Verbeterde Genetische analyse van Single Human Bioparticles Hersteld door vereenvoudigd Micromanipulatie uit Forensisch 'Touch-DNA' Evidence

Samenvatting

Hier beschrijven we een optimale en efficiënte verwijdering strategie voor het verzamelen van onderhavige bio-deeltjes "raken DNA" monsters, tezamen met een verbeterde amplificatieprotocol waarbij in één stap 5 gl micro-volume lysis / STR amplificatie, het herstel van mogelijk short tandem repeat (STR) profielen van de bio-deeltje donor (en).

Samenvatting

DNA-profielen kunnen worden verkregen uit 'tintje DNA' bewijs, die microscopisch kleine sporen van menselijk biologisch materiaal omvat. De huidige methoden voor het herstel van DNA-sporen in dienst wattenstaafjes of plakband op een gebied van belang te proeven. Echter, dergelijke "blinde zwabberen benadering samen monster celmateriaal van de verschillende individuen, zelfs wanneer cellen de individuen zich in verschillende geografische locaties op het artikel. Dus sommige van de DNA mengsels aangetroffen horen DNA monsters kunstmatig gecreëerd door het zwabberen zelf. In sommige gevallen kan het DNA een slachtoffer vinden in aanzienlijke overmaat aldus DNA mogelijke dader maskeren.

Om de uitdagingen met standaard recovery en analysemethoden te omzeilen, hebben we een lagere kostprijs, 'slimme analyse methode die resulteert in verbeterde genetische analyse van aanraking DNA-bewijs ontwikkeld. We beschrijven een geoptimaliseerde eend efficiënte micromanipulatie herstel strategie voor het verzamelen van onderhavige horen DNA monsters bio-deeltjes, alsmede een versterkte amplificatie strategie waarin in één stap 5 ul microvolume lysis / STR amplificatie de terugwinning van STR profielen van de bio-deeltje donor toestaan (s). Het gebruik van individuele of enkele (dwz "klonten") bioparticles resultaten in het vermogen enkelvoudige bron profielen te verkrijgen. Deze procedures geven alternatieve verbeterde technieken voor de isolatie en analyse van afzonderlijke bioparticles van forensisch aanraking DNA bewijs. Hoewel niet noodzakelijk in elk forensisch onderzoek, kan de methode zeer gunstig voor het herstel van een enkele bron dader DNA-profiel in geval van fysieke agressie (bv verstikking) dat niet mogelijk is met behulp van standaard analysetechnieken. Bovendien, de strategieën ontwikkeld hier een kans om genetische informatie in het interne celniveau verkrijgen van verschillende other niet-forensisch spoor biologisch materiaal.

Inleiding

Touch DNA is een vorm van sporen biologische bewijs dat is de rechtstreekse overdracht van celmateriaal (bijv, schuur huidcellen) van een individu naar een object of een ander individu tijdens fysiek contact ^1. De mogelijkheid om DNA-profielen te verkrijgen van verschillende aangeraakt voorwerpen (documenten, beddengoed, schoenen, vuurwapens, drinken containers, pennen, aktetas handgrepen) gemeld in de literatuur ^2-9.

Een kritische factor in de analyse van de aanraking DNA-bewijs is een succesvol herstel van het spoor biologisch materiaal aanwezig. Raak DNA-bewijs wordt meestal verzameld door zwabberen het verdachte gebied met een steriel wattenstaafje (aangeduid als "blinde-zwabberen"). Met deze benadering wordt de aard van de verzamelde biologische materiaal onbekend en bemonstering van een gegeneraliseerde gebied wordt uitgevoerd. De aanwezigheid van het oppervlak groeven of spleten kan het succesvol herstel van de vaak toch al kleine hoeveelheid bi belemmerensche materiaal aanwezig. Daarnaast zal er een 'blinde-zwabberen' aanpak noodzakelijk co-sample van celmateriaal van de verschillende individuen waarvan de cellen aanwezig zijn op het punt zijn, zelfs als de cellen van de individuen 'bevinden zich in ruimtelijk verschillende locaties op het item. Het herstel van gemengd DNA-profielen, die vaak uitdagend bijzonder lossen met lage template DNA-monsters, wordt vaak waargenomen ^8,10,11 en in veel gevallen een indirecte artefact van het zwabberen proces zelf. Wanneer slechts een kleine hoeveelheid materiaal aanwezig uit een van de donors, kunnen standaard extractie en analysetechnieken niet een profiel herstellen van de kleine medewerker. Bovendien, het soort wattenstaafje of dat droog of nat gebruikt (vooraf bevochtigd met steriel water) kan de hoeveelheid biologisch materiaal dat wordt verzameld invloed door verschillen in absorptie en adsorptiviteit en de efficiëntie van afgifte van het biologisch materiaal ^12. Standaard extractiemethoden kan bijkomende monster verlies als gevolg vereiste fysische manipulatie van het monster of monsteroverdrachtsapparaat stappen.

