Dit manuscript beschrijft een protocol om het reuksysteem van knaagdieren te onderzoeken. De reuk habituatie/dishabituatie test zal onderzoekers in staat stellen om te bepalen of een muis zich aanpast aan een herhaaldelijk gepresenteerde geur en of de muis dishabituatie vertoont wanneer een nieuwe geur wordt gepresenteerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Testen voor Geur Discriminatie en gewenning in Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze video demonstreert een techniek om de aanwezigheid van een normaal functionerend reuksysteem bij een muis vast te stellen. De test helpt te bepalen of de muis onderscheid kan maken tussen niet-sociale geuren en sociale geuren, of de muis aan een herhaaldelijk gepresenteerde geur went, en of de muis dishabituatie vertoont wanneer hem een nieuwe geur wordt gepresenteerd. Aangezien veel testen voor sociaal gedrag de reactie van het experimentele dier op een bekende of nieuwe muis meten, kunnen valse positieven worden vermeden door vast te stellen dat de dieren sociale geuren kunnen detecteren en onderscheiden. Er zijn vergelijkbare overwegingen bij leertests zoals angstconditionering die geur gebruiken om een nieuwe omgeving te creëren of reuksignalen als een associatief stimulus. Tekortkomingen in het reuksysteem zouden het vermogen om onderscheid te maken tussen contexten en om een associatie te vormen met een reuksignaal tijdens angstconditionering, verstoren.
In de geurwent/dishabituatietest wordt de muis herhaaldelijk geconfronteerd met verschillende geuren. Elke geur wordt drie keer gedurende twee minuten gepresenteerd. De onderzoeker registreert de snuiftijd gericht naar de geur als maatstaf voor de reukresponsiviteit. Een typische muis vertoont een afname in reactie op de geur bij herhaalde presentaties (wenten). De experimentator presenteert vervolgens een nieuwe geur die een toename van het snuiven naar de nieuwe geur veroorzaakt (dishabituatie). Na herhaalde presentatie van de nieuwe geur vertoont het dier opnieuw wenten. Dit protocol omvat de presentatie van water, twee of meer niet-sociale geuren en twee sociale geuren. Naast het verminderen van experimentele verwarring kan deze test informatie bieden over de functie van de reuksystemen van nieuwe knockout-, knock-in- en conditionele knockoutmuislijnen.
Inleiding
Muizen zijn afhankelijk van de reukzin voor het navigeren nieuwe omgevingen, het vinden van voedsel, voor de erkenning van andere individuen, en seksueel gedrag 1-3. Het is essentieel dat onderzoekers aangetoond of proefdieren een functionerende reukzin Alvorens gedragstesten dat voedsel, sociale interactie, of geuren bedoeld om een reactie van de muizen op te wekken omvatten. Anosmie of het onvermogen om onderscheid te maken tussen verschillende geuren kunnen leiden tot valse positieven en negatieven in diverse gedragsparadigma's, dus het vermogen van een muis te detecteren en te onderscheiden geuren worden vastgesteld voor andere typen gedragstesten uitgevoerd.
De olfactorische gewenning / dishabituation test werd voor het eerst beschreven in de jaren 1980 4. De test is aangepast voor gebruik in muizen door Drs. Mu Yang en Jacqueline Crawley 5. Dit is een eenvoudige en goedkope test die het mogelijk maakt de onderzoeker om estaBlish dat een muis kan detecteren en onderscheid maken tussen geuren. Naast het testen reukzin deze test kan de onderzoeker de algemene werking van de muis observeren en moet het begin van een test regime worden uitgevoerd. Kwalitatieve waarnemingen met betrekking tot de motoriek van de muis, tekenen van angst, het niveau van de activiteit, en de respons op sociale geuren versus voedsel geuren kunnen nieuwe gebieden waar het testen kunnen worden uitgevoerd signaal.
