A Time Differential kleuringstechniek combinatie met Full Bilaterale Gill denervatie te Ionocytes Studie in Fish

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een protocol om de herverdeling van branchiale ionocyten en hun innervatie te volgen met behulp van een tijdsdifferentiële kleuringstechniek gekoppeld aan volledige bilaterale kieuwdenervatie.

Samenvatting

Branchial ionocytes (IC's) zijn de functionele eenheden voor ionische regelgeving in vis. Bij volwassenen zijn zij op de filamental en lamellaire epitheel van de kieuw waar transport ionen zoals Na ^+, Cl ^- en Ca2 ⁺ via diverse ionenkanalen, pompen en uitwisselaars. De teleost kieuw wordt extrinsiek geïnnerveerd door de gezichtsuitdrukkingen (VI), glossofaryngeale (IX) en vagus (X) zenuwen. De IX en X zenuwen zijn ook de extrinsieke bron van branchial IC innervatie. Hier, twee technieken gebruikt om de innervatie, proliferatie en distributie van IC's te bestuderen worden beschreven: een tijdverschil kleuringstechniek en een volledige bilaterale kieuw denervatie techniek. Kort goudvis blootgesteld aan een vitale mitochondrion-specifieke kleurstof (bv Mitotracker rood) die etiketten (rode fluorescentie) bestaande IC. Vissen werden ofwel toegestaan ​​om te herstellen voor 3-5 dagen of onmiddellijk onderging een volledige bilaterale kieuw denervatie. Na 3-5 dagen van herstel, de gkwalen worden geoogst en voor immunohistochemie vast. Het weefsel wordt vervolgens gekleurd met α-5 primaire antilichaam (doelwitten Na ⁺ / K ⁺ ATPase bevattende cellen) in combinatie met een secundair antilichaam dat alle (nieuwe en bestaande) IC groene etiketten. Met behulp van confocale beeldvorming werd aangetoond die bestaande IC's lijken geel (gemerkt met zowel een levensvatbare mitochondrion-specifieke kleurstof en α-5) en nieuwe ICs kleur groen (gelabeld met slechts α-5). Beide technieken gebruikt in combinatie kunnen worden toegepast op de innervatie, proliferatie en verspreiding van ICs bestuderen op kieuw filament bij vissen worden blootgesteld aan milieuproblemen.

Inleiding

IC's zijn de functionele eenheid voor ionische regelgeving in vis en zijn te vinden op de epitheliale oppervlakken van de kieuw filamenten en lamellen ^4,6-8,10. Hoewel verschillende subtypen zijn beschreven die unieke eigenschappen bezitten veel van de IC worden gekenmerkt door een hoge dichtheid van mitochondria (dus ze zijn ook bekend als mitochondrion-rijke cellen) en / of overvloed van het enzym Na ⁺ / K ⁺ ATPase (NKA). Typisch deze IC huis diverse andere pompen, ionenkanalen en uitwisselaars betrokken ionenregulatie (bijvoorbeeld Na ⁺ / H ⁺ exchanger, Na ⁺ / Cl- ^- co-transporter, H ⁺ pomp) ^2,10,11. De herverdeling en de proliferatie van IC's als een compensatiemechanisme is centraal voor het behoud ion homeostase in het bijzonder tijdens ionische stress (bv, blootstelling aan ion-arme water) ^4,8,9.

Deze studie beschrijft een tijd differentiële kleuring Technique ¹ tot nieuw proliferated ionocytes (IC's) in de kieuwen van vissen te identificeren. Deze techniek gaat gepaard met een volledige bilaterale denervatie van de kieuw bogen. Goldfish (Carassius auratus), de in deze studies gebruikte soorten is geschikt om proliferatie van gill epitheelcellen bestuderen omdat ze een opmerkelijk vermogen om structureel verbouwen hun kieuwen ^2. Gill remodeling betrekking op de groei of terugtrekken van een interlamellaire celmassa (ILCM) wanneer de vis (gewoonlijk gehandhaafd op 15-30 ° C) worden geacclimatiseerd aan koud water (<15 ° C) of hypoxie, respectievelijk ^3. Eerdere studies met het tijdsverschil stainstechniek op goudvis zijn gericht op de herverdeling innervatie en proliferatie van ICs op de kieuwen in de context van kieuw remodeling ^4,5. Katoh en Kaneko ¹ ontwikkelde deze nieuwe techniek om de transformatie en de vervanging van branchial IC's in killivissen studeren (Fundulus heteroclitus) transferred uit zeewater (SW) naar zoet water (FW). In dit onderzoek ligt de focus op de proliferatie en innervatie van IC's in goudvis gewend tot 25 ° C.