Zoals hierboven beschreven kan eenvoudig zwabberen technieken voor het terugwinnen van biologisch materiaal resulteren in het verlies van sporenhoeveelheden biologisch monster en een verhoogde frequentie van gemengd profielen wegens het ontbreken van afzonderlijke biologische componenten te scheiden. Daarom zochten we naar een meer selectieve en efficiënte invordering van strategieën voor het verzamelen van cellulaire microdeeltjes aanwezig op aangeraakt objecten te ontwikkelen. De strategie ontwikkeld voor de analyse van biologisch materiaal van aanraking DNA- bewijsmateriaal (hier aangeduid als "bioparticles" vanwege het feit dat een kern niet altijd zichtbaar omdat een meerderheid van de cellen in de buitenste epidermale huidlaag dood of stervend keratinocyten ¹³⁾ omvat de volgende: 1) collectie van biologisch materiaal (dat wil zeggen, bioparticles) via gel-film frOM aangeraakt voorwerpen en oppervlakken gedragen kleding of rechtstreekse menselijke huid, 2) microscopisch onderzoek van de teruggewonnen biologisch materiaal verzameling potentiële menselijk lichaamsmateriaal te waarborgen, en 3) micromanipulatie van of enkele bio-deeltjes met een in water oplosbaar kleefmiddel, en 4) autosomale DNA-STR profilering van de verzamelde biologische deeltjes met een microvolume (5 ui) een stap lysis / amplificatiereactie.

Deze procedure biedt talrijke voordelen boven traditionele toegepaste analysemethoden. Herstel van bioparticles met de gel-film maakt een microscopisch onderzoek van het biologische materiaal in het monster vóór de analyse. Een meerderheid van de bioparticles gewonnen uit aanraken DNA bewijs mogen niet kernhoudende cellen waardoor het moeilijker te bepalen welke en hoeveel bio-deeltjes worden gekozen, het microscopisch onderzoek van deze monsters voor analyse geeft aan mogelijkheid om te zoeken naar cellen met kernen dus maximizing de kans op DNA-profiel herstel. De collectie van bioparticles behulp van water oplosbare lijm bijgestaan ​​micromanipulatie maakt de rechtstreekse overdracht van gerichte bioparticles in reageerbuisjes. Deze procedure is zichtbaar onder de microscoop om succesvolle overdracht van het biologische materiaal te waarborgen. Deze vermindering of microvolume reactie verhoogt de gevoeligheid terwijl het verminderen van de kosten van de analyses per monster. Dit maakt de analyse van verhoogde aantallen monsters van een individueel stukje bewijs. Vanwege het bereik in de genetische toestand van bio-deeltjes in aanraking DNA-bewijs, zijn meerdere proeverijen van individuele items aan te bevelen.

Hier tonen we het succesvolle gebruik van de ontwikkelde protocollen zeer bewijskracht genetische profielen van de donors van biologisch materiaal in contact DNA te verkrijgen. De ontwikkelde bioparticle collectie en DNA profiling methoden bieden een uitgebreide 'slimme' (dat wil zeggen, specifiek, meetbaar, attainable, realistisch en tijdgebonden) moleculaire benadering van de karakterisering, de analyse en interpretatie van sporen biologisch materiaal. Hoewel oorspronkelijk ontwikkeld voor toepassing op forensische analyse van aanraking DNA- bewijsmateriaal, kan de hier ontwikkelde strategieën worden toegepast op andere bronnen van biologisch materiaal en bieden een mogelijkheid individuele identificeerbare informatie op enkel cel niveau te verkrijgen.

Protocol

OPMERKING: Lichaamsvloeistoffen werden verzameld uit vrijwilligers met behulp van procedures die door de University of Central Florida's Institutional Review Board goedgekeurd. Geïnformeerde schriftelijke toestemming is verkregen van elke donor.

1. Het verzamelen van Bioparticles uit Touched objecten en oppervlakken

1. Snijd de gel-folie op de gewenste grootte. Ervoor zorgen dat het de juiste maat voor de microscoopglaasje wordt gebruikt als de vaste drager. Bijvoorbeeld, voor een 3 "x 1" glasplaatje, gebruik een gel-filmformaat van 2 "x 0,75".
   NB: De lengte en breedte van het materiaal kan worden verminderd, indien gewenst, maar mag niet meer bedragen dan deze grootte.
2. Verwijder de witte achterkant van de gel-film en bevestig de gel-film naar de microscoop dia (Figuur 1A). Druk deze stevig aan om een ​​volledige bevestiging te garanderen.
   OPMERKING: Er is een duidelijke top beschermende laag die niet mogen worden verwijderd om de druk langs het stukje gel-fil toe te passenm zonder besmetting van de gel-filmoppervlak. Bereide gel-film slides (met beschermlaag aangebracht) kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard totdat het nodig is.
3. Verwijder de doorzichtige top beschermfolie van de gel-film met steriele pincet wanneer je klaar bent om (Figuur 1B) de gel-film monster gebruiken. Plaats de gel-filmoppervlak in direct contact met de gewenste aangeraakt object of oppervlak (figuur 2). Breng een kleine hoeveelheid druk om efficiënte overdracht van bio-deeltjes de gel-filmlaag.
   OPMERKING: Als er te veel druk wordt uitgeoefend, kan het glaasje te breken.
   OPMERKING: Meerdere proeverijen van hetzelfde object of oppervlak kunnen worden verzameld op het zelfde stuk van gel-film.
4. Bevestig om bio-deeltjes op de gel-film (figuur 3) door het plaatsen van de schuif op een stereomicroscoop (trans- of epi-belichting kan worden gebruikt). Gebruik vergroting van ~ 20X voor de beste kijkervaring grotere gebieden van de gel-film, en vergroting van ~ 200X voor de beste viewing individuele bio-deeltjes.
5. Bewaar de gel-film voorbeelddia bij kamertemperatuur in een overdekte dia doos of onmiddellijk gebruikt voor het kleuren en / of bio-deeltje collectie.

