Methodenartikel

Imaging Ca

12.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52588

⸱

6 mei 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Ophthalmic Research, University of Tübingen, 2Graduate School of Cellular & Molecular Neuroscience, University of Tübingen, 3Bernstein Centre for Computational Neuroscience, University of Tübingen, 4Molecular Genetics Laboratory, University of Tübingen, 5Centre for Ophthalmology, University of Tübingen

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol om Ca 2+ dynamiek in de axon terminals van de kegel fotoreceptoren met behulp van een ex-vivo slice voorbereiding van de muis netvlies controleren. Dit protocol maakt uitgebreide studies van de kegel Ca 2+ signalering in een belangrijke zoogdieren modelsysteem, de muis.

Samenvatting

Retinale kegel fotoreceptoren (kegels) dienen daglicht visie en zijn de basis van discriminatie kleur. Zij zijn onderhevig aan degeneratie, vaak leidt tot blindheid in veel retinale ziekten. Calcium (Ca 2+), een belangrijke tweede messenger in fotoreceptor signalering en metabolisme, is voorgesteld om indirect gekoppeld fotoreceptor degeneratie bij verschillende proefdiermodellen. Systematisch bestuderen van deze aspecten van de fysiologie en pathofysiologie kegel is belemmerd door de problemen van elektrisch opnemen van deze kleine cellen, met name in de muis waar de retina wordt gedomineerd door rod fotoreceptoren. Om dit probleem te omzeilen, hebben we een twee-foton Ca 2+ imaging protocol met behulp van een transgene muis lijn die de genetisch gecodeerde Ca 2+ biosensor TN-XL spreekt exclusief in kegels en kan worden gekruist met muismodellen voor fotoreceptor degeneratie. De hier beschreven protocol omvat het bereiden verticale secties (R20; plakjes ") van de netvliezen van muizen en optische beeldvorming van licht-stimulus opgewekte veranderingen in de kegel Ca 2+ niveau. Het protocol maakt het ook "in-slice meting" van absolute Ca 2+ concentraties; de opnamen worden gevolgd door kalibratie. Dit protocol maakt het onderzoek naar functionele kegel eigenschappen en zal bijdragen aan het begrip van kegel Ca2 + signalering alsook de mogelijke rol van Ca2 + in fotoreceptor dood en retinale degeneratie.

Inleiding

Visie begint met het licht geïnduceerde activatie van de fototransductie cascade in retinale fotoreceptoren. Rod fotoreceptoren maken visie bij lage lichtniveaus, terwijl kegel fotoreceptoren bemiddelen kleur en een hoge-resolutie daglicht visie. Veel fotoreceptor-specifieke genen zijn gevoelig voor mutaties die leiden tot degeneratie van deze cellen. Verschillende moleculaire markers geassocieerd met fotoreceptor verlies zijn geïdentificeerd 1, maar tot nu toe de gedetailleerde moleculaire mechanismen en de reeks gebeurtenissen onduidelijk. Gewijzigde Ca2 + homeostase werd gespeculeerd een trigger lichtontvankelijke celdood, een hypothese wordt ondersteund door de up-regulatie van de activiteit van Ca2 + -afhankelijke protease calpaïne-type gedurende het degeneratieproces 2,3 zijn. Echter, tot op heden deze hypothese wordt ondersteund door niet fysiologische metingen van Ca2 +. Inconsistenties in verscheidene studies naar het effect van Ca2 + kanaalblokkers in retinal ziekten verder uitgedaagd de betrokkenheid van Ca 2+ in celdood 4-6, bellen naar methoden om rechtstreeks te beoordelen Ca 2+ in zoogdiercellen conus fotoreceptoren.

Eerder hebben de meeste elektrische opname- en Ca2 + imaging studies uitgevoerd bij amfibieën en reptielen modellen vanwege de gemakkelijkere toegang tot kegels 7-9. Kunnen echter zoogdieren fotoreceptor fysiologie verschilt van die van niet-zoogdieren 10 en in het bijzonder zijn, in de context van menselijke erfelijke retinale degeneratie, een beter begrip van zoogdier fotoreceptor fysiologie een sleutel voor de ontwikkeling van innovatieve geneesmiddelen. Veel muismodellen nabootsen van de menselijke retinale aandoeningen zijn beschikbaar, maar er is weinig bekend over Ca 2+ dynamiek in de muis kegels 11. Elektrische technieken zijn niet geschikt voor high-throughput opnamen van kegels, met name niet bij muizen, waarbij staven (~ 97%) aanzienlijk overtreffen kegels (~ 3%) 12 . Bovendien gevoelige elektrofysiologische technieken zoals whole-cell patch-clamp opnames verstoren de intracellulaire milieu en de gegevens over Ca 2+ stromingen maar niet bieden op absolute intracellulaire Ca 2+ concentraties. Vandaar dat ondanks de lagere temporele resolutie, beeldvorming is de voorkeurswerkwijze bij de aanpak vragen cone Ca2 + dynamics. Het belangrijkste probleem met beeldvorming is hoe de kegels selectief labelen met een fluorescerende Ca 2+ indicator kleurstof. Juiste compartimentalisatie en celspecificiteit is moeilijk te bereiken door "bulk-loading" synthetische Ca2 + indicator kleurstof in het weefsel. Bijgevolg gelabeld kegels, staven 13,14 en Müller gliacellen kunnen niet betrouwbaar worden onderscheiden. Ook synthetische kleurstoffen hebben de neiging om lekken van de cellen, het voorkomen van langdurige opnames onder constante omstandigheden. Bovendien, het laden van synthetische Ca 2+ indicatoren in hun AM-ester vorm is problematisch, omdat het vereist dereinigingsmiddelen (bijvoorbeeld DMSO) genereert formaldehyde 15. Voor absolute Ca 2+ metingen ratiometrisch indicatoren zijn verplicht. Echter, de beste momenteel beschikbare synthetische ratiometrische indicator Fura-2 vereist excitatielicht in het traject van 700-760 nm (twee-foton excitatie), die afhankelijk van de intensiteit, kan op zichzelf stimuleren de conussen, en dus studies belemmeren kegel Ca 2+ dynamiek onder fysiologische verlichting omstandigheden.