De tijdsverschil kleuring techniek werd aangetoond dat, in de context van kieuw remodeling, goudvis handhaven van een constant aantal ICs in hypoxische blootstelling en daaropvolgende normoxische herstel echter het percentage geïnnerveerde cellen daalde gedurende de normoxische herstelperiode ^5. Het werd meer dan 70 jaar geleden dat de ionische opname mechanismen in vis zijn voorgesteld in het kader neurale controle ^12. De teleost kieuw geïnnerveerd door het gezicht (VII), glossofarynx (IX) en vagus (X) zenuwen ook wel de "branchial zenuwen" ^13,14. Studies door Jonz en Nurse (2003) over de zebravis (Danio rerio) Gill innervatie bleek dat de oorsprong van de innervatie is extrinsieke (cellichaam van zenuwvezel wordt extrinsieke aan de kieuw) als intrinsieke (cellichaam vanzenuwvezel is inherent aan de kieuw). Dezelfde auteurs toonden ook aan dat branchial ICs extrinsiek worden geïnnerveerd ^7.

In deze studie, de tijd differentiële kleuring techniek in combinatie met volledige bilaterale kieuw denervatie werd gebruikt om de proliferatie van IC's ontbreekt extrinsieke innervatie bij goudvissen te onderzoeken. Volledige bilaterale gill denervatie betreft doorsnijden craniale zenuwen IX en X. Deze twee benaderingen zijn haalbaar goudvissen vanwege hun relatief grote afmetingen (30-200 g) vereenvoudigt het delicate chirurgische procedures en ionocytes worden gemakkelijk geïdentificeerd middels standaard immuno-histochemische technieken. In de onderhavige studie werden ICs gevisualiseerd met een vitale mitochondrion-specifieke kleurstof (bv Mitotracker rood) of een primair antilichaam tegen het α-subeenheid van de Na ⁺ / K ⁺ -ATPase (α-5; Developmental Studies Hybridoma Bank, University van Iowa, Iowa City IA). Dit protocol voorziet in een eenvoudige method van het visualiseren en analyseren van de herverdeling en de proliferatie van IC's op de kieuw.

Protocol

Beide protocollen gelijkvormig aan de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care (CCAC) en werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Universiteit van Ottawa Animal Care Committee (Protocol BL-226) uitgevoerd.

1. Tijd Differential kleuring Techniek: Mitochond-rijke verfbad

1. Bereid 1 mM Mitotracker Rode voorraad oplossing door het oplossen van 50 ug in 94,0 ul dimethylsulfoxide (100% DMSO). Houd voorraad oplossing in het donker bij -20 ° C wanneer niet in gebruik. Vermijd vries / dooi cycli.
2. Bereid donker boxes (3-6 boxen) met een maximaal volume van 600 ml. Vul de dozen met 400 ml water systeem (water de vis normaliter binnen) en plaats een lucht steen in elk vak een bron van _O2 verschaffen. Verkrijgen goudvissen (30 - 40 g) en plaats ze in de dozen met 400 ml water en een lucht steen. Na 30 min, voeg de levensvatbare mitochondrion-rijke kleurstof eindconcentraties van 0,1 uM en 0,01% DMSO opleveren. Baden de vis voor 4 uurr.
   1. Als deze controle vis (dat wil zeggen, geen denervatie), zet waterstroom naar de dozen, zodat de kleurstof uit te spoelen en de vis voor de periode van de toegestane tijd in het protocol te herstellen. De vissen worden meestal teruggewonnen voor 3-5 dagen.
3. Na de herstelperiode, ga naar Hoofdstuk 3: Time Differential kleuring Techniek: Immunohistochemistry. Als deze vissen worden gedenerveerd naar Sectie 2: Volledige Bilaterale denervatie Procedure.

