High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Samenvatting

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

Samenvatting

Zowel transcriptionele en post-transcriptionele regulatie hebben een grote invloed op de genen expressie. Echter, algemeen aangenomen cell-based screening tests richten zich op transcriptionele regulatie, wordt hoofdzakelijk gericht op de identificatie van-promotor targeting moleculen. Hierdoor worden post-transcriptionele mechanismen grotendeels onbedekt door genexpressie gerichte medicijnen. Hier beschrijven we een celgebaseerde analyse gericht op het onderzoeken van de rol van het 3 'onvertaalde gebied (3'UTR) bij de modulatie van het lot van het mRNA, en identificeren van verbindingen kunnen wijzigen. De test is gebaseerd op het gebruik van een luciferase reporter construct dat het 3'-UTR van een gen van belang stabiel geïntegreerd in een ziekte-relevante cellijn. Het protocol bestaat uit twee delen, met als eerste aandachtspunt de primaire screening gericht op de identificatie van moleculen die luciferase activiteit na 24 uur behandeling. Het tweede deel van het protocolbeschrijft de toonbank screening nodig om verbindingen moduleren luciferaseactiviteit bepaald door de 3 'UTR discrimineren. Naast de gedetailleerde protocol en representatieve resultaten bieden we belangrijke overwegingen de assay ontwikkeling en validatie van de hit (s) op het endogene doelwit. De beschreven op cellen gebaseerde reportergentest zal kunnen wetenschappers moleculen modulerende eiwitgehaltes via post-transcriptionele mechanismen afhankelijk van een 3 'UTR identificeren.

Inleiding

Lange tijd transcriptionele regulatie van genexpressie werd gedacht een belangrijke, zo niet exclusieve rol bij de controle eiwitproductie spelen. Accumuleren bewijs geeft echter aan dat de post-transcriptionele regulatie draagt ​​zoveel, zo niet meer dan, gentranscriptieregulatie cellulaire eiwitten overvloed ^1,2 bepalen. Post-transcriptionele regulatie van genexpressie is veel complexer en uitgebreider dan werd aanvankelijk gedacht. In feite, de verschillende fasen van de post-transcriptionele controle ontstaan ​​worden gereguleerd, waaronder mRNA verwerking, lokalisatie, omzet vertaling ³ en de recent beschreven RNA reversibele methylering

Protocol

OPMERKING: De doorvoer van dergelijke testsystemen afhankelijk van de beschikbare HTS labs. Dit protocol wordt vergemakkelijkt door een Tecan Freedom EVO 200 robot, die vloeistofverwerking in 96 putjes uitvoert. Miniaturisatie 384 putjes ook. De robot liquid handling systeem is gepositioneerd onder een laminaire stroming kap om aseptische omstandigheden te handhaven gedurende alle experimentele stappen. Indien geen vloeistofverwerking automatisering beschikbaar is, kan het protocol gemakkelijk worden aangepast lage doorvoer format.

Primary Screening

1. Dag 1: Voorbereiden en Zaad Cellen

Resultaten

Met de beschreven benadering gescreend we een 2000 verbindingsbibliotheek voor potentiële modulatoren van post-transcriptionele mechanismen uitgeoefend door de 3 'UTR van het MYCN gen. Figuur 3 toont de resultaten van de primaire screening geïllustreerd door een enkele bibliotheek plaat. Luciferase signaal weergegeven als percentage van met drager behandelde controles werd verkregen door het meten van luciferaseactiviteit in drievoud platen CHP134-mycn3UTR cellen behandeld met verbindingen .......

Discussie

Dit protocol beschrijft een cel-gebaseerde reporter-gen assay die gericht is op de identificatie van modulatoren die zich richten op 3’ UTR-afhankelijke post-transcriptionele processen. Het omvat de primaire screening en de tegenscreen en kan, indien nodig, vergezeld gaan van een cytotoxiciteitstest. Het resultaat van de primaire screening is een aantal waardevolle kandidaatverbindingen, waarvan de reproduceerbaarheid en specificiteit verder wordt gevalideerd in de tegenscreening.

De identific.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Culture plate 96-well White	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)	PerkinElmer	6008190
100 ml disposable trough for reagents	Tecan	10 613 048
300 ml disposable robotic reservoir	VWR	PB12001301
Robot tips DITI 50 µl Sterile	Tecan	30038607
Robot tips DITI 200 µl Sterile	Tecan	30038617
Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luciferase Assay System	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamine 200 mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
The Spectrum collection (compound library)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 robot	Tecan	N/A
Tecan F200 multiplate reader	Tecan	N/A