In deze test worden wattenstaafjes ondergedompeld in verschillende geuren driemaal voorgelegd aan een muis in een rij. Met elke herhaalde presentatie van een geur, zal de muis wennen aan het wattenstaafje, besteden minder tijd aan het onderzoeken van het met elke volgende presentatie. Wanneer een nieuwe geur wordt gepresenteerd, dishabituation optreedt, en een typisch muis zal meer tijd besteden aan het onderzoeken van het staafje, wat aangeeft dat het onderscheid kan maken tussen de huidige en de vorige geuren 5. Deze test wordt toegediend aan een muis per keer en omvat een 45 min acclimation periode gevolgd door 45 min van het testen.
Hoewel deze test is gemakkelijk uit te voeren kan worden gebruikt om geavanceerde vragen muis olfactorische systeem te onderzoeken. Andere populaire tests reukzin, zoals het begraven voedsel test slechts de aanwezigheid of afwezigheid van anosmie stellen. De olfactorische discriminatie en gewenning toets kunnen de onderzoeker om te bepalen of een muis heeft niet alleen het vermogen om geuren te detecteren keuze maken tussen verschillende geuren. Het patroon van gewenning en dishabituation is gebruikt om te tonen dat de nieuwe mutanten kunnen maken tussen geuren 6,7. In een verrassende studie, Fadool en collega's gebruikt complexe mengsels van geuren dat muizen met gen-gerichte schrapping van de Kv1.3 kanaal laten worden "super smellers" die zeer vergelijkbare geuren beter dan normale muizen 8 kunnen discrimineren.
Bij het onderzoek van een nieuw knockout muismodel is het nuttig om Establish de aanwezigheid van normaal gedrag voor basis zintuiglijke taken. Toen vroeg gedaan in een test regime, de discriminatie geur en gewenning test geeft een onderzoeker de mogelijkheid om eventuele ongewone gedrag te observeren. Deze waarnemingen kunnen vals positieve of negatieve resultaten in daaropvolgende tests die worden ingegeven door de kenmerken van de verstorende mutant worden voorkomen. Als onderzoekers blijven sociaal gedrag nagaan welke fundamentele olfactorische werking gecontroleerd steeds belangrijker. Naast onderzoek reukzin in mutantlijnen, kan deze test worden gebruikt om bepaalde zaken als het farmacologisch samenwerkende dosis respons van een dier op sociale geur stimuli vergroot of als de reactie stijgt tot alle geur stimuli pakken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De volwassen mannelijke muizen gebruikt in het volgende experiment werden gegenereerd en ondergebracht bij Baylor University bij een omgevingstemperatuur van 22 ° C, met een 14 uur licht en 10 uur donker (20:00-06:00 uur) dagelijkse cyclus. De muizen kregen ad libitum toegang tot voedsel en water. Alle procedures om de muizen waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Richtlijnen voor de Zorg en gebruik van proefdieren en het dier protocol werd goedgekeurd door Baylor University Animal Care en gebruik Comite. De muizen werden getest in de late ochtend / begin van de middag. Voor alle procedures onder de onderzoeker moet handschoenen dragen om geuren te elimineren en besmetting te voorkomen.
1. Voorbereiding van de Non-sociale Geuren
- Bereid verse non-sociale geuren elke dag van het testen.
Opmerking: De onderzoeker moet handschoenen te gebruiken om de geuren te bereiden.- Vul 3 centrifuge buizen met 10 ml water.
- Pipetteer 100 ul van bananen extract in een 15 ml & #160, conische buis en 100 pl amandelextract in een tweede 15 ml conische buis voor een 1: 100 verdunning.
Opmerking: De derde 15 ml buis alleen water bevatten.
2. Voorbereiding van Sociale Geuren
- Bereid nieuwe sociale geuren op de ochtend testen zal plaatsvinden. Verkrijgen sociale geuren uit twee kooien die niet zijn schoongemaakt voor minstens drie dagen en een gelijk aantal muizen bevatten. Verkrijgen sociale geuren uit muizen van hetzelfde geslacht als de proefpersoon.
Opmerking: Dit zijn bij kamertemperatuur worden bewaard en binnen 4-6 uur worden gebruikt om sterke en consistente geur behouden.- Bepalen hoeveel sociale geur wattenstaafjes moeten worden gemaakt: elke muis wordt getest zal worden gepresenteerd met drie swabs van sociale geur 1, en drie uit de sociale geur 2.