2. Volledige Bilaterale denervatie Procedure

1. Verkrijgen 1 paar student Vannas voorjaar schaar (gebogen), 1 paar standaard patroon tang-recht, 1 paar standaard patroon tang gebogen, 2 paar No. 5 tang, 1 paar weefsel retractors, kleine katoenen ballen (1 - 2 mm in diameter), en wattenstaafjes (Q Tips of gelijkwaardig).
2. Bereid de verdoving waterbad. Eerst Los 10 g benzocaïne tot een eindvolume van 100 mlvan 99% ethanol om een ​​voorraadoplossing te bereiden. Om de verdoving waterbad te bereiden, te ontbinden 15 ml van de benzocaïne oplossing in 30 L van cellenbeton systeem water op de gewenste temperatuur. Beluchten van het water door het plaatsen van een lucht-steen aangesloten op een luchtpomp of een centrale air-lijn in het waterreservoir.
   1. Leg vis in het verdovingsmiddel waterbad (Figuur 1A).
   2. Zodra de ademhaling is gestopt, plaatst u de vis op een operatie tafel en intuberen het zoals weergegeven in figuur 1B. Doe dit door het inbrengen van een buis in zijn mondholte aan de kieuwen met cellenbeton verdoving oplossing te irrigeren. Irrigatie van de kieuwen zorgt ervoor dat de vis wordt geleverd met een voldoende hoeveelheid _O2 en verdoving tijdens de denervatie procedure. Plaats de vis, zodat het hoofd iets naar beneden gekanteld. Dit zorgt voor een betere toegang tot de ruimte achter de vierde kieuwboog.
3. Til de operculum met de rechte standaard patroon tangen plaats het weefsel oprolmechanisme tussen operculum en de binnenkant van de kop. Open voorzichtig het weefsel retractors naar het operculum uit de buurt van het hoofd houden en de kieuwen blootgesteld.
4. Zorg ervoor dat de verdoving oplossing is irrigatie de kieuwen tijdens deze procedure. Rusten de terugtrekinrichting behandelt naast het hoofd, die de toegang tot alle vier kieuwbogen biedt.
5. Plaats de gebogen standaard patroon tang tussen de vierde kieuwboog en de achterkant van het hoofd en zachtjes open ze om de spanning in het ligament bevestigen van de vierde kieuwboog om het hoofd te creëren. Met een paar No. 5 forceps maken een kleine opening (2-3 mm) door het doorboren van de epitheel verbindt het dorsale einde van de kieuw bogen op de opercular holte. Wees voorzichtig om niet te gaan in te diep, want er is het risico van beschadiging van een groot bloedvat.
6. Met een klein katoenen bal 5 tang langzaam en voorzichtig gehouden met nr uitbreiden van de incisie aan de IX (glossofaryngeale) en X (vagus) zenuwen bloot. Gratis hetzenuwen vanuit elke bindweefsel met behulp van de No. 5 tang, weer de zorg bloedvaten niet te beschadigen.
   OPMERKING: De branchial IX en X zenuwen van de goudvis rusten diep achter de vierde kieuwboog en zijn in de nabijheid van grote bloedvaten voeden in de kieuwbogen.
7. Zodra zenuwen zijn geïdentificeerd gebruik van de gebogen veer schaar om zorgvuldig te snijden de zenuwen terwijl de incisie geopend met de gebogen standaard vorm tang. Na het verbreken van de zenuwen, zachtjes trekken de gebogen pincet. Het is niet nodig om de incisie te sluiten met hechtingen omdat het epitheel is erg dun en de incisie sluit doorgaans vanzelf binnen 24 - 48 uur. Verwijder weefselhaak.
8. Herhaal dezelfde procedure aan de andere kant van het hoofd.
9. Schakel de irrigatie van de kieuwen van verdoving in de frisse belucht water om de vis te herstellen van anesthesie. Zodra opercular bewegingen hebben hervat bewegen de vis in experimentele tanks om te recupereren voor ten minste 24 uur.
10. Voer een "schijnvertoning" procedure op een aparte set van vis. De "schijnvertoning" procedure omvat piercing het epitheel achter het vierde kieuwboog zonder doorsnijden van de zenuwen.

