Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese

Samenvatting

Deze video-artikel illustreert een uitgebreid protocol om alle stadia van neurogenese van de hippocampus bij volwassenen binnen dezelfde weefselsectie te detecteren en te kwantificeren. We hebben een methode ontwikkeld om de beperkingen van indirecte meervoudige immunofluorescentie te overwinnen die zich voordoen wanneer geschikte antilichamen van verschillende gastheersoorten niet beschikbaar zijn.

Samenvatting

Volwassen neurogenese is een sterk gereguleerd, meertraps proces waarbij nieuwe neuronen worden gegenereerd uit een geactiveerde neurale stamcel via steeds gecommitteerde tussenliggende progenitor subtypes. Elk van deze subtypen drukt een reeks specifieke moleculaire merkers die, samen met specifieke morfologische criteria, kunnen worden gebruikt voor hun identificatie. Typisch worden immunofluorescentie technieken toegepast waarbij subtype-specifieke antilichamen in combinatie met exo- of endogene proliferatiemerkers. We beschrijven hierin immunokleuring werkwijzen voor de detectie en kwantificering van alle stadia van volwassen hippocampale neurogenese. Deze bestaan ​​uit de toepassing van thymidine-analogen, transcardial perfusie, weefsel verwerking, warmte-geïnduceerde epitoopversterking, ABC immunohistochemie, meerdere indirecte immunofluorescentie, confocale microscopie en cel kwantificering. Verder presenteren we een sequentiële multipele immunofluorescentie protocol welke problemen u omzeiltsually voortvloeien uit de noodzaak van het gebruik van primaire antilichamen opgewekt in dezelfde soort gastheer. Het maakt het mogelijk een nauwkeurige identificatie van alle hippocampus voorlopercellen subtypen samen met een wildgroei marker binnen één sectie. Deze technieken zijn een krachtig instrument om de regelgeving van de diverse voorlopercellen subtypes in parallel, hun betrokkenheid bij de hersenen pathologieën en hun rol in specifieke hersenfuncties te bestuderen.

Inleiding

Twee hersengebieden constitutief het genereren van nieuwe neuronen gedurende het hele leven, de subventriculaire zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone (SGZ) van de hippocampus dentate gyrus (DG). De pasgeboren neuronen afkomstig van neurale stamcellen en gaan door verschillende stadia van de morfologische en fysiologische ontwikkeling vóór het bereiken van volwassenheid ^1,2. Van een langzaam delende radiale glia-achtige stamcel (type 1) opeenvolgende stadia van doorvoer versterken tussenliggende voorlopercellen ontstaan. Hoe meer ongedifferentieerde subtypes (type 2a en het type 2b) hebben een onregelmatige vorm met korte, tangentiële processen. Zij genereren neuroblasts (type 3) de celcyclus verlaten geleidelijk aan onvolwassen neuronen (met dendrieten uitgebreid tot de moleculaire laag) en tenslotte integreren in de hippocampus netwerk rijpe granule cellen. Vanwege hun bijzondere fysiologische eigenschappen van deze cellen de schakelingen met verhoogde plasticiteit ³ suggesting een unieke rol in de hippocampus functie. Eigenlijk, studies van de laatste tien jaar substantieel bewijs dat volwassen neurogenese bijdraagt ​​aan ruimtelijk geheugen, patroon scheiding en emotioneel gedrag ^4,5 gegenereerd.

