Visualisatie van Streptococcus pneumoniae Binnen Cardiac microverwondingen en Latere Cardiac Remodeling

Samenvatting

Streptococcus pneumoniae vormt discrete niet-purulente microscopische laesies in het hart. Beschreven wordt het protocol voor een muismodel van hartmicrolaesievorming. Er wordt instructie gegeven over microlaesievisualisatie met behulp van microscopie, onderscheid tussen vroege en late microlaesies en methoden om cardiale remodellering in harten van herstellende dieren te detecteren.

Samenvatting

Tijdens bacteremia Streptococcus pneumoniae kan verplaatsen door het vasculair endotheel in het myocardium en vormen discrete bacteriën gevulde microscopische lesies (microverwondingen) die opmerkelijk zijn vanwege de afwezigheid van infiltrerende immuuncellen. Door hun vrijgave van cardiotoxische producten, S. pneumoniae binnen microverwondingen worden verondersteld bij te dragen tot het hartfalen die vaak waargenomen tijdens fulminaat invasieve pneumococcen ziekte bij volwassenen. Hierin wordt aangetoond een protocol voor experimentele muis-infectie die leidt tot cardiale microlesion vorming reproduceerbaar binnen 30 uur. Instructie wordt voorzien op microlesion identificatie in hematoxyline & eosine gekleurde hart secties en de morfologische verschillen tussen vroege en late microverwondingen worden gemarkeerd. Instructie wordt verstrekt over een protocol voor de controle van S. pneumoniae binnen microverwondingen behulp van antilichamen tegen pneumokokken capsulaire polysaccharideimmunofluorescentie microscopie. Eindelijk is een protocol voor antibiotische interventie die geïnfecteerde muizen en voor de detectie en beoordeling van littekenvorming in de harten van de herstellende muizen redt verstrekt. Samen zullen deze protocollen het onderzoek naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen pneumokokken cardiale invasie, cardiomyocyte dood, cardiale remodeling als gevolg van blootstelling aan S. vergemakkelijken pneumoniae en de immuunrespons op het pneumokokken in het hart.

Inleiding

Hospitalisatie van volwassenen voor community-acquired pneumonie (CAP) draagt ​​een gedocumenteerde risico op cardiale complicaties die bijdraagt ​​aan de sterfte ^1-4. In een recente studie van Corrales-Medina et al., Cardiale complicaties bleken geassocieerd te worden met en / of verantwoordelijk voor 27% van de longontsteking gepaard sterfgevallen ^3. Streptococcus pneumoniae (de pneumokokken), de meest voorkomende oorzaak van het GLB en sepsis ^5, is direct geassocieerd met negatieve cardiale gebeurtenissen in maar liefst 19% van de opgenomen volwassen patiënten ^6. Cardiale complicaties geassocieerd met een longontsteking zijn onder andere een nieuwe of verergerde congestief hartfalen, hartritmestoornissen, en myocardinfarct in volgorde van afnemende frequentie ^6.

In een recent PLoS Pathogens artikel van Brown et al., S. pneumoniae werd gevonden kunnen translocatie via cardiaal vasculair endotheel, binnenkomst in de myocardium en vorming van discrete niet-purulent microscopische lesies (microverwondingen) gevuld met bacteriën in de ventrikels gedurende invasieve pneumokokkeninfecties (IPD) ^7. Bewijs van cardiale microlesion vorming werd waargenomen in cardiale monsters van niet-menselijke primaten en mensen die bezweken aan pneumokokken infectie. Ook experimenteel geïnfecteerde muizen reproduceerbaar ontwikkeld cardiale microverwondingen. In muizen, werd microlesion grootte en aantal positief gecorreleerd met de duur en ernst van bacteremie niveaus van troponine in sera en afwijkende cardiale elektrofysiologie. Bacteriële translocatie naar het hart te treden via dezelfde mechanismen die translocatie van de pneumococcus over de bloed-hersenbarrière en ontwikkeling van pneumococcen meningitis, dwz Choline-bindende eiwit A gemedieerde invasie van vasculaire endotheelcellen in een laminine receptor en bloedplaatjes -activating factor receptor afhankelijke manier ^8. Microlesionenvorming vereist ook de pneumokokken porievormende toxine pneumolysine dat bleek te hartspiercellen ⁷ doden.