In tegenstelling tot synthetische kleurstoffen, kunnen genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren berekend in een celtype selectieve wijze. Ze hebben geen lekken uit cellen en derhalve als bleking wordt vermeden, langdurige en betrouwbare radiometrische metingen mogelijk. Type-selectieve celexpressie Ca2 + biosensoren, in combinatie met twee-foton microscopie, vormt een krachtig instrument voor het beoordelen en bestuderen subcellulaire Ca2 + grotendeels onder fysiologische omstandigheden 13,16,17 . Hier beschrijven we een protocol aan het licht-stimulus opgeroepen cone Ca 2+ studeren dynamiek in een transgene Ca 2+ biosensor muis lijn (HR2.1: TN-XL), die de FRET-gebaseerde Ca 2+ biosensor TN-XL 18 uitdrukt selectief in kegels, onder de menselijke rode opsin promotor HR2.1 19. Om toegang te krijgen tot de kegel terminals, een ex-vivo slice voorbereiding 20 werd toegepast. Het protocol werd al met succes toegepast in drie studies op kegel functie in gezonde muizen 10,21,22. Bovendien is het protocol maakt het bestuderen conus Ca 2+ signalering in specifieke genetische aandoeningen, bijvoorbeeld door het kruisen van muismodellen voor erfelijke retinale degeneratie met HR2.1: TN-XL muizen.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd vast te houden aan de richtlijnen en wetgeving voor de bescherming van dieren vastgesteld door de Duitse federale regering en de institutionele dierenwelzijn commissie van de universiteit van Tübingen goedgekeurd.

1. Dierlijke Modellen

  1. HR2.1: TN-XL Ca 2+ biosensor muis
    1. Gebruik de transgene HR2.1: TN-XL muis lijn uiting van de Ca 2+ biosensor TN-XL selectief in kegel fotoreceptoren 10. Gebruik 3-6 weken oude muizen van beide geslachten verhoogd met een standaard 12 uur dag / nachtritme.