- Bereid sociale geuren door vegen een wattenstaafje in een zigzag manier over de bodem van een vuile kooi. Schud het teveel aan beddengoed klampt zich vast aan het uiteinde.
- Store swabs in grote glazen potten met deksels of bekers bedekt met parafilm. Wijst een container voor sociale geur 1 en een tweede voor de sociale geur 2.
- Handhaaf geurbron kooien buiten de experimentele testen kamer.
3. Acclimatisering van de Test Muis
- Trek handschoenen en weeg de muis te testen en plaats individueel in een schone kooi met een draad deksel bovenop de waterfles verwijderd.
- Laat de muis om te wennen aan de nieuwe kooi voor 45 min in een andere kamer dan de testkamer. Zorg ervoor dat er geen ongewone geuren of geluiden in de kamer.
- Als testen duurt ongeveer 45 minuten, wankelen de acclimatisering keer door de invoering van de volgende muis te testen in een schone kooi naar rechts acclimatiseren voordat het testen van de huidige muis.
4. Voorbereiding van de testkamer
- Plaats verse wattenstaafjes, laboratorium tape, de flessen met sociale geur swabs, de buizen van non-sociale geuren, een micropipet, twee timers, en een fles afval met een deksel in de testkamer.
- Zorg ervoor dat de testkamer is redelijk vrij van geuren, harde geluiden en fel licht. Heeft geurende eau de cologne of lotions niet dragen.
Opmerking: De waarnemer mag niet kauwgom of snoep tijdens de testperiode en moeten proberen om hun blootstelling te beperken tot sterke geur voedsel.
5. Testing Procedure
- Breng het gewend muis in zijn kooi in de testkamer en plaats de kooi op de teller op een hoogte die comfortabel is voor het bekijken van zittend.
- Presenteer elke geur 3 keer op rij gedurende 2 minuten per keer. Gebruik de presentatie, zodat kan worden gevonden in tabel 1.
- Pipetteer 50 ul van geurstof in de geur te testen op het uiteinde van het wattenstaafje en-cap de geurbron. Til de draad bovenkant van de kooi en plaats de ongeparfumeerde, houten einde van het staafje in de fles water opening, Pushing de lengte via de onderzijde van de draad op de top. Raak de katoen tip om het even wat, met inbegrip van de vingers, zodat de geur besmetting wordt vermeden.
- Blijf het staafje te trekken door middel van de fles water opening tot ongeveer 1 inch van de katoen eind naar beneden hangt in de kooi. Bevestig het houten uiteinde van het wattenstaafje naar de zijkant van de kooi met behulp van lab tape.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te laten het deksel weer op de kooi vallen, waardoor een hard geluid dat de test muis zou verstoren. - Onmiddellijk beginnen timing voor 2 min. Gebruik een timer om de 2 min presentatietijd. Noteer de cumulatieve tijd snuiven de geur tijdens de 2 min trial. Tel snuiven gedrag van het dier met behulp van een aparte stopwatch. Actieve snuiven wordt gedefinieerd wanneer de neus van het dier is gericht op het wattenstaafje met zijn neus ~ 2 cm of dichter bij de tip.
- Na de voltooiing van elke proef, verhogen de draad deksel en verwijder het wattenstaafje door hem naar beneden te trekken via de VNderside van het deksel (dit voorkomt geur besmetting door te voorkomen dat de katoen tip van het aanraken van de draad). Dicht de gebruikte wattenstaafje in een 500 ml fles afval.
- Bereid en steek de volgende wattenstaafje en beginnen timing. Laat ongeveer 1 min tussen elke inter-proces interval. Ga door tot elke geur is drie keer gepresenteerd in een rij, voor 2 min per keer.
- Zodra de muis alle beproevingen heeft voltooid, leeg de fles afval dat de gebruikte wattenstaafjes in een prullenbak buiten de testruimte. Zet de muis aan zijn kooi.
