken. Snijd de ribben langs beide zijden naar boven toe tot aan de top van de borstkas om volledige toegang tot het hart mogelijk te maken. Op dat punt kan de ribbenkast naar de zijkant worden gehouden met een stel hemostaten.
   4. Voer een hartperfusie uit door een 18 G naald (voor volwassen ratten) aan te sluiten op een elektrische pomp in de linker ventrikel van het hart. De pomp zuigt koude 0,9% zoutoplossing op.
   5. Snij vervolgens het rechter atrium open met een klein paar schaar om het bloed en de vloeibare perfusieoplossing uit het lichaam te laten wegvloeien.
   6. Perfuseer ratten met ongeveer 10 ml (voor volwassen ratten) van 0,9% zoutoplossing om alle perifere immuuncellen en -factoren te verwijderen.
2. Dissereer het gewenste deel van de hersenregio met behulp van steriele scheermessen en passende disseratie, plaats de weefselstukken vervolgens in de koude HBSS zonder Ca²⁺ en Mg²⁺.
   OPMERKING: Het protocol vereist HBSS zonder Ca²⁺ en Mg²⁺ in de vroege stadia van het protocol omdat deze ionen kunnen interfereren met de enzymen die nodig zijn voor neurale dissociatie.
3. Nadat alle weefselmonsters zijn verzameld, keer terug naar de schone werkbank of steriele kweekkap voor weefselverwerking.

4. Neurale dissociatie (1 uur)

1. Snij elk weefselmonster in kleine stukken met behulp van steriele scheermessen op het deksel van de 6-putjes kweekplaat. Dit protocol is gebruikt voor weefselmonsters van ongeveer 30 - 100 mg, maar is goedgekeurd voor weefselmonsters tot 400 mg. Voor weefselmonsters groter dan 400 mg, moeten de reagentiavolumes geschikt worden opgeschaald.
2. Gebruik 1 ml verse HBSS zonder Ca²⁺ en Mg²⁺ om de gesneden weefselstukken met een pipet over te brengen naar een steriele 2 ml centrifugeerbuis. Herhaal stappen 4.1 en 4.2 voor alle monsters totdat alle monsters zijn overgebracht naar een 2ml centrifugeerbuis.
3. Centrifugeer de monsters gedurende 2 min bij 300 x g bij RT en aspireer het supernatant.
4. Voeg 1.900 µl warme Enzym Mix 1, zoals bereid in stappen 2.2 en 2.3, toe aan elk monster en sluit de buisjes.
5. Incubeer de monsters gedurende 15 min in het 37 ºC waterbad, door de buisjes om de 5 min te keren om de neergedaalde weefselstukken weer op te schorsen.

Results

De belangrijkheid van Myeline Depletie en Weefsel Perfusie

Figuur 1 toont de belangrijkheid van myeline depletie. Myeline depletie (Stappen 5.1 tot en met 5.12 van het protocol hierboven) vindt plaats wanneer de single-cell suspensie wordt geïncubeerd in de Myeline Verwijdering Beads, gewassen en vervolgens door de kolom op de magnetische sorter wordt geleid. Het doel van deze stappen is om de hoeveelheid cellulaire restanten in elk monster te verminderen. Wanneer neuronen wor...

Discussion

Net als veel andere weefsels en systemen bestaat de hersenen uit een heterogene celpopulatie die samenwerkt om gedrag te beïnvloeden. De analyse van genexpressie, eiwitexpressie of epigenetische modificaties van individuele cellen binnen die heterogene populatie heeft het potentieel om informatie te onthullen over de functie van het systeem als geheel, om cellulaire processen te identificeren die zowel normaal gedrag als ziekteprocessen reguleren, en om celtypespecifieke doelen te bieden voor mogelijke therapieën. Het is...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neural Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
Myelin Removal Beads II	Miltenyi Biotec	130-096-733
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Nylon Mesh Sheet	Amazon	CMN-0074-10YD	40 inch breedte, 80 micron gaasmaat
Fc Block / anti-CD32	BD Biosciences	BDB550270	reactiviteit voor rat
APC-geconjugeerd CD11b antilichaam	Biolegend	201809	reactiviteit voor rat
Konijn anti-GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	reactiviteit voor rat of mens
PE-geconjugeerd secundair anti-konijn antilichaam	eBioscience	1037259	secundair antilichaam voor anti-GLT1
FITC-geconjugeerd anti-rat CD90 (Thy1) muis antilichaam	Biolegend	202504	reactiviteit voor rat