2. netvlies Dissection

  1. Fysiologische oplossing
    1. Bereid vers 2 L van extracellulaire oplossing, die 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,25 mM NaH 2PO 4, 26 mM NaHCO 3, 0,5 mM L-glutamine en 20 mM (+) glucose. Meng totdat alle ingrediënten lossen.
    2. "Bubble" extracellulaire oplossingmet carboxygen (95% O2, 5% CO2) gedurende 5-10 min. Toevoegen CaCl 2 tot een concentratie van 2 mM te bereiken.
    3. Na borrelen de extracellulaire oplossing, meet de pH. De pH moet 7,4, anders is het waarschijnlijk dat fouten bij de bereiding van de oplossing zijn gegeven. Houd borrelende snelheid en temperatuur van de oplossing constant gedurende experiment om een ​​constante pH te verzekeren.
    4. Scheid de bouillon in 2 flesjes, een voor netvlies dissectie en één voor de opname setup (perfusie).
  2. Eye enucleatie en isolatie van het netvlies (5-10 min)
    1. Handhaaf een dim rode verlichting in het werkgebied voor de enucleatie. Gebruik LEDs met een piek golflengte van 650 nm (of meer) te bleken van kegels tijdens dissectie voorkomen.
    2. Dark-passen de muis voor 2 uur door de invoering van zijn kooi in een goed geventileerde, lichtdichte doos om ervoor te zorgen dat de kegels volledig worden gesensibiliseerd ten tijde van de opnames.
    3. Verdoven de muis onder een laboratory kap met isofluraan (5%) met een verdamper en een gasdichte container die een standaard muis kooi houdt. Volg de instructies van de fabrikant bij het hanteren van de verdamper. Gebruik handschoenen en een gezichtsmasker om blootstelling aan allergenen.
    4. Gebruik een binoculair microscoop met een 10 - 40x vergroting voor dissectie.
    5. Offer het verdoofd muis door onthoofding.
    6. Voor oriëntatie, markeren de top van elk oog (= dorsale) met een watervaste stift. Blijf op de hoogte van het feit of het gebruik van links of rechts oog.
    7. Verwijder het oog voorzichtig met gebogen schaar door het snijden van de oogzenuw achter de oogbal. Voor de ontleding, de overdracht van de oogbol naar een petrischaal met vers carboxygenated extracellulaire oplossing. Voor het overbrengen van de oogbol, houd hem bij de oogzenuw stomp.
    8. Doorboren het oog op elk punt langs de grens tussen het hoornvlies en de sclera (dat wil zeggen, bij de ora serrata) met een scherpe injectienaald.
    9. Houd de egij ten sclera met een pincet en voorzichtig steek een schaar blad in het gat in de vorige stap. Knip langs de ora serrata aan het voorste deel van het oog (cornea, lens, glasachtig lichaam) vanaf het achterste gedeelte (oogdop) scheiden. Snijd de oogschelp radiaal (naar de optische disc) ter plaatse van de pen merk de dorsale positie op het netvlies vermelden.
      Opmerking: Bereid Zo oogschelpen kan in steeds carboxygenated oplossing voor later gebruik bewaard.
    10. Draai de oogschelp in de petrischaal zodanig dat de dorsale gesneden punten weg van zichzelf. Pak de sclera links en rechts van de oogschelp met een pincet elk aan door de forceps tips tussen retina en sclera.
    11. Maak de retina door voorzichtig omkeren van de sclerale deel van de oogschelp. Tot slot, snijd de oogzenuw met behulp van micro ontleden schaar om het netvlies van de sclera te bevrijden.
      Opmerking: Dit is een kritieke stap. Voorkom schade aan het netvlies (bijvoorbeeld dooraanraken en knijpen met een tang).
    12. Houd een van de randen van het netvlies met een pincet en verwijder voorzichtig vuil en glasachtig lichaam van het netvlies oppervlak met een tweede paar pincetten. Wanneer het netvlies oppervlak schoon, gebruik van micro ontleden schaar om drie extra korter, radiale snijden (ongeveer elke 90 °) te maken. Deze bezuinigingen mogelijk maken om zorgvuldig plat het netvlies met de fotoreceptor kant naar beneden in de petrischaal (Figuur 1A).
  3. Slice voorbereiding (10 - 15 min)
    1. Bereid vooraf nitrocellulosefilter membranen voor retinale snijden en glazen afdekplaat-slips voor montage plakjes en over te dragen aan de opname kamer. Snijd nitrocellulosefilter membraan in ongeveer 10 x 5 mm grote rechthoekige stukken met een schaar. Snijd coverslips in ongeveer 10 x 5 mm grote rechthoekige stukken met behulp van een glassnijder.
    2. Langzaam onderdompelen een glasplaatje in de extracellulaire oplossing nabijweefsel. Voorzichtig, trek de retina op het glas dia met de ganglion cel kant naar boven door grijpen het op de rand met behulp van een pincet. Dit proces vermindert mechanische beschadiging en vouwen van weefsel.
    3. Kies het gebied van de retina die verband houdt met de betreffende vraagstelling (zie ook bespreking). Vergeet niet, de lange snede gemaakt in stap 2.2.9 markeert de dorsale netvlies helft (Figuur 1A). Snijd een rechthoekig, ongeveer 1 x 2 mm en kleinbedrijf stuk uit de geselecteerde retinale regio met behulp van een gebogen scalpel. Veeg overtollige oplossing rond het weefsel.
    4. Plaats het filtermembraan bovenop het stuk retina zodat de ganglioncellen zijde zich aan het membraan. Onmiddellijk voeg een druppel extracellulair medium op het membraan om het weefsel stevig aan het membraan.
    5. Breng de membraan gemonteerd netvliesweefsel aan het snijden kamer met verse extracellulaire oplossing.
    6. Snijd retina in verticale plakjes van 200 micrometerdikte (Figuur 1B) met eenzelfde scheermesje gekoppeld aan een weefsel chopper 23. Wijzig mes voor elke netvlies stuk.
      Opmerking: Het scheermesje moet perfect uitgelijnd met het oppervlak van het snijden kamerbodem zodanig is dat de membraan splitst tegelijkertijd, zoals aangegeven door een "klikken" geluid bij het zagen - anders het zaagblad verbuigen en beschadiging van de slice.
    7. Lijm een single-membraan gemonteerd slice een glazen afdekplaat slip door het toepassen van hoog vacuüm vet aan het membraan eindigt pas (figuur 1C). Houd het glasoppervlak onder het netvlies vetvrij.
    8. Keep-dekglaasje gemonteerd plakjes bedekt door een daling van de extracellulaire oplossing op het bedrijf kamer - een gesloten en lichtdicht container, bijvoorbeeld, een petrischaal met het deksel afgedekt met aluminiumfolie - onder een carboxygen atmosfeer bij RT. Introduceer carboxygen door borrelen een klein waterreservoir aan de sfeer in het bedrijf te houdenkamer bevochtigde; Dit voorkomt dat de plakken uitdroogt.
    9. Laat plakjes te rusten in het bedrijf kamer voor 10 - 15 minuten vóór hen (één voor één) verhuizen naar de opname kamer. Slices kunnen worden gehandhaafd om 4-5 uur in bedrijf kamer bij RT (~ 21 ° C).