3. Tijd Differential kleuring Techniek: Immunohistochemistry

1. Maak eerst 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; 4 g PFA in 96 ml PBS). PFA niet gemakkelijk oplossen in PBS bij kamertemperatuur. Verhit oplossing in een waterbad te lossen PFA. Voer deze in een zuurkast. Eenmaal PFA is in oplossing laat afkoelen voor gebruik. Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.
2. Voordat euthanizing de vis en de extractie van de kieuw weefsel, plaatsen 3 - 4 ml 4% PFA in een scintillatieflesje voor een totaal van 8 scintillatieflesjes (1 flacon per kieuwboogslagader). Bovendien, neem een ​​kleine wegen boot en vul het met 1x PBS. Dit wordt gebruikt om het weefsel te wassen nadat deze is uitgesneden. Houd alle oplossingen op het ijs.
3. Na de levensvatbare mitochondrion-rijke kleurstof blootstellingexperiment is voltooid, euthanaseren de goudvis door het te plaatsen in een waterbad met een overdosis benzocaïne.
4. Gebruik botte tang om het operculum tillen aan één kant van het hoofd en de gebogen schaar aan elk uiteinde van de branchial kieuw mand te verbreken. Pick-up voorzichtig de kieuwen door de rakers behulp van stompe pincet en til ze uit de opercular holte. Onmiddellijk de kieuwen in ijskoud 1x PBS om overtollig benzocaïne en bloed te verwijderen.
5. Plaats de uitgesneden kieuwen in afzonderlijke flesjes (een flesje per kieuwboogslagader) gevuld met 4% PFA en bevestig O / N bij 4 ° C.
6. Na fixatie, wassen overmaat PFA in 1X PBS en plaats het weefsel in 2 ml kogel buis gevuld met 1,5 ml 1% Triton-X op een schudder gedurende 6 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Deze stap permeabilizes het weefsel. Als de hele kieuw is te groot om te plaatsen in een 2 ml buisje dan snijd het weefsel in secties klein genoeg om de buis te verzorgen passen de draden niet te beschadigen.
   1. Bereid de primaire antilichaam verdunningen door miXing 4 ui van de voorraadoplossing van elk primair antilichaam (totaal 8 ul) in 992 pl 1x PBS. Zorg ervoor dat de NKA (labels NKA-rijke cellen) en zn-12 (labels neuronen) primaire antilichamen zijn gerezen in dezelfde host. Dit is belangrijk als de onderzoekers besluiten specifieke IC subtypen identificeren tegelijkertijd waarvoor zij moeten primaire en secundaire antilichamen opgewekt in een andere gastheersoorten gebruiken.
   2. Verwijder de Triton-X oplossing en zonder wassen het weefsel voeg een 1: 250 verdunning (verdund in 1 x PBS) van NKA monoklonaal antilichaam (α-5) aan NKA-rijke cellen en zebravis specifieke neuronale opsporing van antilichamen (Zn-12) zenuwvezels (primaire antilichamen) detecteren en incubeer op een schudder gedurende 6 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C.
7. Was het primaire antilichaam 3 keer voor 3 minuten elk gebruik 1x PBS. Om dit te doen, verwijder het primaire antilichaam oplossing uit de buis door het uitzuigen van het uit met behulp van een pipet.
8. Bereid het secundaire antilichaam tegen een1: 200 verdunning door het mengen van 5 ul voorraad secundair antilichaam in 995 ul van 1x PBS. Breng secundair antilichaam (Alexa Fluor 488) en incubeer gedurende 6 uur bij KT of O / N bij 4 ° C op een schudder.
   OPMERKING: Mitotracker Rood is enthousiast over een ~ 594 nm golflengte en zal rood fluoresceren. Een secundair antilichaam dat is opgewekt tegen een ~ 488 nm en licht groen worden gebruikt NKA labelen en zn-12 primaire antilichamen.
9. Overtollig tweede antilichaam door wassen van het weefsel 3 maal gedurende 5 minuten elk (zoals beschreven in stap 3.7).

4. Imaging

1. Na het wassen, monteer het weefsel op een concave glijbaan voor de ganse berg confocale beeldvorming van cellen en zenuwvezels. Om het weefsel te monteren, eerste plaats het in een druppel (200 pl) van 1x PBS op een vlakke microscoop dia. Dit zorgt ervoor dat het weefsel niet uitdrogen.
2. Scheid de kieuw hemibranchs met de gebogen micro-schaar. Breng een druppel 1x PBS en een druppel fixeermiddelen een concave slide.
3. Plaats de gescheiden hemibranchs in de holle dia met de voorrand van het filament naar boven en bedek met een dekglaasje. Dep de randen van het dekglaasje met nagellak om te voorkomen dat het dekglas van bewegen en verplaatsen van het weefsel. Laat het weefsel naar de bodem van de concave slide gedurende 10-15 min voor beeldvorming.
4. Voor elke kieuwboog, selecteert zes Gill filamenten willekeurig voor de beeldvorming, het produceren van zes beelden per kieuwboogslagader. Gebruik conventionele confocale microscopie om het beeld van het weefsel door het nemen van 1-3 micrometer optische schijfjes.
   LET OP: een eventueel reeds cellen zullen met Mitotracker Rode gelabeld worden en positief voor NKA alleen geel verschijnen. Cellen die alleen worden rood zijn reeds bestaande IC's die niet NKA bevatten. Elke nieuw verspreidden cel zal alleen positief voor NKA worden en zal alleen groen verschijnen. Zenuwvezels verschijnt ook groen.