Volwassen neurogenese kan worden bestudeerd met behulp van verschillende benaderingen. Thymidine analogen nemen in DNA tijdens de S-fase van de celcyclus en mogelijk geboorte dating, kwantificering en lot analyse van pasgeboren cellen ^6-8. Opeenvolgende toepassing van verschillende thymidine analogen (bv CldU, edu of IDU) kan worden gebruikt voor celvernieuwing of celpopulaties geboren op verschillende tijdstippen in de loop van een experiment ⁹ bestuderen. Een alternatief, endogene marker voor celproliferatie is Ki67. Het wordt uitgedrukt in delende cellen gedurende alle fasen van de celcyclus (G1, S, G2, M), behalve de rustfase (G0) en begin G1 ^10,11. Om het fenotype van de pasgeboren celpopulaties analyseren de volwassen dentate gyrus verschillende fase-specifieke moleculaire markers kunnen worden gebruikt, zoals GFAP, nestine, DCX en NeuN ^1,6. GFAP is een merker rijpe astrocyten maar zich ook in radiale glia-achtige cellen in de volwassen voorhersenen. Nestin een intermediair filament specifiek voor radiale glia-achtige cellen en vroege tussenproduct progenitorcellen. DCX is een microtubule geassocieerde eiwit expressie intermediair progenitors, neuroblasts en onvolwassen neuronen. Op basis van de (co-) expressie van deze drie markers en de morfologische kenmerken van de gelabelde cellen vier verschillende progenitorcel subtypen worden onderscheiden: type 1 (GFAP ^+, nestine ^+, DCX ^-), het type 2a (GFAP ^-, nestine ⁺ , DCX ^-), het type 2b (GFAP ^-, nestine ^+, DCX ⁺⁾ en type 3 (GFAP ^-, nestine ^-, DCX ^{+) 1.} Co-etikettering van DCX met NeuN, dat wordt uitgedrukt in postmitotische neuronen, maakt de differentiatie van immature (DCX ^+, NeuN ⁺⁾ en volwassen (DCX ^-, NeuN ⁺⁾ korrel neuronen.

De hierboven vermelde merkers worden vaak gebruikt voor immunofluorescentie co-labeling en daaropvolgende confocale microscopie met het aantal en de identiteit van pasgeboren cellen geanalyseerd. Dit vereist gewoonlijk antilichamen van verschillende gastheersoorten ongewenste antilichaam kruisreactiviteit voorkomen. De meeste primaire antilichamen geschikt voor neurogenese onderzoek worden gebracht hetzij in konijnen of muizen (bijvoorbeeld muizen α-BrdU, muis α-NeuN, konijn α-Ki67, konijn α-GFAP). Dit leidt tot ernstige beperkingen in het aantal en de combinatie van antigenen die in één segment kan worden geëvalueerd. Hierdoor verhoogt niet alleen de kleuring inspanning, als meervoudige kleuringen moeten worden uitgevoerd, maar kan ook gevaar opleveren voor de betrouwbaarheid van de resultaten. Bovendien zijn sommige antigenen zijn gevoelig voor formaline-fixatie geïnduceerde epitoop maskeren (bijvoorbeeld Ki67, Nestine). We beschrijven hierin wijzigingen van de klassieke enkelvoudige als meervoudige immunokleuring protocollen (bijvoorbeeld epitoop, meerdere opeenvolgende immunokleuring, gebruik van nestin-GFP transgene muizen ¹²⁾ dat veel van deze problemen overwinnen. Met name de sequentiële multipele immunofluorescentie kleuring protocol maakt tegen maximaal vier verschillende antigenen, zelfs indien een deel van de antilichamen afgeleid van dezelfde gastheer. Dit maakt de gelijktijdige detectie van het type 1, type 2a, het type 2b en type 3 progenitorcellen, alsook hun proliferatie activiteit in één sectie.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures waarbij levende dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de EG-richtlijn 86/609 / EEG van de Raad richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren en door de lokale ethische commissie (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) goedgekeurd uitgevoerd.

1. intraperitoneale injectie van Thymidine Analogs

1. Weeg de dieren op de dag voor injectie. Bereken de hoeveelheid thymidine analoge vereist voor alle injecties gepland op de volgende dag als individuele gewichtsgecorrigeerde injectievolumes van een 10 mg / ml stamoplossing.
2. Bereid 10 mg / ml thymidine stamoplossing. (LET OP! Thymidine analogen zijn giftig. Volg de specifieke Material Safety Data Sheets (MSDS) die door de leveranciers, dat wil zeggen, slijtage laboratoriumjas en handschoenen, gebruik een chemische dampkap).
   1. Neem thymidine analoog uit de vriezer en breng het naar RT, ong. 21 ° C. Weeg 10 mg en voegsteriele zoutoplossing (voor BrdU en CldU) of 0,04 N NaOH (in steriele zoutoplossing, want IDG), vortex. Gedurende ten minste 10-15 minuten in een 50 ° C waterbad en vortex elke 2-3 min het poeder oplost.
      OPMERKING: Gebruik oplossingen tot 24 uur indien bewaard bij kamertemperatuur en gedurende enkele weken bij -20 ° C. Bescherm oplossingen van licht (cover met aluminiumfolie). Controleer altijd voor neerslagen en opnieuw te ontbinden indien nodig.
3. Weerhouden de muis door het nekvel en intraperitoneaal injecteren van een passende, op gewicht aangepast volume van de stockoplossing (bij RT) met een fijne dosis spuit met een 30 G naald.
   OPMERKING: Indien CldU en IDU sequentieel in hetzelfde dier toegediend, overwegen equimolaire concentraties injecteren (bijvoorbeeld 42,5 mg / kg CldU en 57,5 mg / kg IDU, die overeenkomen met 50 mg / kg BrdU). Daarom dienovereenkomstig aanpassen het injectievolume van 10 mg / ml voorraadoplossingen.