3. Twee-foton Ca 2+ Imaging

  1. Twee-foton microscopie
    1. Gebruik een beweegbare Doelstelling Microscope (MOM) type twee-foton microscoop. Zowel MOM ontwerp en imaging procedures werden eerder 24 beschreven, voor details zie ook 10,21,25 (voor bronnen en bedrijven, zie tabel 1).
      Opmerking: Elke staander twee-foton microscoop die de volgende minimale vereisten voldoet, worden gebruikt: Het moet worden uitgerust met (a) een gepulste laser afstembare tot ~ 860 nm, (b) minstens twee gelijktijdig verkregen fluorescentie kanalen, (c ) filtert voor eCFP en citrien fluorescentie, (d)een lichte stimulator (voor mogelijke ontwerpen, zie 24,26), en (e), software die het mogelijk maakt de opname-tijd verstreken afbeelding sequenties aan een frame rate voldoende om het Ca 2+ te lossen signalen van belang.
    2. Start de twee-foton beeldvormingssysteem zoals aangegeven door de fabrikant. Strikt op te volgen richtlijnen laserveiligheid van de faciliteit. Start de laser en afstemmen op ~ 860 nm.
    3. Transfer een plakje van de holding kamer naar de opname kamer en onmiddellijk beginnen perfuseren met carboxygenated extracellulaire oplossing. Handhaven van een perfusie stroomsnelheid van 2 ml / min en een temperatuur van 37 ° C in de opname kamer.
    4. Gebruik een 20X 0,95 NA water immersie objectief. Indien beschikbaar, gebruikt een CCD-camera in combinatie met een infra-rode LED onder opname kamer aan de retinale slice (figuur 2) te lokaliseren. Anders lokaliseren slice met behulp van twee-foton imaging (zie 3.1.5).
    5. Schakel over naar twee-foton beeldvorming om biosensor uitdrukking bekijken. Aanzettende twee detectie-kanalen voor fluorescentie beeldvorming van eCFP en citrien.
    6. Gebruik het beeld acquisitie software dat de twee-foton microscoop te scannen en selecteer een rij van cone-terminals voor het opnemen (figuur 3A) controleert. Set beeldacquisitie tot 128 x 16 pixels beelden (31.25 Hz) of een soortgelijke configuratie. Beperk de gescande gebied kegel terminals bleken van photopigments in de buitenste segmenten te voorkomen.
      Opmerking: Voor de TN-XL calcium sensor (τ = ~ 0,6 sec voor Ca 2+ binden, τ = ~ 0,2 sec voor Ca 2+ Vrijblijvende; zie 16) een minimale frame rate van ~ 8 Hz is aanbevolen.
  2. Lichtstimulatiebron en registratie
    1. Gebruik een sub-podium vol-veld licht stimulator zoals elders beschreven 10,21,26 de volgende stappen uit te voeren.
      Opmerking: Een eenvoudige oplossing voor een full-field licht stimulator is om twee band-pass-gefilterd LED's (bijvoorbeeld "blue": 360 BP 12, "groen": 578 BP 10) gebruikendie overeenkomen met de golflengte gevoeligheden van muis kegels maar tegelijkertijd niet overlappen met de filters voor fluorescentiedetectie (vgl. 3.2.4). Het licht van de LED's wordt gefocusseerd door de condensor door de bodem van de opname kamer (figuur 2). Voor meer informatie over deze stimulator ontwerp, het kalibreren, de lichtintensiteiten gebruikt en de opgeroepen cone foto-isomerisatie tarieven, zie 10,21,26.
    2. Zet de laser en laat kegels te passen aan de scanning laser en de stimulus achtergrond licht (20 - 30 sec, zie ook mogelijke valkuilen) alvorens het licht stimuli (zie 3.2.3) of het toepassen van farmacologische middelen.
    3. Presentatie starten willekeurige stimuli (bijvoorbeeld lichtflitsen, zoals getoond in figuur 3B, C). Bij de in stap 3.2.1 stimulator, genereren de stimuli door het moduleren van de intensiteit van de twee LED's in de tijd met behulp van een microprocessor board gecontroleerd door aangepaste software (Zie 10,21,26).
    4. Beginnen met het opnemen van de twee fluorescentie kanalen (bv bij 483 nm voor "blue" FRET-donor eCFP en bij 535 nm voor "geel" FRET-acceptor;. Voor specs zie tabel 1) gelijktijdig met de betreffende afbeelding acquisitie software (zie ook 3.1 .6). Bijvoorbeeld, in het geval van lichtflitsen (Figuur 3B, C), verslag tenminste 8-10 stimulus presentaties (trials).
  3. "In-slice" Ca 2+ kalibratie
    1. Record Ca 2+ signalen in kegel terminals (zoals beschreven in 3.1.6 en 3.2.4) en pak de basislijn Ca 2+ niveau in een set van kegels (zoals beschreven in 3.4).
    2. Schakel naar "Ca 2+ vrije" extracellulair medium met 5 uM ionomycine (opgelost in DMSO) en 10 mM EGTA (of, als alternatief, BAPTA) toegevoegd. Record kegel terminals weer iedere 5 minuten naar het minimale fluorescentie ratio (R min) te bepalen, dwz de verhouding in de (nabije) ontbreken van intracellulair Ca2 +. 30 min - Dit kan ergens tussen 15 nemen.
      Opmerking: perfusie systeem nodig waarmee schakelen tussen verschillende reservoirs.
    3. Schakel naar extracellulair medium met 5 uM ionomycine (opgelost in DMSO) en 2,5 mM Ca 2+. Na een incubatietijd van 5 minuten, registreren kegels vervolgens eens 5 min aan de maximale fluorescentie ratio (Rmax), dat wil zeggen, de verhouding in de aanwezigheid van verzadigende concentraties van intracellulair Ca2 + te meten. 15 min voor de Ca 2+ verhouding stabiel geworden - na ionomycine toepassing is, kan het tussen de 3 nemen.
      Opmerking: Blootstelling van de schijfjes naar hoog Ca2 + en ionomycine langer zal uiteindelijk schade aan de cellen. Neem alleen cellen in de analyse dat de normale morfologie behouden. Concentraties (dat wil zeggen, EGTA, ionomycine) moet mogelijk worden aangepast. Voor meer informatie over de Ca 2+ kalibratieprotocol, zie 13,17.
  4. Data-analyse
    Opmerking: Gebruik een beeldverwerking en data analyse software pakket compatibel met de betreffende microscoop software en in staat van het runnen van aangepaste analyse scripts.
    1. Plaats een imaging data-bestand en stelt de regio's van belang (ROI) rond elke kegel terminal (figuur 3A). Voor elk frame, de gemiddelde fluorescentie-intensiteit binnen het ROI en aftrekken achtergrondfluorescentie, vóór de berekening van de verhouding (R) tussen FRET-acceptor (citroengeel) en donor (eCFP) fluorescentie (R = A F / F D, Figuur 3B, C). Deze ratio wordt meestal gebruikt als een proxy voor relatieve intracellulaire Ca 2+ concentratie, maar na kalibratie (zie 3.3), ook absolute concentraties kunnen worden geschat (zie 3.4.3).
      Opmerking: de steeltjes kunnen door hun locatie worden opgenomen in de buitenste plexiform laag en hun morfologie (enigszins afgevlakt "blobs" kleiner dan de kegelsomata, gelegen aan het einde van de kegel axon).
    2. Gemiddelde stimulus studies (Figuur 4A). Uittreksel responsparameters van gemiddelde sporen (figuur 4B), zoals Ca2 + basislijnniveau (R base) vóór lichtstimulatie, piekamplitude (R amp) en oppervlak onder de curve (RA) als bestrijdingsmaatregelen formaat. Ook, extract reactie kinetiek van gemiddelde sporen, zoals rise (t stijgen) en afvaltijd (t decay) (= respectieve tijdsintervallen tussen 20% en 80% van R amp; zie afbeelding in figuur 4B). Voor meer informatie over hoe deze parameters te bepalen, zie 10.
    3. Bereken een schatting van de absolute kegel Ca2 + -concentratie op basis van de metingen van stap 3.3.1-3.3.3. Gebruik de verhoudingen voor minimale en maximale Ca2 + -concentratie, Rmin en Rmax respectievelijk de donor fluorescentie in het Ca 2+ -gebonden (F D, Ca-gebonden) en -unbound (F D, Ca-vrij) staat, en de in-vivo dissociatieconstante (Kd = 0,77, zie 16) voor TN-XL met de volgende vergelijking (analoge naar 27):

