High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Summary

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

Abstract

Zowel transcriptionele en post-transcriptionele regulatie hebben een grote invloed op de genen expressie. Echter, algemeen aangenomen cell-based screening tests richten zich op transcriptionele regulatie, wordt hoofdzakelijk gericht op de identificatie van-promotor targeting moleculen. Hierdoor worden post-transcriptionele mechanismen grotendeels onbedekt door genexpressie gerichte medicijnen. Hier beschrijven we een celgebaseerde analyse gericht op het onderzoeken van de rol van het 3 'onvertaalde gebied (3'UTR) bij de modulatie van het lot van het mRNA, en identificeren van verbindingen kunnen wijzigen. De test is gebaseerd op het gebruik van een luciferase reporter construct dat het 3'-UTR van een gen van belang stabiel geïntegreerd in een ziekte-relevante cellijn. Het protocol bestaat uit twee delen, met als eerste aandachtspunt de primaire screening gericht op de identificatie van moleculen die luciferase activiteit na 24 uur behandeling. Het tweede deel van het protocolbeschrijft de toonbank screening nodig om verbindingen moduleren luciferaseactiviteit bepaald door de 3 'UTR discrimineren. Naast de gedetailleerde protocol en representatieve resultaten bieden we belangrijke overwegingen de assay ontwikkeling en validatie van de hit (s) op het endogene doelwit. De beschreven op cellen gebaseerde reportergentest zal kunnen wetenschappers moleculen modulerende eiwitgehaltes via post-transcriptionele mechanismen afhankelijk van een 3 'UTR identificeren.

Introduction

Lange tijd transcriptionele regulatie van genexpressie werd gedacht een belangrijke, zo niet exclusieve rol bij de controle eiwitproductie spelen. Accumuleren bewijs geeft echter aan dat de post-transcriptionele regulatie draagt ​​zoveel, zo niet meer dan, gentranscriptieregulatie cellulaire eiwitten overvloed ^1,2 bepalen. Post-transcriptionele regulatie van genexpressie is veel complexer en uitgebreider dan werd aanvankelijk gedacht. In feite, de verschillende fasen van de post-transcriptionele controle ontstaan ​​worden gereguleerd, waaronder mRNA verwerking, lokalisatie, omzet vertaling ³ en de recent beschreven RNA reversibele methylering ^4. Uit een aantal post-transcriptionele regulatie processen mogelijkerwijs betrokken, de assay hieronder beschreven betrekking op die waarin de mRNA 3 'niet-getranslateerde gebied (3'UTR). 3 'UTR breed treft mRNA lot voornamelijk via specifieke interactie van RNA-bindende proteins en niet- coderende RNA's zijn regulerende sequenties en / of secundaire structuren ^5. Daarom zullen kleine moleculen die deze interacties veranderen of het stroomopwaartse signaaltransductiewegen het evenwicht dat eiwitgehalte regelt verschuiven. Deze therapeutische aanpak is bijzonder belangrijk voor menselijke pathologieën waarvoor bewijs bestaat blijkt dat ziekte-relevante genen worden onderworpen aan post-transcriptionele regulatie, die dus een potentieel doelwit voor farmacologische interventie. Daarom kunnen-systemen voor het screenen van modulators mRNA 'door interferentie met post-transcriptionele controlemechanismen in een high-throughput format waardevol voor de identificatie van potentiële nieuwe behandelingen geworden.

De beschreven celgebaseerde reportergen assay maakt de identificatie van verbindingen kunnen mRNA lot moduleren via mechanismen afhankelijk zijn 3 'UTR. Het bestaat uit verschillende voornaamste cSPECTEN (Figuur 1) en vereist enkele voorbereidende stappen om de haalbaarheid van de assay te valideren. Allereerst wordt de reporter construct ontworpen om de 3 'UTR van een gen van belang omvatten. De 3 'UTR is gefuseerd aan het einde van een reportergen zoals vuurvlieg luciferase (figuur 1). Wijzigingen in post-transcriptionele mechanismen uitgeoefend door de geplaatste 3'UTR de stabiliteit en / of translatie efficiëntie van deze chimère transcript veranderen, waardoor verschillende luciferase niveaus. Daarom veranderingen in luciferaseactiviteit dienen als indirecte maat van getroffen post-transcriptionele regulatie van het gen van belang. De tweede component van het systeem is een controle reporter construct, een identieke expressieplasmide dat hetzelfde reportergen expressie maar geen 3 'UTR bevat. De twee reporter plasmiden kunnen worden ontworpen in het laboratorium met behulp van conventionele moleculaire biologie protocollen of gekocht van commerciële bronnen.