Pneumokokken cardiale microverwondingen verschillen van de purulente zachte weefsel en cardiale abcessen die worden veroorzaakt door andere Gram-positieve bacteriën zoals Staphylococcus aureus. Deze worden gekenmerkt door een enkele foci bacteriën omgeven door neutrofielen en fibrine depositie ^9,10. Microverwondingen gevormd door S. pneumoniae zijn kleiner in omvang, verspreid over een getroffen hart, en missen immuun celinfiltraten. Tijdens de vroege stadia van de infectie microverwondingen veroorzaakt door S. pneumoniae verschijnen als gebieden van beschadigde of ontstoken weefsel doet denken aan de pathologische tekenen van cardiomyopathie. Sommige monocyten kunnen worden waargenomen tijdens deze periode, maar hun aanwezigheid is kortstondig en snel lesies necrotisch in verschijning en gevuld met bacteriën tegelijkertijd blijft grow in grootte tot de dood van het dier of antimicrobiële interventie. Belangrijk binnen 3 dagen na antibioticum interventie wordt overvloedig immune cel infiltratie waargenomen bij de vroegere laesie en dit gaat gepaard met sterke collageen afzetting. Soortgelijke remodellering is gemeld optreden na infarct met blijvende gevolgen op de hartfunctie ^11-15. Zo microverwondingen zijn een potentiële verklaring voor de ongunstige cardiale gebeurtenissen die zich voordoen tijdens de IPD en eventueel de verhoogde incidentie van cardiale-gerelateerde sterfte in herstellingsoord personen die de ziekte episode hebben overleefd.

Hierin wordt instructie die op de experimenteel muismodel van IPD en cardiale laesievorming en visualisatie van cardiale microverwondingen op vroege en late stadia van de infectie. Het protocol voor detectie van collageen in dieren die zijn opgeslagen door antimicrobiële maatregelen blijkt. Het doel van dit artikel is om facilitate het onderzoek van andere onderzoekers over dit belangrijke en nieuwe pneumokokken pathologie.

Protocol

OPMERKING: Alle muis experimenten werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Commissies goedgekeurd aan de Universiteit van Texas Health Science Center in San Antonio (protocol # 13032-34-01C). Dierenverzorging en experimentele protocollen gehandeld op grond van Public Law 89-544 (Animal Welfare Act) en de bijbehorende amendementen, GGD richtlijnen, en de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren (US Department of Health & Human Services).

1. Infectie

1. Verkrijgen BALB / c muizen van beide geslachten tussen de leeftijd van 10-12 weken.
   OPMERKING: S. pneumoniae stam TIGR4 serotype 4 is een virulent klinisch isolaat dat gesequenced ^16.
2. Groei TIGR4 in Todd-Hewitt bouillon bij 37 ° C in 5% _CO2 tot aan een optische dichtheid (OD) ₆₂₀ 0,5 (overeenkomend met 1,0 x 10 ⁸ kolonievormende eenheden [CFU] / ml). Pellet de pneumococcen kweek door centrifugatie gedurende 10 min bij 3, 500 xg en verwijder het supernatant met behulp van een vacuüm lijn. Suspendeer en verdun bacteriën met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 1,0 x 10 ⁴ CFU / ml.
3. Met behulp van een inductie kamer, verdoven muizen met 2,5% verdampt isofluraan in zuurstof. Bevestig verdoofde toestand door zachte teen knijpen met stompe pincet.
   1. Houd de verdoofde muis door het nekvel en rechtop met enerzijds injecteren elke muis intraperitoneaal (ip) met 100 ul van het S. pneumoniae suspensie op met een spuit met een 27-30 gauge naald (overeenkomend met een provocatiedosis van 1,0 x 10 ³ CFU). Plaats de muis terug in zijn kooi. Muizen meestal ontwaken 30-40 sec na de injectie.
4. Laat de infectie verlopen gedurende ten minste 24 (vroeg) of 30 (advanced) hr.
   1. Euthanaseren de muizen door CO ₂ stikken. Voeren cervicale dislocatie aan de muis te garanderen is overleden. Euthanasie wordt verder bevestigd door het verwijderenvan het hart in stap 1.6.
5. Ontsmet de staart met een alcoholdoekje en knip een paragraaf 2-3 mm. Verzamel 2 pl bloed en serieel verdund bloed 10-voudig in PBS bevattende natriumheparine 1 U / ml vijfmaal. Plaat seriële verdunningen op tryptische soja-agar plaat en incubeer overnacht bij 37 ° C in 5% CO _2. De volgende dag extrapoleren kolonie telt het niveau van bacteremia.
6. Immobiliseren van de muis in een liggende positie op een chirurgische platform. Spray de borst met 70% ethanol en dep ze droog. Met behulp van chirurgische schaar en pincet open de borstholte, verwijder de ribbenkast, en doorsnijden het membraan naar het hart en de longen bloot. Met behulp van een schaar knippen de bloedvaten verbonden met het hart en zachtjes accijnzen het hart met zorg om te voorkomen blauwe plekken met een pincet.
7. Spoel het hart met PBS en vervolgens te plaatsen in weefselmonster collectie cassettes zodanig dat coronale secties zouden worden verkregen tijdens het weefsel snijden. Voor inbedden in paraffine, place cassettes in 10% gebufferde formaline-oplossing en de volgende dag te sturen voor paraffine inbedding.
   1. Als alternatief flash freeze behulp oktober Compound binnen een cryomold die op droog ijs geplaatst.