figure-protocol-1

Resultaten

Door het combineren verticale segmenten (figuur 1) bereid uit HR2.1: TN-XL muis retina twee-foton imaging (figuur 2), konden we ratiometrische metingen van licht stimulus opgewekte Ca2 + signalen uitvoeren kegel fotoreceptor axon terminals . Deze aanpak betekent een aanzienlijke verbetering van de toegang tot en het visualiseren van de muis kegels over de pre-bestaande optische beeldvorming methoden met synthetische Ca 2+ indicatoren. Bijvoorbeeld, de kegel-specifieke expressie van de genetisch gecodeerde ratiometrische Ca2 + biosensor TN-XL aanzienlijk vergemakkelijkt de identificatie van conus axon terminals (ROI zie figuur 3A). Derhalve ons protocol elimineert het risico van opnamesignalen van onduidelijke oorsprong, zoals bijvoorbeeld "gemengde" signalen met bijdragen van zowel kegel en rod axon terminals.

Onze aanpak maakt het oplossen van single-proef reacties op het niveau van de individual cone axon terminal. Licht opgewekte extrusie van Ca2 + uit de kegel terminal wordt gekenmerkt door een toename en een afname van donor en acceptor fluorescentie respectievelijk (Figuur 3B). Afname van fluorescentieverhouding (R) overeenkomt met de extrusie van Ca2 + uit de kegel terminal (figuur 3C), veroorzaakt door licht geïnduceerde hyperpolarisatie van de kegel en vervolgens sluiten van spanningsafhankelijke Ca2 + kanalen. Omdat verschillende cone axon terminals tegelijk kunnen worden gevolgd (figuur 3A), gegevensverwerving is zeer efficiënt en honderden kegel Ca2 + responsen kunnen worden verzameld in een enkel experiment. Door het beoordelen van deze responsen kwantitatief (figuur 4), kan kegel Ca2 + signalen worden vergeleken en in diverse condities (zie bespreking) geëvalueerd.

Soms wordt de verhouding tussen de FRET-acceptor (citroengeel) en -donor (eCFP) fluorescentie gebruiken(F A / F D; voor meer informatie, zie 3.4) als een relatieve maat van de intracellulaire Ca 2+ niveau. Echter, daar waar nodig, de verhouding kan gekalibreerd absolute intracellulaire Ca2 + concentratie ([Ca2 +]) (figuur 5) te verkrijgen. Op de achtergrond verlichting gebruikt in dit protocol (voor details, zie 10 en Figuur 3 legende), kalibratie leverde een schatting van de absolute rust [Ca 2+] in "wild-type" HR2.1: TN-XL muis kegel terminals van 243 ± 159 nM (gemiddelde ± SD), die binnen het interval dat voor muizen in de literatuur 11.