2. Tissue Voorbereiding

1. Prepare 4% formaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,4 op de dag voor perfusie. Bewaar bij 4 ° C.
2. Transcardially perfuseren de diep verdoofde muizen (3,5% isofluraan) via de linker ventrikel met 10 ml ijskoude PBS, daarna met 40 ml ijskoude formaldehyde (stroomsnelheid 5 ml / min). Prepareer de hersenen en post-fix in hetzelfde fixeermiddel gedurende 24 uur bij 4 ° C.
3. Breng de hersenen achtereenvolgens in 10% (24 uur bij 4 ° C) en 30% sucrose (tot de hersenen wastafels, ong. 48 uur). Voor het invriezen, langzaam onderdompelen cryobeschermd hersenen in -25 ° C isopentaan tot er geen luchtbellen ontstaan ​​uit het weefsel. Bewaren bij -80 ° C.
4. Snijd coronale secties van 40 pm dikte op een ijskoude microtoom (blok temperatuur op -25 tot -16 ° C). Sequentieel overdracht secties in antivries oplossing met putjes van een 24-well celkweek plaat (zie figuur 1). Bewaren bij -20 ° C.

Figuur 1. Schematische weergave van het overbrengen van microtoom plakjes in een 24-well plaat. Begin bij de A1 en leg daarop plakjes in rij A, na de A6 naar de volgende rij B, enzovoort. Bij het bereiken van D6, ga terug naar de A1 en ga verder. Deze opstelling van segmenten maakt kwantificering van elk ^nde deel van een gehele hersenen. Voor kwantificering van de pasgeboren cellen nemen elke ^6e hersenen gedeelte (gelijk aan de inhoud van één kolom), voor immunofluorescentie fenotypering nemen elke ^12de deel (equivalent aan de inhoud van 2 afwisselende rijen van een kolom).

3. Immunokleuring

OPMERKING: Secties worden verwerkt vrij zwevende, meestal in 6-well platen uitgerust met een draagplaat en mesh inserts. Bij wijze van uitzondering, het blokkeren, antilichaam incubatie en ABC reactie worden gedaan in 12- of 24-well platen zonder gaas inzetstukken (0,5 tot 1 ml per well voldoende, afhankelijk van het aantal segmenten die moeten worden gekleurd). Tijdens deze stappen overdragen secties met behulp van een fijne borstel (spoelen met elke nieuwe oplossing). Alle incubaties worden uitgevoerd onder voortdurend roeren (max 150 rpm).