2. Optioneel kleuring van Bioparticles om te helpen bij Visualisatie

1. Plaats de gel-film monster dia bereid in stap 1 op een dia-kleuring rek boven de gootsteen.
2. Met behulp van een wegwerp transfertpipet, bestrijken het gehele gel-film oppervlak met trypaanblauw vlek (Figuur 4A). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1-2 minuten.
3. Verwijder overtollige vlek door het kantelen van de dia om de vlek af te afwateren in de gootsteen (Figuur 4B).
   OPMERKING: De dia kan worden gespoeld door zachte overstromingen met steriel water met behulp van een wegwerp transfertpipet indien nodig (Figuur 4C).
4. Laat de schuif aan de lucht drogen alvorens over te gaan tot isolatie van bio-deeltjes. Bekijk de dia met behulp van een stereomicroscoop (~ 20X voor algemene kijkervaring en ~ 200-300X te view individuele bioparticles) om een goede kleuring (Figuur 4D-E) te waarborgen.
   OPMERKING: De slede kan bij kamertemperatuur worden bewaard in een overdekte glijbaan vak.

3. Isolatie van Bioparticles van belangstelling voor analyse

1. Plaats het juiste aantal van 0,2 ml PCR buizen in een rek en label de buizen behoren.
2. Bereid de STR ​​versterking mix (zie Materials List) in een aangewezen PCR-amplificatie kap of bioveiligheid kast. Vortex de master mix goed en kort centrifugeren in een mini-centrifuge.
   1. Het volume van de versterking mix nodig per monster is 3,5 pl; een geschikt volume van de master mix voor te bereiden op het gewenste aantal monsters.
3. Pipet 3,5 ul van versterking mengsel in elk 0,2 ml buis. Cap elke buis losjes.
4. Leg een stuk dubbele plakband op een schoon glas microscoop dia of direct op een glazen blok.
   LET OP: Deze zal worden gebruikt om de te houden0,2 ml tube op zijn plaats tijdens de monstername.
5. Leg een stuk dubbele plakband op een schoon glas microscoop dia. Plaats een stuk van in water oplosbare golfsoldeersel tape bovenop dubbele plakband.
   OPMERKING: Deze dia kan worden opgeslagen in een exsiccator voor toekomstig gebruik.
6. Plaats de eerste 0,2 ml buis op de dubbele plakband dia of blok bereid in stap 3.4. Stel deze buis weg totdat het monster wordt verzameld.
7. Plaats het in water oplosbare golfsoldeersel tape dia onder de microscoop (lage vergroting). De punt van een wolfraam naald voorzichtig schrapen het oppervlak van de band om een kleine hoeveelheid (of "ball") kleefstof aan het einde van de naald (figuur 5A) verzamelen.
   OPMERKING: De grootte van de bal kan klein of groot worden afhankelijk van het aantal bioparticles die worden verzameld.
8. Verwijder voorzichtig de wolfraam naald met lijm uit onder de microscoop zonder de punt van de naald. De naald kanzijn plaats in een rek indien gewenst tijdens monster plaatsing.
9. Plaats de bereide gel-foliemonster (van stap 1 en 2) op de microscoop podium. Pas de focus en vergroting tot de bioparticles gemakkelijk kan worden bekeken. Identificeer de bio-deeltjes die worden verzameld.
   OPMERKING: Een glazen blok kan worden gebruikt om de slede te ondersteunen indien nodig.
10. Haal de wolfraam naald met lijm bal, en plaats de naald over de gel-film oppervlak waar de bio-deeltjes van belang zijn gevestigd. Druk de punt van de naald (met lijm) naar beneden zodat het in contact met de bio-deeltjes (figuur 5B). Trek de naald om te waarborgen dat de bio-deeltje is verzameld. Herhaal dit proces totdat het gewenste aantal bio-deeltjes zijn verzameld.
11. Plaats de bereide 0,2 ml PCR buis op de microscoop podium. Pas de vergroting zodat de bodem van de buis met de amplificatie mengsel is scherpgesteld.
12. Steek de wolfraam needle in de 0,2 ml PCR buis totdat de punt van de naald in het amplificatie mengsel.
    LET OP: Dit is het beste uitgevoerd tijdens het bekijken van door de microscoop.
13. Houd de naald in het amplificatie mengsel totdat de lijm oplost en de bioparticles vrij in oplossing (figuur 5C). Verwijder de naald, plaats de 0,2 ml rechtop en losjes de dop op de buis.
14. Herhaal de collectie procedure voor de overige monsters. Reinig de wolfraam naald met pre-bevochtigd alcohol (isopropanol) doekjes in tussen de monsters.