figure-results-1
Figuur 1. Bereiding van verticale netvlies segmenten. (A) Geïsoleerde en afgeplatte retina voorbereid voor het snijden. (B) rechthoekig stuk van het netvlies (see red box aan A) bevestigd op filterpapier membraan (donkergrijs) na het doorsnijden. (C) Bovenaanzicht van het membraan gemonteerd netvlies slice op een glazen dekglaasje via smeervet vast. (D) Schematische tekening van een deel van een netvlies slice (zie rode doos in C). Cone fotoreceptoren worden aangegeven in het groen. V ventrale,; D, dorsale; N, neus; T, tijdelijke; OS, buitenste segment; ONL, buitenste nucleaire laag; OPL, buitenste plexiform laag; INL, binnenste nucleaire laag; IPL, innerlijke plexiform laag; GCL, ganglion cellaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Twee-foton beeldvorming van het netvlies plakken: Illustratie van de opname configuratie Top:. Water-immersie objectief scherpstellen het zijnam van de scanning laser (rode pijl omlaag) in de retina, en het verzamelen van de geëmitteerde fluorescentie (opwaartse pijlen). De lens verzamelt ook infrarood licht uitgezonden vanuit een verlichtingsbron LED onder de condensor gemonteerd bij beeldvorming van de plak met een CCD-camera Center:.. Retinale slice gemonteerd in de opname kamer en geperfuseerd met extracellulaire oplossing Bottom: condensorlens richten het licht van de stimulatie leds (en de infrarode LED voor CCD-camera beeldvorming) door het transparante bodem van de opname kamer in het retinale weefsel. IR LED, infrarood licht-emitterende diodes; CCD, ladingsgekoppelde inrichting; BP, band-pass. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Light-Evoked Ca 2+ reacties in axon terminals van de muis kegel fotoreceptoren. (A) Links: Recordings gericht op synaptische terminals (rode doos) van de kegel fotoreceptoren (groen) in het netvlies plakken Rechts:. Voorbeeld voor een opgenomen regio met 7 individuele terminals. Fluorescentie werd opgenomen met twee kanalen. Een voor de FRET-acceptor citroengeel (top; 535 BP 50) en een voor de FRET-donor eCFP (onder; 480 BP 32) (B) licht opgewekte veranderingen in citroengeel (FA) en eCFP (F D) fluorescentie geregistreerd in een ROI. (C) Ca2 + responsen (zoals F verhouding A / F D) van een kegel terminal een reeks 1 sec helder licht knippert 5 sec intervallen. ROI, regio van belang; BP, band-pass filter; F, fluorescentie-intensiteit; au, arbitraire eenheden; FRET, Förster resonance energy transfer; eCFP, cyaan verbeterde fluorescentie eiwit. Stimulus-intensiteit (als photo-isomerisatie tarief in 10 3 · P · s -1 per conus):. 13.0 en 12.8 voor de M- en S-opsins respectievelijk toevoeging op een achtergrond niveau (= LED's uit, excitatie laser scanning) van ~ 10 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Voorbeeldige kwantitatieve analyse van licht opgewekte kegel Ca 2+ reacties (A) licht opgewekte Ca 2+ reacties (als AR) uit één kegel terminal (single trials: grijze sporen, n = 16; gemiddelde:. Zwart trace ) (B) Parameters bepaald voor de gemiddelde Ca 2+ reactie:. Rustende Ca 2+ niveau (R voet) vertegenwoordigt de basislijn voorafgaand aan het licht stimulatie, reactie grootte als area-onder-de-curve (RA) en piek amplitude (R amp), verloop van de reactie begin (t stijgen, tijdsinterval van 20% tot 80% van R amp) en offset (t verval tijdsinterval van 80% tot 20% van de R amp). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Het schatten van absolute Ca 2+ concentratie. Resting Ca 2+ concentratie ([Ca 2+], zoals verhouding F A / F D) opgenomen in 8 kegel axon terminals in een TN-XL muis (cirkels, met een gemiddelde ± SD) voor verschillende extracellulaire oplossingen: tweemaal standaard extracellulaire medium (Ctrl 1 en 2) en daarna met minimaal ("zero") [Ca2 +] (10 mM EGTA) eend met hoge [Ca 2+] (2,5 mm), de laatste twee voorwaarden in de aanwezigheid van 5 uM ionomycine in evenwicht extracellulaire en intracellulaire Ca 2+. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Reeds bestaande protocollen met elektrofysiologische single-cell opnames of Ca 2+ imaging met synthetische fluorescente indicatoren strijd om de Ca 2+ dynamiek in de muis conus fotoreceptoren te nemen om een aantal technische redenen (zie inleiding). De hier beschreven protocol maakt de meting van Ca2 + signalen en ook de minst Ca2 + niveaus individu geïdentificeerd muis cone terminals op een efficiënte en relatief eenvoudige manier.

Dit protocol is al met succes toegepast in drie onderzoeken naar verschillende aspecten van de kegel functie in gezonde muis netvlies. In de eerste studie 10, de HR2.1: werd TN-XL muis kenmerk middels immunohistochemie, ERG opnames, twee-foton Ca2 + imaging en farmacologie, waaruit blijkt dat de conus-specifieke expressie van de Ca2 + biosensor niet belemmert kegel anatomie en functie. In de tweede studie 21, chromatischeen achromatisch respons eigenschappen van de muis kegels werden in kaart gebracht over het netvlies, demonstreren opvallende verschillen in kegel functie tussen de "groene"-opsin gedomineerde dorsale en de "blauwe"-opsin gedomineerde ventrale muis netvlies. Deze regionale verschillen in cone eigenschappen paste het differentieel contrastverdeling in de natuur (bijvoorbeeld, lucht vs. gemalen), wat suggereert dat de verschillende spectrale types muismodellen kegels voor (bijna) optimale bemonstering van achromatische contrasten en dus kan bieden een evolutionair voordeel. In de derde studie 22 de wederzijdse feedback die kegel axon terminals ontvangen van horizontale cellen werd onderzocht. Zoals alle voorgestelde horizontale cel feedback mechanismen inwerken op voltage-gated Ca 2+ kanalen in de kegel axon terminals 28, kan kegel terminal Ca 2+ dienen als een proxy voor horizontale cel-cone interacties. De studie van Kemmler en collega's 22 ondersteuningenvan mening dat de horizontale cellen gebruiken een complex feedback-systeem bestaat uit verschillende mechanismen om fotoreceptor glutamaat vrijkomen te beheersen.

Deze studies illustreren de veelzijdigheid van de beschreven protocol en laten zien dat het kan worden aangepast om een ​​groot aantal vragen over cone functie en de synaptische circuits. Bovendien maakt de studie protocol lokale Ca2 + signalering in de verschillende compartimenten kegel, naar een beter begrip van kegel fysiologie. Dergelijke kennis is belangrijk om te begrijpen pathofysiologische processen in degenererende kegels, om uiteindelijk zorgen voor de rationele ontwikkeling van mogelijke therapeutische benaderingen, in het bijzonder voor degeneratieve ziekten van kegels.

In het HR2.1: TN-XL muizenlijn, wordt de Ca2 + biosensor uitgedrukt gehele kegel, met uitzondering van de buitenste segment. Dit biedt een mogelijkheid voor directe en ratiometrisch beoordeling van Ca 2+ dynamisches in verschillende cone compartimenten. Aangezien veranderingen in Ca2 + stromen in de buitenste segment worden weerspiegeld in terminals via de membraanpotentiaal en de resulterende activatie van spanningsafhankelijke Ca2 + kanalen, kunnen processen in het buitenste segment indirect waargenomen.