De keuze van een geschikte cellijn is cruciaal voor de test constructie. Welke cellijn is het optimale model is afhankelijk van tal van factoren, variërend van klinische eisen, zoals maximale gelijkenis met pathologie om gewoon praktische zaken als beschikbaarheid, transfecteerbaarheid, en groei-eigenschappen. Belangrijk voor gaan moet men ervoor zorgen dat fusie van 3 'UTR voor het reportergen heeft een verwachte effect op het niveau van de chimère transcript. De afwezigheid van significante verschillen in luciferase signaal van de 3 'UTR-dragende en controle reporterconstructen transiënt getransfecteerd in de geselecteerde cellen zou aangeven dat de 3' UTR is niet functioneel in dit cellulaire model gevraagd voor het zoeken van alternatieve modellen. Voor de high-throughput formaat, moet de 3 'UTR-dragende en controle luciferase reporter constructen stabiel geïntegreerd in de geselecteerde cellijn. Met een stabiel geïntegreerd over tijdelijk getransfecteerdcellijn voorkeur om verschillende redenen. Dit zal de keuze van een cellulair model inclusief hard-to-transfecteren cellijnen te verbreden, de variabiliteit van de gegevens als gevolg van schommelingen in de transfectie-efficiëntie afnemen, verdwijnen de kosten. Bovendien, na transiënte transfectie cellen worden vaak overbelast met een DNA plasmide leidt tot de verzadiging van het systeem. In deze instellingen een verdere verhoging van de reporter expressie kan lastig zijn, wat resulteert in verminderde gevoeligheid voor potentiële upregulating verbindingen.

Tenslotte, wanneer alle testcomponenten zijn ingesteld, is het essentieel voordat de hoge-doorvoer formaat om de haalbaarheid van de assay, dwz bepalen of luciferaseactiviteit inderdaad op- en neerwaarts gereguleerd via de ingebrachte 3'specifiek kan worden UTR. De beste controles zou kleine moleculen gemeld aan de stabiliteit of vertaalbaarheid van mRNA moduleren door de 3 'UTR van belang. Als het hebben van deze isniet mogelijk is, surrogaat controles imiteren het gewenste effect worden geaccepteerd. Dit kunnen miRNAs of RNA bindende eiwitten bekend om hun effecten uit te oefenen via binding aan de 3 'UTR van belang. Evaluatie van dergelijke controles voor de primaire screening geeft niet alleen de functies van de ontwikkelde assay, maar zorgt ook voor de schatting van het dynamisch bereik, gevoeligheid en prestaties in de high-throughput formaat.

Met behulp van de beschreven protocol we gescreend een 2000-verbinding bibliotheek ^6. Neuroblastoma is de meest voorkomende extracraniale vaste tumor van de kindertijd, werd gebruikt als een biologisch model en de 3 'UTR van het MYCN oncogen wiens amplificatie voorspelt sterk negatieve uitkomst van neuroblastoom, een doelgen ^7. Figuur 2 beschrijft de experimentele opmaak. De screening was verdeeld in drie runs met de batch grootte van 27 platen gescreend in één run. De partij van 27 platen opgenomen Spectrum collectie bibliotheekplaten n.1-n.8 + N.25 (eerste run), n.9-N.16 + N.25 (tweede run) en N.16-N.24 + N.25 (derde run), elk plaat gescreend in drievoud. Zo is een bibliotheek plaat (n.25) werd bepaald binnen alle drie de punten mogelijk te maken inter-run vergelijking. Onder het protocol beschrijft een enkele run van 9 bibliotheek platen in drievoud getest.

Protocol

OPMERKING: De doorvoer van dergelijke testsystemen afhankelijk van de beschikbare HTS labs. Dit protocol wordt vergemakkelijkt door een Tecan Freedom EVO 200 robot, die vloeistofverwerking in 96 putjes uitvoert. Miniaturisatie 384 putjes ook. De robot liquid handling systeem is gepositioneerd onder een laminaire stroming kap om aseptische omstandigheden te handhaven gedurende alle experimentele stappen. Indien geen vloeistofverwerking automatisering beschikbaar is, kan het protocol gemakkelijk worden aangepast lage doorvoer format.