4. Gecombineerde Microvolume Nucleïnezuurisolatie (Direct Lysis) en autosomaal short tandem repeat (STR) Profiling

1. Bereid de lysis buffer (zie Materials) in een aangewezen PCR-amplificatie kap of bioveiligheid kast. Voeg 1,5 ul van de lysis buffer aan elke buis een 5 ul totaal reactievolume. Nauwe buis deksels stevig vast.
   OPMERKING: De 0,2 ml buisjes 3,5 ul van het bevatten reedsversterking mix en de collectie bio-deeltjes uit Stap 3.
2. Leg monsters in de thermische cycler en versterken de monsters met de volgende cyclusomstandigheden: 75 ° C gedurende 15 min; 95 ° C gedurende 11 min; 34 cycli van 94 ° C gedurende 20 seconden en 59 ° C gedurende 3 min; 60 ° C gedurende 10 min; en 4 ° C te houden.
   1. WINKEL amplificatieproducten bij 4 ° C gedurende korte termijn opslag.

5. Goederen Detectie - capillaire elektroforese (CE)

1. In een plaat met 96 putjes, voeg 10 pl CE lopende mix (9,7 gl gedeïoniseerd formamide en 0,3 pl standaardmaat, zie materialen). Voeg 1 ul van geamplificeerd product of allele ladder aan elk putje.
   LET OP: Formamide is een potentiële mutagene stof en moet in een chemische kap worden behandeld tijdens het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
2. Gebruik elektroforetische voorwaarden die door de fabrikant bij de amplificatie kit handleiding of internally gevalideerd voorwaarden.
3. Analyseer ruwe data met STR analyse software.

Resultaten

Representatieve beelden van individuele en samengeklonterd bioparticles die werden teruggewonnen van een kraag (100% polyester) gedragen door een mannelijke donor zijn weergegeven in figuur 6 (individuele bioparticles) en figuur 7 (samengeklonterde bioparticles). De bioparticles werden hersteld van de kraag met behulp van de hier beschreven protocol: overdracht van bioparticles uit de kraag te gel-film via direct contact, kleuring van de teruggewonnen bioparticles met trypaanblauw, de verzameling van bioparticle monsters met behulp van een wolfraam naald en water oplosbare lijm en STR analyse met behulp van 5 pl micro-volume lysis / STR amplificatie. Figuren 6 en 7 vormen een typisch bemonstering van bioparticles die worden geanalyseerd vanuit individuele accenten DNA punt (20 enkelvoudige / individuele bioparticles en 20 geklonterd bioparticles). De bioparticle (s) van elk beeld verzamelde gelabeld met lengte en breedte afmetingen (in microns). De percentage STR-allelen gewonnen uit elk van de verzamelde bioparticle (s) wordt aangebracht op iedere afzonderlijke de variabele maten van succes te verwachten worden verkregen bioparticles dit soort bewijs tonen. De bioparticles gewonnen uit aanraken DNA monsters grotendeels dode of stervende keratinocyten en daarom bewijskracht STR profiel niet die van elk verzameld bioparticle, zoals te zien in figuren 6 en 7. Hiervoor kraag monster werden STR profielen verkregen uit 14/20 (70%) van de afzonderlijke bioparticles en 15/20 (75%) samengeklonterd bioparticles. Echter, elk van de teruggewonnen profielen varieert in bewijskracht: 3-97% allel herstel individuele bioparticles profielen en 3-100% allel herstel voor de samengeklonterde bioparticle profielen. Vanwege de variabiliteit in slagingspercentages, wordt de inzameling van talrijke bioparticles van elke aanraking DNA voorwerp aanbevolen. Dit zorgt voor een betere kans op het verkrijgen van een zeer probative STR profiel.

De STR ​​profiel verkregen uit één van de afzonderlijke bioparticle monsters van de kraag wordt getoond in figuur 8 (de bioparticle waarvan het profiel afkomstig wordt links weergegeven). Bijna een volledige STR-profiel (28 van de 30 allelen, één locus drop-out, de nauwkeurigheid van de verkregen profiel gecontroleerd door vergelijking met een referentie-profiel) is verkregen van deze persoon bioparticle. De verkregen profiel is van hoge kwaliteit met een redelijk evenwichtig inter-locus piekhoogte en geen allele drop-out. Allele drop-out en onevenwichtig piekhoogte artefacten zijn beide vaak gerapporteerd met lage template DNA-monsters. De STR ​​profiel verkregen uit één van de samengeklonterd bioparticle monsters van de kraag wordt getoond in figuur 9. Een volledig STR profiel (30/30 allelen, nauwkeurigheid van de verkregen profiel geverifieerd door vergelijking met een referentieprofiel) werd verkregen. Zoals eerder vermeld, is een STR profiel niet hersteld ooity bioparticle verzameld. Een voorbeeld van mislukte DNA profilering van één bioparticle (3% allel terugwinning, 30/01 allelen) wordt getoond in figuur 10 (individuele bioparticle). Terwijl deze persoon bioparticle niet succesvol was, zeer bewijskracht STR-profielen van de donor van het bioparticles in deze steekproef werden verkregen van andere bioparticles hersteld van hetzelfde monster. Dit illustreert de noodzaak om meerdere cel / clump bemonsteringen uitvoeren van hetzelfde object.