Mogelijke valkuilen:

De ontleding van de retina is een kritische stap: In de muis, de retina scheidt van de oogschelp gewoonlijk tussen fotoreceptor buitensegmenten en pigment epithelium. Daarom worden de lichtgevoelige fotoreceptor buitenste segmenten van de geïsoleerde retina belicht en zeer gevoelig voor mechanische beschadiging. Grote zorg moet worden genomen niet beschadigt door op de fotoreceptor kant met gereedschap en bewegende het weefsel zijwaarts op een klevend oppervlak (bijvoorbeeld een filtermembraan).

Hoogwaardige netvlies plakken kan onder de microscoop worden herkend door hun schone snijvlak endoor een goed georganiseerde afdrukband laag met duidelijk gedefinieerde buitenste segmenten. Functionele evaluatie van slice kwaliteit kan snel worden gedaan door het knipperen helder licht stimuli en het bepalen van het percentage reagerende kegels (bijvoorbeeld in een gezichtsveld met 10-20 kegels). Hier dient reactie kwaliteit worden beoordeeld door het berekenen van de signaal-ruisverhouding (S / N) (amplitude van basislijnruis voordat het licht stimulus vs. amplitude van het licht respons); Een S / N van 2-3 worden beschouwd als het minimum. Gewoonlijk ontdoen we segmenten minder dan 50% responsieve kegels. Ook snijdt met kegels dat overmatige spontane stekelige gedrag (zie figuur 4 op 10) moet worden weggegooid geven.

Segmenten in de opname kamer die aan de bovenvermelde anatomische en functionele criteria tonen consistente responsen gedurende 1-2 uur (voor details van reactie consistentie, zie 10). Omdat plakjes overleven hours in de holding kamer, kan een succesvol experiment duren tot 6 uur. Het is opmerkelijk dat er een aantal beperkingen met betrekking tot het bestuderen lange bereik ruimtelijke interacties tussen kegels en horizontale cellen, zoals snijden onvermijdelijk snijdt dwarsverbindingen in retinale netwerken. Echter, de dikte van retinale plakjes 300 urn verzacht dit probleem 22.

Het gebruik van verticale netvlies plakken voorkomt scanning lichtgevoelig cone buitensegmenten de excitatielaser en dus zoveel mogelijk verhindert opsin bleaching (voor een uitgebreide bespreking, zie 10,21). Toch is de geregistreerde Ca2 + signalen niet alleen afhankelijk van het licht stimuli, maar ook aangetast door een achtergrondverlichting component gegenereerd door het scannen excitatielaser. In feite is de effectieve achtergrondverlichting zodanig twee-foton imaging experimenten is een combinatie van verstrooid laserlicht, fluorescerend licht geëmitteerd door de geregistreerde ceLLS, en alle LED stimulans achtergrond component. Daarom moet kegels mogen passen ten minste 20 - 30 s laser scanning (met achtergrondonderdeel van de lichtstimulus ingeschakeld) voorafgaand aan de opname.

Voordelen en toepassingen:

Terwijl sommige toepassingen voor dit kegel Ca 2+ -Imaging protocol hierboven 10,21,22 zijn beschreven, kunnen andere toepassingen worden voor ogen: farmacologische studies in combinatie met kegel Ca 2+ imaging kunnen valideren Ca 2+ signaalwegen in kegels en kon zijn gebruikt om de werkzaamheid en de potentie van drugs gericht verschillende spelers in Ca 2+ testen -signaling 10. Echter, een belangrijke applicatie zijn om ziekten van conus functie te bestuderen. Veel retinale degeneratie muismodellen nabootsen van menselijke ziekten beschikbaar zijn. Bijvoorbeeld, de kegel fotoreceptor verlies 1 (CPFL 1) muis is een primaire kegel degeneratie model lijdeneen Pde6c mutatie 29. Omgekeerd, de stang degeneratie 1 (rd 1) muis lijdt aan een PDE6B mutatie. Hoewel dit veroorzaakt primaire staaf fotoreceptor degeneratie 30, zodra rd 1 staaf verlies is voltooid, secundaire kegel degeneratie sets in 1. Kruisingen van deze dieren met de HR2.1: TN-XL lijn zal bestuderen en Ca 2+ dynamiek te vergelijken in zowel de primaire en secundaire kegel degeneratie en is waarschijnlijk waardevolle inzichten in de rol van Ca 2+ bieden tijdens kegel celdood. Ook farmacologisch geïnduceerde cone degeneratie - bijvoorbeeld met behulp van selectieve PDE6 remmers - kan dienen om de downstream mechanismen van kegel degeneratie 10,29,31 identificeren.