2. Visualisatie van hartlesies en Pneumokokken binnen Letsels

1. Verminder paraffine ingebedde secties hart zodat de 4 hartkamers zichtbaar in elke sectie weefsel. Snij slides bij een dikte van 5 urn.
2. Deparaffinize en vlek dia's met hematoxyline en eosine (H & E) met behulp van standaard methoden ^17.
3. Bekijk H & E gekleurde cardiale secties met behulp van een lichtmicroscoop bij lage (100X, 200X) en hoge (olie-immersie: 400X, 1000x) vergrotingen. Karakteriseren harten voor de aanwezigheid van microverwondingen in het myocardium. Hier verwerven H & E beelden met behulp van een Zeiss Axioskop 2 microscoop uitgerust met een 100X 1,3 numerieke opening Plan-Neofluar doelstelling.
   OPMERKING: in een vroeg stadium cardiale lesions gediscrimineerd door hun differentiële gekleurde uiterlijk en in sommige gevallen de aanwezigheid van immuuncellen (monocyten en granulocyten) schijnbaar monocyten zijn. In geavanceerde laesies, met name gezien bij 30 uur, immuuncellen afwezig zijn en grote vacuole-achtige laesies worden waargenomen in hun plaats. Het is belangrijk op te merken dat terwijl immuuncel instroom gedurende de vroege stadia van cardiale laesie ontwikkeling optreden blijkt niet een eis.

3. Immunofluorescente Microscopie voor Pneumokokken binnen microverwondingen

1. Sectie hart in cryomolds met microtoom tot een dikte van 5 pm en plaats delen op positief geladen glasplaatjes. Laat bevroren cardiale secties te ontdooien en aan de lucht drogen. Fix secties gedurende 10 minuten in 10% neutraal gebufferd formaline (pH 6,8-7,2 bij 25 ° C).
2. Was slides (3x) in PBS gedurende 5 min, doorlaatbaar voor 15 min in 0,2% Triton X-100 in PBS, opnieuw wassen in PBS.
3. Blok weefsel secti on op objectglaasjes met 10% geit serum in PBS gedurende 1 uur.
4. Spoel dia met PBS, deksel en incubeer cardiale secties met konijn anti-serotype 4 pneumococcus antiserum bij 1: 1000 in PBS met 10% geit serum gedurende 2 uur bij 37 ° C.
   LET OP: Voor de negatieve controles onderzoekers moeten naïef konijnenantiserum gebruiken
5. Na wassen met PBS, deksel en incubeer secties met 10% geit serum-PBS met geit anti-konijn-FITC geconjugeerd antilichaam bij 1: 2000 gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
6. Na instructies van de fabrikant gebruikt DAPI (4 ', 6- diamidino-2-fenylindool) en 5 mg / ml voor visualisatie van eukaryote kernen. Wassen en monteer weefsel secties met FluorSave.
7. Verwerven fluorescerende beelden met behulp van een confocale microscoop systeem bij zowel lage als hoge vergroting. Stel de numerieke apertuur dienovereenkomstig voor optimale resultaten. Hier verkrijgen fluorescerende beelden met behulp van een confocale systeem met een numerieke apertuur 1,42 60X objectief.