De ontwikkelde "slimme" analysemethoden hier beschreven voor touch DNA-bewijs zijn met succes gebruikt om bewijskracht enkele bron profielen van enkele herstellen en "samengeklonterd" bioparticles uit verschillende aangeraakt voorwerpen en kleding (bijvoorbeeld stoel armleuningen, auto stuurwielen, mobiele telefoons, kopjes koffie, sigaretten, pennen, shirts, shorts en truien). Maar belangrijker nog, deze aanpak is ook gebruikt voor de detectie en profilering van mannelijke donor DNA (single source) in gesimuleerde fysiek contact / mishandeling mengsel monsters (bijv dader grijpen van een slachtoffer pols, nek of kleding, of contact met beddengoed slachtoffer als bij seksueel geweld).

Figuur 1: Voorbereiding van de gel-film dia's voor bioparticle collectie. (A) De witte achterzijde beschermkap wordt verwijderd met een steriele pincet uit het stuk gel film zelfklevende achterzijde bloot. De gel-film wordt dan gehecht aan een microscoopglaasje met stevige druk. (B) Als de gel-film monster is klaar voor gebruik voor bioparticle verzamelen, de bovenste heldere beschermfolie verwijderd met een steriele pincet.

Figuur 2: Bioparticle collectie met behulp van gel-film van verschillende substraten. De gel-film slides kunnen worden gebruikt om bioparticles verzamelen van verschillende oppervlakken. De gel-film wordt in direct contact met het object of oppervlak plaats. Zachte druk wordt toegepast om bioparticles te brengen op de gel-film oppervlak. Het verzamelen van bioparticles uit (A) gedragen kleding (jas kraag), (B) aangeraakt objecten (reis koffiekopje), en (C) directe menselijke huid (mannelijke pols) getoond.

Figuur 3:. Bioparticles op een versleten kledingstuk (binnenkant broekspijp) Bioparticles worden overgebracht naar gel-film door direct contact met het oppervlak object. Bioparticles kan worden gevonden als "klonten" of individueel / single bioparticles (aangegeven met rode pijlen).

alt = "Figuur 4" src = "/ files / ftp_upload / 52612 / 52612fig4.jpg" />
Figuur 4:. Optioneel kleuring van bioparticles op gel-film dia's voor een betere visualisatie van bioparticles, kunnen gel-film monsters worden gekleurd met trypaanblauw vlek. Het gehele oppervlak van de gel-film wordt gedekt door trypaanblauw (A). Na 1-2 min van vlekken, de dia wordt zachtjes gekanteld zodat alle overtollige vlek af te lopen de schuif (B). Zachte overstromingen met steriel water (C) kan worden gebruikt om overmaat kleurstof te verwijderen. Na de dia wordt de lucht gedroogd, kan de dia onder de microscoop bekeken worden om een goede kleuring (D, E) te waarborgen. Opmerking:. Niet alle bioparticles zal verschijnen gekleurd (dwz, blauwe kleur) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

OAD / 52612 / 52612fig5.jpg "/>
Figuur 5: Bioparticle verzamelen en analyseren. (A) Een kleine hoeveelheid (of "ball") van in water oplosbare golfsoldeersel tape ("lijm") verzameld op de punt van een wolfraam naald door voorzichtig schrapen. (B) De lijm wordt dan geraakt de gel- filmoppervlak om de bioparticles van belang te verzamelen. Afzonderlijke of meerdere bioparticles worden verzameld als een hechtmiddel bal. (C) Wanneer de gewenste bioparticles zijn verzameld, wordt de punt van de naald in amplificatie mengsel geplaatst in een 0,2 ml PCR buis. De naald wordt gehouden in de vloeistof totdat het oplost en het vrijkomen van bioparticles in oplossing waargenomen. Alle stappen in het incassotraject worden uitgevoerd en bekeken onder de microscoop om succesvol bioparticle verzameling en overdracht te waarborgen. Klik hier om een LAR bekijkenger versie van deze figuur.

Figuur 6:. Individuele bioparticles een kraag monster Bioparticles werden teruggewonnen met gel-film van de binnenkant van een kraag gedragen door een mannelijke donor. De bioparticles werden gekleurd met behulp van trypanblauw en afbeeldingen van twintig verschillende individuele bioparticles waarvan tijdens de steekproef worden getoond. In elk beeld, wordt de bioparticle dat werd verzameld omcirkeld (rode cirkels aangeeft bioparticles waarin een profiel werd teruggevonden; zwarte cirkels aangeeft bioparticles waarin een profiel werd niet teruggevonden). Het percentage allel herstel (aantal waargenomen allelen op een totaal van 30) wordt boven het beeld van bioparticle waaruit een profiel werd teruggevonden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7: samengeklonterd bioparticles in een kraag monster Bioparticles werden teruggewonnen met gel-film van de binnenkant van een kraag gedragen door een mannelijke donor.. De bioparticles werden gekleurd met behulp van trypanblauw en afbeeldingen van twintig verschillende clumped bioparticles waarvan tijdens de steekproef worden getoond. In elk beeld, wordt de bioparticle dat werd verzameld omcirkeld (rode cirkels aangeeft bioparticles waarin een profiel werd teruggevonden; zwarte cirkels aangeeft bioparticles waarin een profiel werd niet teruggevonden Het percentage allel herstel (aantal waargenomen allelen uit van een mogelijke 30). wordt getoond voor elk bioparticle waaruit een profiel werd teruggevonden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 8: Autosomaal STR-profiel verkregen van een enkele bioparticle van een mannelijke kraag Een autosomale STR ​​profiel werd verkregen uit een enkele bioparticle (afgebeeld op links) met behulp van de 5 ul directe lysis / amplificatiereactie.. De nauwkeurigheid van dit profiel werd bepaald door vergelijking met een donor referentiemonster. Vijftien autosomale STR loci en amelogenine (geslachtsbepaling) zijn gecoamplificeerd in een enkele reactie en gescheiden door capillaire elektroforese. De resultaten worden hier getoond als een elektroferogram. Allel nummers aanduiding onder elke piek bij elke locus. De x-as geeft fragment grootte (basenparen, bp) en de y-as geeft de signaal-intensiteit (RFU relatieve fluorescentie-eenheden; mits onder elke corresponderende allel nummer). Klik hier om een grotere versie van te bekijken dit cijfer.