Samengevat, het protocol hier beschreven maakt het meten van Ca 2+ in subcellulaire compartimenten van de muis kegel fotoreceptoren en biedt grote kansen om kegel fysiologie te ontdekken onder een breed scalafysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt voor het screenen van farmacologische middelen ontworpen om te interfereren met kegel Ca2 + -signaling en aldus helpen om nieuwe therapieën voor ziekten conus vast.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 naar T.E. en T.S.; KFO 134 naar B.W. en F.P.D.), het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 naar T.E en T.B.), en de Europese Unie (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 naar M.K. en F.P.D.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Hoge vacuümvetDow Corning1018817http://www.dowcorning.com
DekglasjesR. Langenbrinck24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
GlijsjesR. Langenbrinck76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Bladen voor weefselsnijderMARTOR KGARGENTAX No. 10440,25 mm; http://www.martor.de
WeefselsnijderOp bestelling gemaaktGebaseerd op een ontwerp van F. Werblin23, aangepast door T. Schubert
Nitrocellulose filtermembraan met rasterMerck MilliporeAABG01300Filtertype: 0,8 µm; http://www.emdmillipore.com
Isofluraan CPCP pharmaAP/DRUGS/220/96http://www.cp-pharma.de
UV/groene LED-gebaseerde volledige-veld stimulatorOp bestelling gemaaktzie voor details10
Open source microprocessor boardArduinohttp://www.arduino.cc
Beeldvormingssoftware CfNTOp bestelling geschrevenontwikkeld door Michael Müller, MPI voor Medisch Onderzoek, Heidelberg, Duitsland
IgorProWavemetricshttp://www.wavemetrics.com
VC3-4 System focale perfusiesysteemALA Scientific Instrumentmet 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)Newport Spectra-Physicshttp://www.spectra-physics.com
Verplaatsbaar objectief microscoop (MOM),
Ontworpen door W. Denk, MPImF, Heidelberg, Duitsland		Sutter Instrumentshttp://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
[header]
XLUMPlanFL 20X/0.95w objectiefOlympushttp://www.olympusamerica.com
Verdamper 100 serieSurgivethttp://www.surgivet.com
Ionomycin, Calcium zoutLife technologiesI24222http://www.lifetechnologies.com
EGTASigma-AldrichE3889https://www.sigmaaldrich.com
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich101191250http://www.sigmaaldrich.com
Leica MZ95leica microsystemshttp://www.leica-microsystems.com/

Referenties

  1. Trifunovic, D., et al. Neuroprotective strategies for the treatment of inherited photoreceptor degeneration. Current Molecular Medicine. 12, 598-612 (2012).
  2. Paquet-Durand, F., et al. Calpain is activated in degenerating photoreceptors in the rd1 mouse. Journal of Neurochemistry. 96, 802-814 (2006).
  3. Paquet-Durand, F., et al. A key role for cyclic nucleotide gated (CNG) channels in cGMP-related retinitis pigmentosa. Human Molecular Genetics. 20, 941-947 (2011).
  4. Frasson, M., et al. Retinitis pigmentosa: rod photoreceptor rescue by a calcium-channel blocker in the rd mouse. Nature Medicine. 5, 1183-1187 (1999).
  5. Bush, R. A., Kononen, L., Machida, S., Sieving, P. A. The effect of calcium channel blocker diltiazem on photoreceptor degeneration in the rhodopsin Pro213His rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 2697-2701 (2000).
  6. Pawlyk, B. S., Li, T., Scimeca, M. S., Sandberg, M. A., Berson, E. L. Absence of photoreceptor rescue with D-cis-diltiazem in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 1912-1915 (2002).
  7. Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-dependent changes in outer segment free-Ca2+ concentration in salamander cone photoreceptors. The Journal of General Physiology. 113, 267-277 (1999).
  8. Choi, S. Y., et al. Encoding light intensity by the cone photoreceptor synapse. Neuron. 48, 555-562 (2005).
  9. Krizaj, D. Calcium stores in vertebrate photoreceptors. Advances in Experimental Medicine and Biology. 740, 873-889 (2012).
  10. Wei, T., et al. Light-driven calcium signals in mouse cone photoreceptors. The Journal of Neuroscience. 32, 6981-6994 (2012).
  11. Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Molecular Vision. 13, 887-919 (2007).
  12. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18, 8936-8946 (1998).
  13. Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nature Protocols. 1, 1057-1065 (2006).
  14. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46, 143-151 (2008).
  15. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290, 527-528 (1981).
  16. Hendel, T., et al. Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro. The Journal of Neuroscience. 28, 7399-7411 (2008).
  17. Dreosti, E., Odermatt, B., Dorostkar, M. M., Lagnado, L. A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo. Nature Methods. 6, 883-889 (2009).
  18. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, 1790-1796 (2006).
  19. Wang, Y., et al. A locus control region adjacent to the human red and green visual pigment genes. Neuron. 9, 429-440 (1992).
  20. Connaughton, V. P. Zebrafish retinal slice preparation. Methods in Cell Science. 25, 49-58 (2003).
  21. Baden, T., et al. A tale of two retinal domains: near-optimal sampling of achromatic contrasts in natural scenes through asymmetric photoreceptor distribution. Neuron. 80, 1206-1217 (2013).
  22. Kemmler, R., Schultz, k, Dedek, K., Euler, T., Schubert, T. Differential regulation of cone calcium signals by different horizontal cell feedback mechanisms in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 34, 11826-11843 (2014).
  23. Werblin, F. S. Transmission along and between rods in the tiger salamander retina. The Journal of Physiology. 280, 449-470 (1978).
  24. Euler, T., et al. Eyecup scope--optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina. Pflugers Archive. European Journal of Physiology. 457, 1393-1414 (2009).
  25. Baden, T., Berens, P., Bethge, M., Euler, T. Spikes in mammalian bipolar cells support temporal layering of the inner retina. Current Biology. 23, 48-52 (2013).
  26. Breuninger, T., Puller, C., Haverkamp, S., Euler, T. Chromatic bipolar cell pathways in the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 31, 6504-6517 (2011).
  27. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
  28. Thoreson, W. B., Mangel, S. C. Lateral interactions in the outer retina. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 407-441 (2012).
  29. Trifunovic, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 518, 3604-3617 (2010).
  30. Sahaboglu, A., et al. Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms. Cell Death & Disease. 4, e488(2013).
  31. Sahaboglu, A., et al. PARP1 gene knock-out increases resistance to retinal degeneration without affecting retinal function. PloS One. 5, e15495(2010).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

KegelfotoreceptorenCalcium imagingTweefotonmicroscopieRetina coupesTN XL BiosensorLichtstimulatieSynaptische terminalsCalciumsignalenDegeneratie van fotoreceptoren

Gerelateerde artikelen