1. Immunohistochemie (ABC-methode)
   1. Transfer secties van antivries in TBS en naspoelen (eenmaal O / N bij 4 ° C, 5 keer bij kamertemperatuur gedurende 10 min elk) volledig te verwijderen antivries.
   2. Incubeer gedurende 30 min in 1,5% H ₂ O ₂ in TBS-T om endogene peroxidase activiteit te blussen. Besteed aandacht aan het borrelen en opnieuw onderdompelen secties indien nodig. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
   3. Optioneel: Verwarm ondertussen een verwarmingskast en 2N HCl tot 37 ° C. Incubeer secties gedurende 30 minuten bij 37 ° C in 2 N HCl DNA denatureren. Voorzichtig afzonderlijke secties met behulp van een borstel.
   4. Optioneel: Neutraliseren secties 10 min in 0,1 M boraatbuffer pH8.5, RT. Tijdens het overzetten kort zwabberen de mesh inzetstukken met de secties op een papieren handdoek om HCl leavings verwijderen. Spoel 2 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
   5. Incubeer in TBSplus het weefsel doorlaatbaar en niet-specifieke antilichaam bindingsplaatsen, 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd.
   6. Incubeer in primaire antilichaam verdund in TBSplus, O / N bij 4 ° C. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
   7. Incubeer in gebiotinyleerd secundair antilichaam verdund in TBSplus, 3 uur bij kamertemperatuur. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk. Ondertussen ...
   8. Bereid ABC complex volgens protocol van de fabrikant (1% A + 1% B in TBS-T). Laat gedurende 30 minuten staan ​​bij kamertemperatuur voor gebruik. Incubeer secties AB reagens gedurende 1 uur bij KT. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
   9. Bereid 50 ml 0,5 mg / ml DAB in TBS-T per 6- of 12-well plaat, opgesplitst in twee helften en pipet 4 ml of 2 ml per well, respectievelijk. Transfer secties in DAB-oplossing (LET OP! DAB is giftig. Volg de specific VIB verstrekt door de leverancier, dat wil zeggen, slijtage laboratoriumjas en handschoenen, gebruik een chemische dampkap).
   10. Voeg 0,5 ml 1% H ₂ O ₂ de resterende 25 ml DAB oplossing, mengen en pipet dezelfde hoeveelheden als hierboven beschreven om elk putje te peroxidase reactie te starten. Incubeer gedurende 12 min. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
   11. Mount secties om dia's in gelatine, lucht drogen O / N. Dekglaasje met permanente montage medium.
   12. Optioneel: tegenkleuring voor het plaatsen van het dekglaasje (zie paragraaf 3.5).
       OPMERKING: Als de signaal-ruisverhouding is laag vanwege de hoge achtergrond, herhaal H ₂ O ₂ behandeling na de incubatie met AB reagens (stap 3.1.8).
2. Multiple-immunofluorescentie
   1. Enkelvoudige of meervoudige gelijktijdige immunofluorescentie
      1. Transfer secties van antivries in TBS en naspoelen (eenmaal O / N bij 4 ° C, 5 keer bij kamertemperatuur gedurende 10 min elk) volledig te verwijderen eentifreeze.
      2. Optioneel: als de stappen 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Incubeer in TBSplus het weefsel doorlaatbaar en blok aspecifieke antilichaam bindingsplaatsen, 1 uur bij KT.
      4. Incubeer in primaire antilichaam cocktail (bijvoorbeeld rat α-BrdU, cavia α-DCX, geit α-GFP) verdund in TBSplus, O / N bij 4 ° C. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
      5. Incubeer in cocktail van fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichamen (bijvoorbeeld, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cavia, Alexa-488 α-geit; allemaal afgeleid in ezel) verdund in TBSplus, 3 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Vanaf nu secties bescherming tegen licht. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk.
      6. Mount secties om dia's in gelatine, lucht drogen O / N. Dekglaasje met waterige montage medium.
   2. Sequentiële meerdere immunofluorescentie met primaire antilichamen van dezelfde host soorten
      1. Zoals stappen 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Incubeer in fieerste primair antilichaam (bijvoorbeeld konijn α-antigeen A), O / N bij 4 ° C. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
      3. Incubeer in eerste fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam (bijvoorbeeld, Rhodamine Rood-conj. Ezel α-konijn), 3 uur RT. Vanaf nu secties bescherming tegen licht. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
      4. Incubeer in 10% normaal serum van dezelfde host als de primaire antilichamen (bijvoorbeeld, konijn serum) gedurende 3 uur RT open paratopen verzadigen op de eerste secundaire antilichaam. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