Figuur 9: Autosomaal STR-profiel verkregen van een samengeklonterd bioparticle van een mannelijke kraag Een autosomale STR ​​profiel werd verkregen uit een samengeklonterd bioparticle (afgebeeld op links) met behulp van de 5 ul directe lysis / amplificatiereactie.. De nauwkeurigheid van dit profiel werd bepaald door vergelijking met een donor referentiemonster. Vijftien autosomale STR loci en amelogenine (geslachtsbepaling) zijn gecoamplificeerd in een enkele reactie en gescheiden door capillaire elektroforese. De resultaten worden hier getoond als een elektroferogram. Allel nummers aanduiding onder elke piek bij elke locus. De x-as vertegenwoordigt fragmentgrootte (baseparen bp) en y-as vertegenwoordigt signaalintensiteit (RFU relatieve fluorescentie-eenheden, moeten onder elk allel corresponderend nummer).pg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 10:. Voorbeeld van een gebrek aan een autosomale STR-profiel verkregen van een verzameld bioparticle verkrijgen De individuele bioparticle getoond op de linker werd verzameld uit een shirt kraag gel-film monster. Zoals blijkt uit de verkregen STR profiel (getoond rechts), slechts één allel (niet 30 mogelijk) werd verkregen. Allel nummers aanduiding onder elke piek bij elke locus. De x-as geeft fragment grootte (basenparen, bp) en de y-as geeft de signaal-intensiteit (RFU relatieve fluorescentie-eenheden; mits onder elke corresponderende allel nummer). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Hier hebben we beschreven methoden voor het verzamelen en verbeterde genetische analyse van bioparticles hersteld van aanraking DNA-bewijs. De ontwikkelde methode omvat het volgende: 1) verzamelen van biologisch materiaal (bijv bioparticles) via gel-film uit aangeraakt objecten en oppervlakken, gedragen kleding of rechtstreekse menselijke huid, 2) microscopisch onderzoek van de teruggewonnen biologisch materiaal verzameling van mogelijke waarborgen menselijk biologisch materiaal, en 3) micromanipulatie van of enkele bioparticles met een water oplosbaar kleefmiddel, en 4) autosomale DNA-STR profilering van de verzamelde bioparticles met een microvolume (5 ui) een stap lysis / amplificatiereactie. Het gebruik van een one-step gesloten buis reactie vermindert de potentiële verontreiniging, en het monster verlies uit aanvullende steekproef manipulaties of overdracht naar andere reageerbuisjes. De verbeterde one-step microvolume (5 pi) lysis / STR amplificatiereacties maakt het herstel van de volledige of probative STR profielen van de donor van of enkele bioparticles. Deze aanpak is ontwikkeld om enkele bron STR profielen van single- en multi-source aanraking DNA-bewijs (bijvoorbeeld, versleten kleding en andere huishoudelijke artikelen, aangeraakt / behandelde voorwerpen en oppervlakken, huid / huid mengsels) te verkrijgen. Het is met succes toegepast voor de detectie van de mannelijke donor in gesimuleerde lichamelijk geweld mengsel monsters.

Deze aanpak kan verder worden geëvalueerd in toegevoegde lichaamsvloeistof / weefsel mengsel scenario zoals slachtoffer krabben zijn / haar aanvaller, waarin slechts enkele bioparticles van de aanvaller onderhavige onder een overweldigende hoeveelheid biologisch materiaal van het slachtoffer is. Bovendien, aangezien deze aanpak die in de huidige studie maakt analyse bij de enkele bioparticle niveau, kan worden gebruikt om een beter begrip van de aard en omvang van de secundaire overdracht ^14-19, waarbij een intermediair brengt een DNA-profiel een surfa krijgence, object of persoon op een ander oppervlak object of persoon ^20. Een blinde-zwabberen benadering voor de analyse van secundaire overdracht kan niet sporen materiaal identificeren van de secundaire donor. De aanpak ontwikkeld hier maakt de analyse of enkele bioparticles en derhalve de resultaten niet verstoord door de aanwezigheid van een overweldigende hoeveelheid biologisch materiaal van de primaire donor. De methodieken ontwikkeld in dit werk kan ook gevolgen hebben voor de analyse van sporen biologisch materiaal in aanranding gevallen zoals die waarbij de digitale penetratie van de vagina, waar positieve identificatie van sporen van huidcellen van de dader van cruciaal belang zou kunnen zijn dat seksueel contact te leggen plaatsgevonden.