Primary Screening

1. Dag 1: Voorbereiden en Zaad Cellen

OPMERKING: Seed cellen 80% confluentie verkregen op het moment van testen luciferaseactiviteit, dwz 48 uur na enten.

1. Resuspendeer getrypsiniseerd CHP134-mycn3UTR neuroblastoma cellen tot een concentratie van 2 x 10 ⁵ cellen / ml in RPMI met 10% FBS en 1% L-glutamine. 27 petrischaal ten minste 250 ml celsuspensie rekening houdend met liquid handling, troggen dode volumes en herhaalde pipetteerstappen. Giet de celsuspensie in steriele reservoir en plaats het op de robot bureau.
2. Plaats 9 barcode witte platte bodem 96-well platen en een doos van 200 ul steriele pipet tips over de robot bureau. Meng de celsuspensie door pipetteren vóór elke dispensatie stap om cellen te voorkomen afwikkeling onder zwaartekracht. Doseer 75 ul van cellen in elk putje van 9 platen tot een uiteindelijke dichtheid van 1,5 x 10 ⁴ cellen per putje te krijgen.
3. Bedek de platen met de deksels en laat ze buiten de incubator gedurende 30 minuten om de cellen te sedimenteren op de bodem van de put. Dit zal edge effecten te minimaliseren.
4. Herhaal de stappen 1.2 en 1.3 maal om een ​​totaal aantal 27 petrischaal.
5. Plaats de platen bij 37 ° C en 5% _CO2 en incubeer gedurende 24 uur.

2. Dag 2: Behandel de Cellen met Bibliotheek Verbindingen

ntent "> NB: The Spectrum Collection kleine molecule bibliotheek bestaat uit 2000 verbindingen gerangschikt in 8 rijen en 10 kolommen van 25 platen met 96 putjes bij een concentratie van 10 mM in DMSO De putjes op de eerste en laatste kolommen leeg gelaten controles. . Samengestelde screeningstesten worden meestal uitgevoerd op 1-10 uM concentratie van de verbinding ^8. De screening protocol hier beschreven lost 2 uM als de werkende concentratie en 24 uur als de test eindpunt.

1. Ontdooi 9 verbindingsbibliotheek platen bij kamertemperatuur.
2. Bereid twee troggen met steriele PBS en PBS-0,5% DMSO oplossingen en leg ze op de robot bureau. Voor elke bibliotheek plaat, voor te bereiden en te labelen dienovereenkomstig een verdunning plaat - een polypropyleen U-bodem 96-well plaat met een werkvolume van ten minste 400 pi. Vul elk putje van de kolommen 2 tot 11 van verdunning platen met 398 ul van steriele PBS met behulp van vaste uiteinden van de vloeistof handler. Vul kolommen 1 en 12 met 50 pi steriel PBSmet 0,5% DMSO om de concentratie voertuig in de controleputjes (0.02%) te reproduceren.
3. Plaats twee bibliotheek platen, de overeenkomstig het label verdunningsplaten, twee dozen van 50 ul steriele pipet tips en zes cellen platen op de robot bureau. Onthullen cellen platen.
4. Pipetteer 2 pl van de 10 mM voorraadoplossing van één van beide bibliotheek platen in de overeenkomstige verdunning plaat en meng. Dit resulteert in een tussenliggende verbindingen concentratie van 50 uM. Met behulp van dezelfde set van tips, afzien 3 pl van de 50 uM verdunning in 3 barcode witte 96-well platen met cellen. Deze verdunning schema leidt tot 2 uM werkende concentratie van elke geteste verbinding.
   OPMERKING: Om onnodige manipulaties te vermijden met de tips, gebruik maken van een volledige set van 96 tips vanaf het begin, hoewel de bibliotheek platen bevatten slechts 80 verbindingen. Dit is mogelijk omdat de eerste en laatste kolommen van de bibliotheek platen leeg.
5. Plaats de pipet tips en herhaal Step 2.4 voor de tweede bibliotheek plaat.
6. Bedek de cellen platen en terug naar de incubator gedurende 24 uur.
7. Herhaal stap 2,3-2,6 twee keer voor de overige bibliotheek platen.