5. Image Analysis voor Ionocyte kwantificering

1. Voor each kieuw gloeidraad die is afgebeeld, te kwantificeren de IC's en bijbehorende innervatie door te bladeren door de secties van de Z-stack en het tellen van het aantal lamellen en filamental IC's aanwezig zijn en of ze nieuw zijn gedifferentieerd, reeds bestaande, en / of geïnnerveerde .
2. Kwantificeren van de IC's per filament of per gebied (mm ²⁾ van de gloeidraad. Doe dit door de tekening die gebruikt worden door de software waarmee de beelden te verwerven om de lamellen van het filament omvat het gebied van het filament waarin de IC werden gekwantificeerd schetsen. De meeste confocale imaging software programma's hebben de optie om de oppervlakte van een geschetste regio te berekenen op de afbeelding. Gebruik de optie in de imaging software die u toestaat om dit te doen om het gebied te verwerven.
3. Verdeel de getelde ICs door het oppervlak berekend door de software een maatregel van ICs per oppervlakte-eenheid te verkrijgen (bijvoorbeeld per ^mm2).

Resultaten

Figuur 1 illustreert de operatietafel zetten (figuur 1A), de plaatsing van de vis tijdens de operatie (figuur 1B) en de drie belangrijkste stappen voor het tijdsverschil kleuring techniek (figuur 1C). In stap 1, wordt de vis gedurende 30 minuten bewaard in een goed belucht waterbad bij 25 ° C in het donker. Tijdens de periode van 30 minuten, kan de onderzoeker het mitochondrion-rijke kleurstof monster in DMSO die aan het water wordt toegevoegd tijdens Stap 2 (figuur 1C) voor te bereiden. De incubatietijd in stap 2 maakt opname van de mitochondrion-rijke kleurstof uit het water in de mitochondrion-rijke cellen (dwz ICs). De vis kan dan ofwel ondergaan de volledige bilaterale denervatie procedure of een schijnvertoning procedure waarin de vis wordt verdoofd en de opercula gemanipuleerd, maar de zenuwen intact blijven. De set-up in stap 3 een herstel kamer voorzien van stromend water voor een vis die ei heeftther ondergaan volledige bilaterale denervatie of een "schijnvertoning" procedure.

Na de herstelperiode, werd de vis gedood en de kieuwen werden uitgesneden en voor immunohistochemie vast. De globale verdeling en innervatie van ICs op de kieuw filament van een vis die een "sham" procedure heeft ondergaan is in Figuur 2. De IC aanwezig op de filamental epitheel zijn als op de basis van de interlamellaire regio. Figuur 2A toont reeds bestaande IC's gelabeld met mitochondrion-rijke kleurstof (dat wil zeggen, deze IC bestond vóór de denervatie / schijnvertoning procedures werden uitgevoerd). Figuur 2B toont zenuwvezels innerveren de reeds bestaande en nieuw gevormde IC's (geïdentificeerd door NKA immunoreactiviteit) van de filamental en gelamelleerde epitheel. Tenslotte samenvoegen van de twee beelden (figuur 2C) duidelijk onthult de reeds bestaande IC's (weergegeven geel) en de nieuwe IC (groen weergegeven).Figuur 2D is een representatieve grafiek van IC kwantificering van het filament in Figuur 2A-C. Op deze specifieke filament blijken er een groter aantal nieuw verspreid IC per ^mm2 dan bestaande ICs (N = 1). Om de bron van extrinsieke branchial innervatie te verwijderen, werden de IX en X hersenzenuwen (extrinsieke innervatie) verbroken. Figuur 3A toont de dorsale regio van de opercular holte na de kieuw filamenten en het epitheel die de zenuwen werden verwijderd om de IX en X bloot hersenzenuwen (aangegeven met Romeinse cijfers), die variëren van twee belangrijke zenuw boomstammen om alle vier bogen (figuur 3A) innerveren; de kieuwbogen zijn genummerd van 1 tot en met 4. Figuur 3B-E illustreren selectieve denervatie van de eerste kieuwboog. De eerste kieuwboogslagader geïnnerveerd door zowel IX en X craniale zenuwen (figuur 3B) die kan worden verwijderd zonder de innervatie van de rest of de kieuwbogen (Figuur 3C-E). Volledige bilaterale denervatie resultaten in geleidelijk verlies van extrinsieke innervatie naar de kieuw filamenten (Figuren 4A-C). Controlevissen vertonen duidelijk zenuwbundel die de lengte van het filament (figuur 4A) overspant. Volledige bilaterale denervatie resulteerde in een verlies van extrinsieke innervatie na 2 dagen van herstel (figuur 4B). Verdere verdwijning van extrinsieke innervatie werd waargenomen na 5 dagen herstel van denervatie (figuur 4C). Eventuele resterende innervatie naar IC's na 5 dagen van herstel vermoedelijk was afgeleid van de zenuwen met cellichamen in de kieuw filament (intrinsieke innervatie; Figuur 4C).