Terwijl de verzameling bioparticles van gel-foliemonster niet moeilijk en complex manipulaties omvatten, zijn er kritische stappen in deze procedure die moeten worden uitgevoerd met grote inspanningen om de successful overdracht van bioparticles tot de stroomafwaartse reactievat. De collectie van bioparticles met het wateroplosbare lijm moet microscopisch bekeken (dwz stereomicroscoop bij een sterke vergroting (~ 200-300X) zodat alleen de bioparticles van belang worden verzameld. Afhankelijk van de grootte van de lijm "ball" gebruikt, daar is het mogelijk om extra omringende materiaal dat zowel biologische en niet-biologische materiaal (bijvoorbeeld vezels, ander materiaal) kunnen verzamelen. Het verzamelen van onbedoelde extra bioparticles kan leiden tot het herstel van gemengd DNA-profielen. De verzameling van niet-biologisch materiaal Remmers in de micro-volume lysis invoeren / STR reacties. Wanneer meerdere bioparticles verzameld met hetzelfde hechtmiddel "ball", is er een risico van eerder verzamelde bioparticles om losraken van de lijm. Dit is niet vaak waargenomen, maar kan optreden bij grotere aantallen bioparticles worden verzameld (bijvoorbeeld meer dan 50) met een enkele lijm "bal". Als een groot aantal bioparticles zijn gericht, is het aanbevolen dat meerdere collecties van minder bioparticles zijn gemaakt, maar alle overgedragen in dezelfde 0,2 ml buis. Zodra bioparticles verzameld moet erop worden tijdens het verwijderen van de gel-filmschuif van de microscoop podium en de plaatsing van de 0,2 ml buis zodanig dat de punt van de naald niet wordt verstoord. Tijdens plaatsing van de punt van de naald in het amplificatie mengsel onder aan de 0,2 ml buis, moet de punt van de naald niet contact met de zijkanten van de buis maakt om verlies van materiaal aan de zijkanten van de buis voorkomen. Hoewel de oplosbaarheid van de lijm typisch snel (~ 30 sec of minder, afhankelijk van de grootte van de lijm "ball") en kan gevolgd tijdens microscopisch onderzoek, de punt van de naald moet langzaam van het amplificatie mengsel verwijderd dat volledige waarborgen oplosbaarvan de lijm is bereikt. Wanneer de lijm niet volledig opgelost, kan de naald terug naar de vloeistof volledig oplossen mogelijk.

De hier beschreven protocollen zijn geoptimaliseerd voor gebruik met bioparticles en menselijke cellen uit forensisch biologische bewijs. De lysis buffer gekozen verenigbaar met het gekozen DNA-STR amplificatie kit. Alhoewel er geschikte alternatieve lysis buffers, moet de efficiëntie qua cellyse en compatibiliteit met downstream analyse gecontroleerd door de gebruiker. Daarnaast hebben de STR versterking set en versterking cyclusnummer beschreven in dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met of enkele bioparticles. Een volgende generatie STR versterking kit met gerapporteerde verhoogde robuustheid en gevoeligheid werd geselecteerd en is aangetoond te leiden tot het herstel van hoge kwaliteit STR profielen uit of enkele bioparticles. Terwijl tal van andere STR kits, met wisselende aanbevolen versterkercatie cyclus nummers, beschikbaar zijn, kunnen zij niet geschikt gevoeligheid bezitten en daarom zou moeten goed worden geëvalueerd voor gebruik in deze protocollen.

Ondanks het succesvolle gebruik van de beschreven methoden voor het herstel STR profielen uit of enkele bioparticles, zal het slagingspercentage van het profiel van herstel niet 100%. Daarom is voor sommige monsters een beperkte gedeeltelijke DNA-profiel of geen profiel worden waargenomen. Dit kan niet worden vermeden vanwege het onvermogen om meest bioparticles afdoend visueel identificeren als celmateriaal, de potentiële gedegradeerde toestand van het kernmateriaal in de opgevangen bioparticles of verlies van monstermateriaal van het kleefmiddel vóór de overdracht in het reactievat. Daarom wordt de analyse van een enkele bioparticle monster voor elke aanraking DNA punt niet aan te raden. We verzamelen vaak 20 sample sets van een individu gel-film monster en zal extra sample sets te verzamelen als dat nodig is als er een geschikte STR-profiel niet wordt verkregen. Thij enige beperking voor collecties is de hoeveelheid biologisch materiaal aanwezig op de gel-filmmonster (en waarschijnlijk een analyse kosten, hoewel de microvolume reacties bieden de mogelijkheid om bijkomende monsters te verzamelen voor een vergelijkbare of lagere kosten als een standaard reactievolume ( bijvoorbeeld 25 pi).