3. Dag 3: Voer luciferasetest

OPMERKING: Voordat de luciferase assay, is het mogelijk om het multiplexen met cellevensvatbaarheid assay gebaseerd op vermindering van Resazurin om een cel-levensvatbaarheid index verkrijgen uit elk putje ^9. Multiplexing luciferase en levensvatbaarheid assay tests leidt tot een vermindering van luciferase signaal dat wel kan worden genegeerd als de cellen voldoende hoog niveau van luciferaseactiviteit. Luciferase activiteit kan worden gedetecteerd door een verscheidenheid van commerciële en zelfgemaakte ^10,11 luciferase assay reagentia met stabiele luminescent signaal.

1. Equilibreer de gereconstitueerde luciferase reagens van keuze tot kamertemperatuur. Zorg ervoor dat het volume is genoeg voor al de geteste platen. Voor 27 plaats 170 ml luciferase reagens nodig inachtneming vloeistofverwerking, troggen dood volume en herhaald pipetteren stappen. Giet de luciferase reagens in een reservoir en plaats het op de robot bureau.
2. Verwijder 9 platen met cellen uit de incubator, plaats ze op de robot bureau, bloot te leggen en te wachten tot op kamertemperatuur. Voeg 50 ul van de luciferase reagens per well plaat door plaat. Tussen de platen, de invoering van een vertraging die gelijk is aan de luminescentie leestijd van een plaat. Dit zal ervoor zorgen dat alle platen worden gemeten binnen gelijk tijdsinterval van de toevoeging van reagens.
3. Na een incubatie van 30 minuten, plaats de eerste plaat in de lichtmeter en meet luminescentie na een korte schudden stap. Herhaal dit voor alle platen. Noteer de streepjescode van elke plaat en koppelen aan de bijbehorende gegevensbestand om fouten als gevolg van een groot aantal behandelde platen voorkomen.
4. Herhaal stap 3,2-3,3 tweemaal voor de resterende 18 platen met cellen.
5. Verzamel de resterende luciferase reagens en het op -20 ° C.

4. Dag 4: Data Analysis

1. Proces experimentele gegevens met normalisatie van monsters het gemiddelde van on-plate-vehikel behandelde controles. Voor elke bibliotheek verbinding, het berekenen van de gemiddelde waarde X en SD dan drievoud.
2. Selecteer up-regel- en downregulerende klappen, door een drempel van x ± k × SD, waar de gemiddelde waarde X en SD zijn berekend over alle assay verwerkt waarden, en k een bepaald constant.
3. Selecteer een willekeurige drempel cut-off <20% van de met medium behandelde controles wanneer een vermindering van luciferase signaal wordt zeer waarschijnlijk verband met toxiciteit verbinding. Gooi de klappen onder deze drempel zal een aantal vals-positieve hits in de contra-screening aanzienlijk verminderen.
   OPMERKING: In plaats van op controle gebaseerde normalisatie, kunnen experimentele gegevens worden verwerkt toepassing van Z-score of haar robuuste analoge B skern ^12. Bovendien moeten alternatieve statistische benaderingen voor hit selectie zijn beschikbaar ^12.

5. Counter-screening

OPMERKING: Verbindingen die in het primaire scherm (met het label 'hits') worden bevestigd en geëvalueerd voor de specificiteit van een contra-screening.