Figuur 1. Experimentele ingesteld voor de denervatie werkwijze en volgorde van stappen in detijdverschil stainstechniek. (A) Chirurgie tafel opgezet voor denervatie procedure die de verdoving en vuilwatertanks. (B) Voorbeeld van de plaatsing van een verdoofd, geïntubeerd vis. (C) van de belangrijkste stappen in de tijd differentiële stainstechniek. In stap 1, wordt de vis in een temperatuur gecontroleerde, statische belucht waterbad gedurende 30 minuten. De mitochondrion-rijke kleurstof in stap 2 toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,1 uM en de vis mag baden in de oplossing gedurende ten minste 4 uur. Waterstroom wordt hernieuwd in stap 3 op welk punt de vis ondergaat ofwel een volledige bilaterale denervatie van de kieuw of een schijnvertoning chirurgie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

/>
Figuur 2. Licht microfoto die de tijd differentiële kleuringstechniek in een goudvis (gewend aan 25 ° C) 2 dagen na volledige bilaterale denervatie. (A) De verdeling van reeds bestaande ionocytes (ICs; pijlen). Op een enkele kieuw gloeidraad wordt onthuld door mitochondrion-rijke kleurstof kleuring (B) De verdeling van IC's (nieuwe en bestaande) en branchial zenuwen (gestippelde pijlen) wordt onthuld door kleuring met de α-5 en Zn-12 antilichamen, respectievelijk. De pijlen geven ICs (C) De overlap van (A) en (B) onderscheidt reeds bestaande IC. (Lijken geel, aangeduid met pijlpunten) vanaf nieuw verspreid ICs (groen weergegeven, aangeduid door pijlen). Plaats in (C) is een vergroting van een geïnnerveerd bestaande ionocyte. (D) Representatieve grafiek van IC kwantificering van de in panelen (AC) filament. N = 1. Schaal bar in paneel (C) is 50 pm en is van toepassing op alle panelen./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Representatieve beelden beeltenis van verschillende stadia van de kieuw innervatie. (A) Dorsal weergave van de mondholte met de IX en X craniale zenuwen die alle 4 kieuw bogen. Kieuwbogen zijn genummerd 1-4. De Gill filamenten en het weefsel dat de zenuwen werden verwijderd om beter te visualiseren de innervatie. (B) De 1 ^e en 2 ^e kieuwbogen worden gescheiden om het zintuig te openbaren en de takken van de IX en X craniale zenuwen die de 1 ^e kieuw arch. (CE) Volgorde van beelden die de selectieve denervatie van de 1 ^ste kieuwboogslagader door het doorsnijden van de takken van de IX en X hersenzenuwen. Voor een schematische representatie van de kieuw innervatie van beenvissen, zie figuur 1 in Milsom et al ²⁶ De witte lijnen in de beelden zijn water reflectie van de microscoop verlichting.; zij geen morfologische structuur. Schaal bar in paneel (E) is 4 mm en is van toepassing op alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Licht microfoto die de verspreiding en innervatie van ionocytes op een enkel filament van de 1 ^ste kieuwboogslagader van een goud gewend tot 25 ° C Ionocytes (aangegeven met pijlpunten) werden gekleurd met α-5 antilichaam en zenuwen (aangegeven by pijlen) werden gekleurd met de zn-12 antilichaam. (A) Gill gloeidraad van een controle vis met een centrale zenuw-bundel vermoedelijk afkomstig van de IX en X zenuwen (extrinsieke innervatie) met uitgebreide lamellaire vertakking. Sommige van de aangegeven ionocytes worden ook geïnnerveerd (insert). (B) A kieuw filament 2 dagen na volledige bilaterale denervatie. Er was een verlaging van het centrale zenuw bundel terwijl de lamellaire innervatie leek grotendeels intact. (C) Een gill gloeidraad 5 dagen na volledige bilaterale denervatie tonen dat extrinsieke innervatie grotendeels afwezig. Kwalitatieve analyse suggereert dat volledige bilaterale denervatie veroorzaakt afbraak van de extrinsieke kieuw innervatie met behoud van zenuwen met cellichamen in de kieuw filament (intrinsieke innervatie) het creëren van een netwerk van zenuwen door de gloeidraad en in de lamellen. Gelieveklik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