De ontwikkelde DNA profiling methoden beschrijven hier zorgen voor een moleculaire benadering van de karakterisering, de analyse en interpretatie van sporen biologisch materiaal hersteld van aanraking DNA-monsters. Er is echter aanvullende genetische informatie die kan worden verkregen van de teruggewonnen bioparticles naast de bepaling van de donor (bijv STR profiel) van de donor van het biologisch materiaal. Het weefsel of orgaan bron van herkomst vloeistof (bijv huid versus speeksel) kan van cruciaal belang contextuele informatie om een strafrechtelijk onderzoek te verstrekken. Zonder een dergelijke bepaling, kan de dubbelzinnigheid van het weefsel bron van herkomst worden exploperkte als alternatieve omstandigheden van het misdrijf (bijvoorbeeld, hoe het lichaam vocht kunnen gedeponeerd zijn) kan worden voorgesteld. De bioparticle verzamelen en isolatie protocollen beschreven kunnen worden gebruikt om bioparticles of andere cellen (bijvoorbeeld buccaal, vaginaal) voor gebruik in een bronweefsel identificatie (mRNA profielen ^21-30) strategie behelst micro-volume reverse transcriptie (RT) verzamelt en amplificatiereacties. Met verdere optimalisatie kan het ook mogelijk zijn om een ​​DNA / RNA co-isolatie strategie celtype identificatie (RNA) en STR profilering overschakeling van hetzelfde monster, waaronder bioparticles uit aanraken DNA- bewijsmateriaal ontwikkelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
SealRite 1,5 ml natuurlijke microcentrifugebuizen, steriel	USA Scientific	1615-5510	er zijn talrijke alternatieve leveranciers beschikbaar, maar buizen moeten steriel zijn
0,2 ml PCR-buizen met platte dop, natuurlijk	Phenix Research	MPX-200F	of equivalent
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666 en/of 06-666-11C
Alcohol prep pads	Fisher Scientific	06-669-62	alternatief is 06-665-24 (Fisher Sci); blikje grotere alcohol doekjes in plaats van individuele pads
Steriele water			18,2 MΩ, geautoclaveerd
Glazen microscoopglazen, mat, 3" x 1": 1 mm	Fisher Scientific	12-544-3	alternatieve merken of maten zijn acceptabel
Wegwerp overdrachtspijp	Fisher Scientific	13-711-9D	alternatieven zijn acceptabel
Trypan blauw oplossing	Sigma	T8154
Pipetten: 0,2-2, 2-20, 10-100, 100-1.000 μl	diverse
Steriele, aerosol-bestendige pipet tips	diverse
Mini-centrifuge	diverse
Stereomicroscoop	Leica	M205C	anderen zijn geschikt, maar moeten in staat zijn tot vergroting tot 350X
GeneAmp PCR systeem 9700 thermische cyclus (zilveren of gouden blok)	Life Technologies	N8050200 of 4314878	andere modellen en fabrikanten kunnen worden gebruikt, maar prestaties met de STR-amplificatiekit moeten worden geverifieerd
3130 Genetic Analyzer	Life Technologies	3130-01	alternatieven: 310 of 3500 Genetic Analyzers (Life Technologies)
GeneMapper software	Life Technologies	diverse	diverse versies van de software zijn beschikbaar en kunnen worden gebruikt
WF Gel-Film, x8 retentieniveau	Gel-Pak	WF-40-x8-A	4" x 4" wafer film; kan worden besteld in andere maatspecificaties
Dubbelzijdig plakband	diverse
Glazen blok, 3" x 1,5" x 3/8"	McCrone Microscopes and Accessories	370-2	of equivalent
[header]
Wolfraamnaald met houder	McCrone Microscopes and Accessories	106
3M wateroplosbare golfsoldertape, 5414 transparant	Allied Electronics	70113977
Lysis buffer (forensicGEM Speeksel, Zygem)	VWR	95043-992	Lysis buffer wordt bereid in 10 μl porties (bereid extra master mix porties indien nodig om het gewenste aantal monsters te accommoderen). 1,5 μl wordt voor elk monster gebruikt. Om 10 μl lysis buffer te bereiden (voldoende voor ~6 monsters): 6,9 μl steriele water, 2,1 μl 10x buffer - blauw, 1 μl forensicGEM.
STR Amplificatiekit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplificatiekit	Life Technologies	4427368	Alternatieve STR-amplificatiekits kunnen worden gebruikt, maar prestaties zouden moeten worden geverifieerd door gebruiker. De amplificatiemix wordt als volgt bereid (volumes per monster): 2,2 μl PCR reactiemix, 1,1 μl Primer set, 0,2 μl (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. Een mastermix voldoende voor het gewenste aantal monsters moet worden bereid. 3,5 μl van de bereide mix wordt toegevoegd aan de 0,2 ml buis voor biodeeltje collectie.
AmpliTaq Gold DNA polymerase	Life Technologies	N808-0245
HiDi formamide	Life Technologies	4311320
GeneScan 500 LIZ maatstandaard	Life Technologies	4322682
96-well optische reactie platen	Life Technologies	N8010560
Plate septa, 96 well	Life Technologies	4315933
Prestatie-geoptimaliseerde polymeer, POP-7	Life Technologies	4363785	Alternatieven zoals POP-4 zijn acceptabel