1. Kersen plukken de geselecteerde hits uit de monsters opgeslagen in enkele 2D barcode buizen en nieuwe "hit platen", het redden van de bijbehorende lay-out. Vergeet niet om vrije posities te verlaten voor de controles.
   Opmerking: In de afwezigheid van een efficiënte cherry-picking systeem, zou men zowel de controle- en 3 'UTR-dragende cellen in parallel in de primaire screening testen. In dit geval worden specifieke selectie van verbindingen met effecten alleen afhankelijk van de geïntroduceerde 3'UTR mogelijk nadat de primaire screening overbodig contra-screening. Echter, de parallelle screening twee cellijnen de assay verdubbelenkosten.
2. Naar aanleiding van het protocol voor de primaire screening (hoofdstuk "Dag 1: Voorbereiden en Seed Cells"), voor elke "hit bord" te bereiden drie 96-well platen van elk CHP134-mycn3UTR en CHP134-CTRL stabiele cellen.
3. Naar aanleiding van het protocol voor de primaire screening (hoofdstuk "Dag 2: Behandel de Cellen met Bibliotheek Compounds"), gebruik dan elke hit plaat tot drie CHP134-mycn3UTR en drie CHP134-CTRL platen behandelen op 2 uM werken concentratie.
   Opmerking: Als de teller scherm beschreven wordt uitgevoerd in triplo in de enkelvoudige dosis van 2 uM, kan het gunstig zijn de standaard replica vervangen en test de hits in 3 concentraties van 10-voudige verdunningen variërend van 2 uM tot 20 nm. Deze benadering zou niet alleen mogelijk maken de gegevens van het primaire scherm te bevestigen, maar ook voorlopige dosis-respons gegevens op de primaire treffers verkrijgen minimaliseren vals-positieven. In dit geval moet een andere analyse pipeline toepas zijned aan de experimentele gegevens te verwerken en bevestigen van de hits.
4. Naar aanleiding van het protocol voor de primaire screening (hoofdstuk "Dag 3: Voer luciferasetest"), het meten van luciferase-activiteit in alle CHP134-mycn3UTR en CHP134-CTRL platen.
5. Na het protocol voor de primaire screening (hoofdstuk "Dag 4: Data Analysis"), normaliseren experimentele gegevens van behandelde putten de gemiddelde on-plate-vehikel behandelde controles en berekent het gemiddelde en SD in duplo. Voor elke verbinding getest, berekenen de voudige verandering van luciferase-activiteit in CHP134-mycn3UTR vs. CHP134-CTRL-cellen. Selecteer willekeurige voudige verandering cut-offs van> 1,5 en betekenis p-waarden van <0,01.
   OPMERKING: In de test beschreven instellingen de parameter determinant voor hit specificiteit is een belangrijke voudige verandering van luciferase-activiteit in CHP134-mycn3UTR vs. CHP134-CTRL-cellen. Indien nodig, kan men ook verbinding toxiciteit te beoordelen door het uitvoeren gelijktijdig een levensvatbaarheid van de cellen test op de seteerde verbindingen. Dit kan vooral nuttig zijn wanneer het primaire treffers tegen gescreend in een dosis-respons analyse. Voor een enkele dosis, onze ervaring wijst op een sterke correlatie van verminderde luciferase-activiteit met een verminderde levensvatbaarheid van de cellen ^6. Derhalve verminderde luciferaseactiviteit in doelcellen en controleputjes worden beschouwd als een indicator van de toxiciteit verbinding bij de geteste concentratie.

Results

Met de beschreven benadering gescreend we een 2000 verbindingsbibliotheek voor potentiële modulatoren van post-transcriptionele mechanismen uitgeoefend door de 3 'UTR van het MYCN gen. Figuur 3 toont de resultaten van de primaire screening geïllustreerd door een enkele bibliotheek plaat. Luciferase signaal weergegeven als percentage van met drager behandelde controles werd verkregen door het meten van luciferaseactiviteit in drievoud platen CHP134-mycn3UTR cellen behandeld met verbindingen ...

Discussion

Dit protocol beschrijft een cel-gebaseerde reporter-gen assay die gericht is op de identificatie van modulatoren die zich richten op 3’ UTR-afhankelijke post-transcriptionele processen. Het omvat de primaire screening en de tegenscreen en kan, indien nodig, vergezeld gaan van een cytotoxiciteitstest. Het resultaat van de primaire screening is een aantal waardevolle kandidaatverbindingen, waarvan de reproduceerbaarheid en specificiteit verder wordt gevalideerd in de tegenscreening.

De identific...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plate 96-well White	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)	PerkinElmer	6008190
100 ml disposable trough for reagents	Tecan	10 613 048
300 ml disposable robotic reservoir	VWR	PB12001301
Robot tips DITI 50 µl Sterile	Tecan	30038607
Robot tips DITI 200 µl Sterile	Tecan	30038617
Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luciferase Assay System	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamine 200 mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
The Spectrum collection (compound library)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 robot	Tecan	N/A
Tecan F200 multiplate reader	Tecan	N/A