      5. Incubeer in TBSplus met 50 ug / ml niet geconjugeerde monovalente Fab-fragmenten gericht tegen de gastheer van de primaire antilichamen (bijvoorbeeld, α-konijn IgG (H + L)) naar epitopen die kunnen worden herkend door de tweede secundaire antilichaam, O / N in te dekken 4 ° C.
      6. Spoel minstens 3 maal in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk. Tijdens het overzetten kort swab de mesh inzetstukken met de secties op een papieren handdoek om elke Fab leavings verwijderen.
      7. Incubeer in tweede primaire antilichaam (bijvoorbeeld konijn α-antigen B), O / N bij 4 ° C. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
      8. Incubeer in tweede fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam (bijv Alexa-488-conj. Ezel α-konijn), 3 uur RT. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk, monteren en dekglaasje hierboven.
         OPMERKING: Om antigenen met antilichamen labelen van verschillende gastheerspecies voeg ze toe aan stap 3.2.2.2 en de respectievelijke secundaire antilichamen naar stap 3.2.2.3.
   3. Een van de secondaire antilichamen van dezelfde soort als één van de primaire antilichamen
      LET OP: Dit protocol is geschikt voor quadruple-kleuring tegen BrdU of Ki67 samen met GFAP, nestine-GFP en DCX.
      1. Volg strikt protocol stappen 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Tot op dit moment alleen te gebruiken ezel serum in TBSplus.
      2. Incubeer in TBSplus bevattende 3% geit serum gedurende 1 uur bij KT. Dit omvat geopend paratopen op de α-geit secundair antilichaam. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
      3. Incubeer in het AMCA-conj. geit α-konijn verdund in TBSplus, 3 uur RT of O / N 4 ° C. Driemaal spoelen in TBS gedurende 15 minuten elk, monteren en dekglaasje hierboven.
   4. CldU, IDG co-kleuring
      1. Spoelen, denatureren en neutraliseren secties zoals beschreven in paragraaf 3.2.1 (stappen 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Incubeer bij 20 ug / ml ongeconjugeerd Fab-fragmenten α-muis IgG (H + L) in TBSplus, 1 uur bij KT. Spoel 4 maal in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
      3. Incubeer in primair antilichaam cocktail bevattende rat α-BrdU (1: 400; gezuiverde IgG2) en muis α-BrdU (1: 350) verdund in TBSplus, O / N bij 4 ° C. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
      4. Incubeer in het secundair antilichaam cocktail met gebiotinyleerd ezel α-rat (1: 500) en FITC-conj. ezel α-muis Fab-fragmenten (1: 100). Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk.
      5. Incubeer in Rhodamine Rood-conj. Streptavidin, 2 uur bij KT. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk, monteren en dekglaasje hierboven.
   5. Amplificatie van fluorescentiesignaal in nestin-GFP muizen
      1. Voeg geit α-GFP aan het primaire antilichaam cocktail.
      2. Voeg een fluorochroom geconjugeerd secundair antilichaam met spectrale eigenschappen vergelijkbaar met GFP (zoals Alexa 488 conj. Ezel α-geit) aan het secundaire antilichaam cocktail.
3. Epitoopversterking
   1. Voeren epitoopversterking na het spoelen uit antivries. Verwarm stomer met 6- of 12-well platen met 0,1 M citraatbuffer pH 6,0-95 - 99 ° C (ongeveer 25 min).
   2. Breng de secties in de hete citraatbuffer en stoom gedurende 30 min (bovenkant van de platen met aluminiumfolie als plastic lids zijn niet hittebestendig).
   3. Onmiddellijk plaats de platen in een ijsbad afgekoeld. Dit helpt om weefsel morfologie, hetgeen vooral van belang bij het werken met hersencoupes van postnatale dieren te beschermen.
   4. Spoel 3 maal in TBS gedurende 10 min elk spoelen en neutraliseren citraat en verder kleuring.
4. Muizenantistoffen op de muis weefsel
   1. Voeg 20 ug / ml monovalente Fab-fragmenten α-muis IgG (H + L, dezelfde gastheersoort dan secundair antilichaam) aan de eerste blokkerende stap (bijvoorbeeld stap 3.1.5 of 3.2.1.3).
   2. Spoel 4 keer in TBS en eenmaal in TBS-T voor 10 minuten elk, en ga verder met bijbehorende protocol.
5. Cresylviolet tegenkleuring
   1. Verwarm cresylviolet oplossing tot 60 ° C (in glazen pot). Incubeer dia's in de hete oplossing gedurende 3 min.
   2. Spoel in aq. dest. en dehydrateren 2 maal gedurende 1 min elk in 70%, 96% en 100% isopropanol.
   3. Clear voor 5-6 min in xyleen of een xyleen vervanger en dekglaasje met een compatibele permanente montage medium.