De tijd differentiële kleuring techniek kan een nuttig instrument zijn om de dynamische regulering van ion opname te begrijpen en om de tijdelijke herverdeling van IC's te onderzoeken in de kieuw epitheel zijn. Hoewel een eenvoudige procedure, zijn er een aantal belangrijke punten die cruciaal voor het succes van het tijdsverschil stainstechniek zijn. De goudvis wordt blootgesteld aan de mitochondrion-rijke kleurstof voor de toegewezen tijd in het protocol. Kortere belichtingen leiden tot een slechte opname van de kleurstof door de mitochondrion-rijke cellen (dwz ionocytes). Tijdens fixatie, moet de kieuwweefsel snel worden uitgesneden en in het donker bewaard om foto bleken te voorkomen. Het weefsel moet binnen 2 weken na fixatie worden verwerkt voor beeldvorming. Tijdens de bilaterale zenuw snijden procedure ervoor te zorgen dat de vis is goed verdoofde; de zenuwen en bloedvaten zijn duidelijk herkenbaar; en de vis hervat volledige opercular functie voordat het naar een vuilwatertank wordt verplaatst.

"> De FW omgeving presenteert vis met de dubbele uitdaging van het balanceren van passieve ion verliezen en osmosewater winst ^14. De afweging van passieve ion verliezen gebeurt via de actieve opname van zout aan de overkant van de IC's die zijn gelokaliseerd aan de filamental en gelamelleerde epitheel waar ze kunnen maakt direct contact met de externe omgeving ^2,4,8,9,16. De locatie van de ICs op de kieuw is niet statisch. De laatste drie decennia een aantal studies hebben aangetoond dat verschillende FW vissoorten, wanneer geconfronteerd met een ionische en / of temperatuur uitdaging herverdelen branchial ICs uit de filament of onderkant van de lamel om de meer distale gebieden van de lamel ^{1,2,4,5,17-21.} Deze verdeling kan de dikte van de lamellen verhogen die kan gasoverdracht compromitteren (O _2, CO ₂₎ over de kieuw epitheel ^22. Onderzoekers van de tijd differentiële kleuringstechniek in dit manuscript beschreven hebben gebruikt om de verhuizing en emergenc volgene van de nieuwe IC's op de kieuw epitheel onder deze verschillende experimentele omstandigheden (figuur 1C) ^1,4,5.

De kieuwen, en vermoedelijk de branchial IC's, worden geïnnerveerd door de IX en X hersenzenuwen ^7,23-25. Deze zenuwen dragen zowel efferente en afferente input naar en van de kieuw, respectievelijk. Ze bevinden zich aan de dorsale zijde van de mondholte achter de 4 ^e kieuwboogslagader. De toegankelijkheid van de zenuwen en het gemak waarmee de bilaterale denervatie procedure kan worden uitgevoerd is soortspecifiek. In forel bijvoorbeeld de puntige afgevlakt anatomie van de kop maakt de zenuwen in een enkel vlak achter de ^4e kieuwboogslagader liggen onder een dunne laag weefsel. Dit maakt de zenuwen zichtbaar en gemakkelijk toegankelijk is voor de onderzoeker aan de denervatie procedure uit te voeren. In tegenstelling, goudvis hebben een kortere snuit en een rondere kop. De IX en X hersenzenuwen van goudvissen liggen dieper in de dorsale side van de holte na de 4 ^e kieuwboogslagader bezetten verschillende vlakken. Deze oriëntatie beperkt de gemakkelijke toegang tot de zenuwen en vereist een meer zorgvuldige benadering van de juiste zenuwen te identificeren en te verbreken. Doel van de denervatie procedure sensorische afferente en efferente ingang verwijderen en naar de kieuw, respectievelijk. Denervatie van de kieuw bogen ook worden gekoppeld aan ion flux experimenten met radioactieve isotopen (bijvoorbeeld ²² Na). Deze technieken kunnen worden gebruikt in combinatie met de bijdrage van nerveuze ingang op ion-beweging over de kieuw epitheel bestuderen. Een andere beperking op de denervatie procedure is het onvermogen om onderscheid te maken tussen sensorische en motorische neuronen, waardoor bij het doorsnijden de zenuwbaan is het mogelijk dat beide soorten innervatie worden verwijderd. Doorsnijden van elke motorische neuronen kan de kieuw en opercular beweging van de vis beïnvloeden. Dus bij het uitvoeren gill denervatie experimenten is het belangrijk ook ventilatie na bewakenvis heeft zich hersteld van de procedure om ervoor te zorgen dat er voldoende kieuw beweging voor gas en ionenwisseling.