"> 4. Antibiotica Redding van Septic Muizen

1. Beginnen met muizen geïnfecteerd ip met 1,0 x 10 ³ CFU van TIGR4 zoals eerder in stap 1 is aangegeven.
2. Beginnend op 30 uur na infectie, toedienen van farmaceutische kwaliteit ip ampicilline (80 mg / kg lichaamsgewicht) in 100 pl zoutoplossing elke 12 uur gedurende 36 uur. Verzamel hart op het gewenste tijdstip en zoals beschreven in stap 1.6 voor paraffine inbedding en weefsel snijden.

5. Collageen Deposition Detection

1. Met xyleen en ingedeeld alcohol wast met gedeïoniseerd water, deparaffinize en hydraat weefselsecties middels standaardwerkwijzen ^17. Behandel secties met waterige 0,2% fosfomolybdeenzuur gedurende 5 minuten en spoel met gedeïoniseerd water gedurende 5 min.
2. Stain secties met 0,1% Sirius Red in pikrinezuur 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
3. Was secties 0,01 N zoutzuur gedurende 3 min en spoelen met 70% ethanol gedurende 1 minuut.
4. DehydraTé de secties met behulp van de identieke, maar in omgekeerde volgorde van wasbeurten met die beschreven in 5.1, uitdrogen cardiale secties in het verhogen en gegradeerde concentraties van ethanol dan xyleen.
5. Mount weefsel secties met een montage oplossing voor microscopische evaluatie.
6. De regio's van collageen te identificeren, te onderzoeken in lood weefsel secties voor gebieden van diepe read vlekken onder lage en hoge vergroting met een lichtmicroscoop. Elk gebied binnen de ventrikels van het hart, dat is rood is een gebied waar collageen is gedeponeerd. Gebieden zonder deze rode vlek zijn sites van gezond weefsel ontbreekt collageen depositie. Hierin verkrijgen Picro Sirius rood gekleurde beelden met behulp van een microscoop uitgerust met een 20X 0,5 numerieke apertuur doelstelling.
   OPMERKING: Het atrium vlekken rood in gezonde weefsels.

Resultaten

Visualisatie van microverwondingen door H & E

Cardiale microverwondingen werden waargenomen in de ventrikels van H & E gekleurde hart- coupes van muizen met IPD na hun ip uitdaging TIGR4. Figuur 1 toont de toename in grootte van deze laesies tussen 24 en 30 uur na infectie (HPI), met groter aantal hematoxyline -stained (dwz, paars-blauw) pneumokokken zichtbaar binnen de laesie. Microverwondingen werden gekenmerkt door een vacuole-achtige morfologie,...

Discussie

In dit verslag zeer reproduceerbare methode S. induceren pneumoniae gemedieerde cardiale microverwondingen bij muizen tijdens IPD en de technieken voor de visualisatie wordt aangetoond. Muizen geïnfecteerd met een dosis bacteriën die drempelwaarde van het immuunsysteem voor klaring overtreft, waardoor hoogwaardige bacteremie, vergelijkbaar met die welke optreedt tijdens menselijke sepsis, en leidt tot uiteindelijke bacteriële translocatie in het myocardium. Voor nog onbekende redenen, S. pneumoniae...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Todd-Hewitt bouillon	Neogen	7161A
O.C.T Compound	Tissue-Tek (Sakura Finetek)	4583
Triton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
Normaal geitenserum	Abcam	ab7481
anti-serotype 4 pneumokokken antiserum	Statens Serum Institut	16747
geit anti-konijn FITC-geconjugeerd antilichaam	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicillin	Sigma	A9393
fosfomolybdinezuur 0,2%	Electron Microscopy Sciences	26357-01
0,1% Sirius Red in picrinezuur	Electron Microscopy Sciences	26357-02
0,01 N zoutzuur	Electron Microscopy Sciences	26357-03
Tissue Tack Microscoopglazen	Polysciences, Inc	24216
Paralube Vet Ointment	Dechra	12920060
Hematoxyline en Eosine Kleuring Kit	ongespecificeerd		Standaard