4. Data Analyse

1. Telling peroxidase gekleurde pasgeboren cellen in elke ^6e doorsnede langs de gehele rostrocaudal omvang van de dentate gyrus. Gebruik een lichtmicroscoop bij 400X vergroting.
2. Vermenigvuldig het resulterende celaantallen de kruising interval van een schatting van de totale aantallen pasgeboren cellen te verkrijgen.
3. Afbeelding de fluorescentie gemerkte secties met een confocale laser microscoop uitgerust met geschikte lasers en filtersystemen. Neem image stacks op willekeurige posities langs de gehele omvang van de dentate gyrus bij 400X vergroting en analyseren ten minste 50 willekeurig gekozen cellen van belang per halfrond voor co-labeling met andere markers.
4. Vermenigvuldig de verkregen percentages van gelijktijdig gelabelde cellen (% / 100) van het totale aantal pasgeboren cellen te berekenen absoluteaantal specifieke pasgeboren celpopulaties.

Resultaten

We pasten de hierboven beschreven kwantificeren en karakteriseren pasgeboren cellen in de postnatale en volwassen hippocampus methoden. Daarom gebruikten we wildtype en neurogenese-deficiënte cycline D2 knock-out (Ccnd2 KO) muizen gehuisvest onder voorwaarden bekend om de snelheid van neurogenese (dwz, verrijkt milieu, EE) ^13,14 beïnvloeden. Immunohistochemische kleuring met DAB of Ki67, BrdU, CldU of IDU consistent gebleken verschillen pasgeboren aantal cellen tussen wildtype en Ccnd2

Discussie

Kwantificering en identificatie van subpopulaties van pasgeboren cellen is een centraal thema in het volwassen neurogenese onderzoek. De combinatie van proliferatie markers en antilichamen tegen eiwitten die tijdens bepaalde stadia van volwassen neurogenese maakt immunohistochemische detectie van deze subpopulaties. Sommige antilichamen of antilichaam combinaties vereisen specifieke kleuring omstandigheden.

Labeling van delende cellen met synthetische thymidine analogen nog steeds de gouden ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU	Sigma-Aldrich	B9285	toxic (mutageen, teratogeen)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU	Sigma-Aldrich	C6891	toxic (mutageen, teratogeen)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU	MP Biomedicals	2105478	toxic (mutageen, teratogeen)
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU	MP Biomedicals	2100357	toxic (mutageen, teratogeen)
Weefselvoorbereiding
Isoflurane-Actavis	Piramal Healthcare	700211
Paraformaldehyde poeder (PFA)	Riedel-De Häen	16005	toxisch, ontvlambaar
Perfusie pomp PD5206	Heidolph Instruments	523-52060-00
Masterflex Tygon lab slang, Ø 0,8 mm	Thermo Fischer Scientific	06409-13
Voedingsnaald, recht, 21 G, 1,75 mm olijfpunt, 40 mm	Agnthos	1036
Freezing microtome Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
24-well Cell cultuur multiwell platen	Greiner Bio-One	662160
Immunohistochemie
Tefal vitacuisine stoomgenerator	Tefal	VS 4001
Netwell 24 mm polyester gaas membraan inzetstukken	Corning	3479	voorgeladen in 6-well kweekplaten
Netwell 15 mm polyester gaas membraan inzetstukken	Corning	3477	voorgeladen in 12-well kweekplaten
Netwell kunststof 6-well carrier kit	Corning	3521	voor 24 mm polyester gaas membraan inzetstukken
Netwell kunststof 12-well carrier kit	Corning	3520	voor 15 mm polyester gaas membraan inzetstukken
Vectastain Elite ABC kit	Vector Laboratories	PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydraat)	Sigma-Aldrich	D-5637	carcinogeen, lichtgevoelig
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Primaire antilichamen
Rabbit IgG1 α-Ki67	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100; vereist epitoopgevoel
Rabbit α-GFAP, AS-3-GF	Synaptic Systems	173 002	1:500
Goat IgG (H+L) α-GFP	Acris Antibodies	R1091P	1:300
Mouse IgG1 α-nestin	Abcam	ab6142	1:200; vereist epitoopgevoel
Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin	Merck Millipore	AB2253	1:500
Rat IgG2a α-BrdU (ascites)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	voor detectie van BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Rat IgG2a α-BrdU (gezuiverd)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	voor detectie van CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Mouse IgG1 α-NeuN	Merck Millipore	MAB377	1:500
mouse IgG1κ α-BrdU	BD Biosciences	347580	Voor detectie van IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Secundaire antilichamen
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin	Dianova	711-065-152	1:500
Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin	Dianova	712-065-150	1:500
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin	Dianova	715-065-151	1:500
Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11006	1:250
Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11055	1:250
Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment	Dianova	715-097-003	1:100
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-605-151	1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	706-605-148	1:250
Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	712-295-150	1:250
Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	711-295-152	1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X	Dianova	706-296-148	1:250
Streptavidin-rhodamine Red-X	Dianova	016-290-084	1:500
Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA	Dianova	111-155-144	1:250, werkt alleen met rabbit α-GFAP
Hoechst 33342	Molecular Probes	H3570	1:1000
DAPI	Molecular Probes	D1306	1:1000
Blocking<