De in dit manuscript gebruik volwassen dieren beschreven protocollen gehouden op een 00:12 licht: donker cyclus en gevoed commerciële voedsel pellets. Deze methoden kunnen worden gemodificeerd op verschillende manieren. Ten eerste kan de herstelperiode na mitochondrion-rijke kleurstof blootstelling worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker protocol (bijvoorbeeld 1, 3, 5, of 14 dagen). De langste periode van herstel na mitochondrion-rijke kleurstof blootstelling in het lab heeft 14 dagen ^4,5 geweest. Er was geen significante vermindering van de intensiteit van de fluorescentie van de mitochondrion-rijke kleurstof na 14 dagen van herstel. Ten tweede is het gebruik van de α-5 primaire antilichaam beperkt tot identificatie NKA-rijke cellen en maakt geen onderscheid tussen de verschillende subtypes van branchial ICs. Gelukkig is in goudvis werd vastgesteld dat de meerderheid van de IC's zijn zowel mitochondrion-rijk (label met Mitotracker) en NKA-rijk (label met α-5) cellen die niet het geval in alle vissoorten ^4,27 zijn. Toekomstige experimenten kunnen richten op na de tijdelijke herverdeling specifieke IC subtypen met behulp van antilichamen specifiek tegen verschillende kanalen, pompen en uitwisselaars (bijv NHE, H ⁺ pomp) aangegeven. Eerdere studies bleek dat de meerderheid van de ionocytes gekleurd met mitochondrion-rijke kleurstof tentoonstelling NKA immunologische ^4. Innervatie van de IC kan worden opgespoord door middel van een primair antilichaam tegen zebravis afgeleide neuron-specifiek antigeen (Zn-12). In deze studie, α-5 en zn-12 primaire antilichamen werden gedetecteerd met dezelfde secundaire antilichaam (Alexa Fluor 488) voor beide. Deze beperking komt zowel primaire antilichamen worden opgewekt in een muis gastheer en wordt overwonnen door het feit dat de NKA-rijke cellen en neuronen morfologisch te onderscheiden hoewel ze fluoresceren dezelfde kleur. Sequentiële vlekkenmet verschillende secundaire antilichamen (bijv eerste α-5 met Alexa Fluor 488 dan zn-12 met Alexa Fluor 594) kan ook worden gebruikt om het probleem van beide markers fluorescerende dezelfde kleur elimineren. Ten slotte kan de volledige bilaterale zenuw snijden protocol worden aangepast aan de zenuwen aan specifieke kieuwbogen richten. Bijvoorbeeld, kan selectieve zenuw snijbeweging worden uitgevoerd op de eerste kieuwboogslagader door voorzichtig scheiden van de eerste en tweede kieuwbogen de zenuwen naar de eerste kieuwboogslagader aan de dorsale einde van de kieuw mand (Figuur 2B-E) blootstellen. Het tijdverschil techniek kan ook worden toegepast om de verdeling van ionocytes in larvale zebravis vis bestuderen in hun ontwikkeling en ionentransport overgangen van de huid naar de kieuw.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
MitoTracker Red	Life Technologies	M-7512
Dimethyl sulfoxide	Sigma Alrdich	D2650
α-5 primaire antilichaam	Develompental Hybridoma Bank	a5
zn12 primaire antilichaam	Develompental Hybridoma Bank	zn12
Alexa Fluor 488 (anti muis)	Life Technologies	A-11001
Benzocaïne	Sigma Alrdich	E1501	4-aminobenzoëzure ethylester, ethyl 4-aminobenzoaat
Vannas veerscharen	Fine Science Tools	15000-10
Standaard patroon pincetten	Fine Science Tools	11000-12	recht
Standaard patroon pincetten	Fine Science Tools	11001-12	gebogen
Dumont nr. 5 pincetten	Fine Science Tools	11252-30
Weefselretractor	Fine Science Tools	17009-07
Paraformaldehyde	Sigma Alrdich	P6148
Triton X	Sigma Alrdich	X100
Vectashield met DAPI	Vector Laboratories	H-1200