6. Analyse
- Analyseer gegevens voor elke groep per geur conditie met behulp van twee-weg ANOVA gevolgd door Newman-Keuls of een soortgelijke post hoc test om significante gewenning bepalen (minder tijd snuiven opeenvolgende dezelfde geuren), en dishabitutation (meer tijd snuiven een nieuwe geur).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Naar aanleiding van de beschreven protocol werden de resultaten opgenomen met de tien volwassenen (postnatale dag 90-120) mannelijke C57BL / 6J muizen en acht mannelijke FVB mixed-achtergrond stam (postnatale dag 50-70). Het testen werd uitgevoerd door een enkele onderzoeker over meerdere dagen worden uitgevoerd. Elk punt op de grafiek is de gemiddelde tijd onderzoekt een geur.
Wanneer het wattenstaafje gedoopt in water eerst wordt geïntroduceerd, de muizen besteden een groot deel van de tij...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De informatie in dit document resultaten zijn optimaal voor muizen. De muizen tonen een sterke reactie op een nieuwe geur, dan snel wennen. Eén van de belangrijkste stappen van deze werkwijze is de bereiding van de geuren. De onderzoeker moet grote zorg om de geuren van elkaar isoleren om besmetting te voorkomen. Een ander belangrijk aspect is de presentatie van het wattenstaafje. De onderzoeker moet de beste locatie van het wattenstaafje op te lossen, zodat de muis de tip kunnen onderzoeken, maar niet scheurt aan het u...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk wordt ondersteund door een subsidie van de Baylor University Research Council en door een onderzoekssubsidie van de Epilepsy Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Muizenkooi | Allentown | Standaard muizenkooi | |
| Draaddeksel | Allentown | BCU Muis WBL 2500 | |
| Bedding | Harlan | 7090 Sani-Chips | |
| Wattenstaafjes | VWR | 89031-270 | 6” houten handvat |
| Bananenextrakt | McCormick | ||
| Amandelexftrakt | McCormick | ||
| Laboratoriumtape | VWR | 89098-062 | |
| Stopwatch | VWR | 62374-000 | |
| Nitrilhandschoenen | VWR | 82026 | |
| Timingapparaat | VWR | 61161-350 | |
| 15 ml kegelbuisjes | VWR | 89003-294 | |
| 2 L bekers | Pyrex | 1003 | |
| Parafilm | Parafilm | PM-992 | 4” x 250’ |
| 1 L fles met dop | VWR | 89000-240 |
Referenties
- Doty, R. L. Odor-guided behavior in mammals. Experientia. 42, 257-271 (1986).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm Behav. 46, 247-256 (2004).
- Keverne, E. B. Importance of olfactory and vomeronasal systems for male sexual function. Physiol Behav. 83, 177-187 (2004).
- Gregg, B., Thiessen, D. D. A simple method of olfactory discrimination of urines for the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. Physiol Behav. 26, 1133-1136 (1981).
- Yang, M., Crawley, J. N. Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8 24), (2009).
- Pan, Y. W., Kuo, C. T., Storm, D. R., Xia, Z. Inducible and targeted deletion of the ERK5 MAP kinase in adult neurogenic regions impairs adult neurogenesis in the olfactory bulb and several forms of olfactory behavior. PLoS ONE. 7, e49622(2012).
- Wesson, D. W., Levy, E., Nixon, R. A., Wilson, D. A. Olfactory dysfunction correlates with amyloid-beta burden in an Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci. 30, 505-514 (2010).
- Fadool, D. A., et al. Kv1.3 channel gene-targeted deletion produces 'Super-Smeller Mice' with altered glomeruli, interacting scaffolding proteins, and biophysics. Neuron. 41, 389-404 (2004).
- Arakawa, H., Arakawa, K., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Scent marking behavior in male C57BL/6J mice: sexual and developmental determination. Behav Brain Res. 182, 73-79 (2007).
- Baum, M. J. Sexual differentiation of pheromone processing: links to male-typical mating behavior and partner preference. Horm Behav. 55, 579-588 (2009).
- Ferguson, J. N., et al. Social amnesia in mice lacking the oxytocin gene. Nat Genet. 25, 284-288 (2000).
- Yang, M., et al. Low sociability in BTBR T+tf/J mice is independent of partner strain. Physiol Behav. 107, 649-662 (2012).
- Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33, 1206-1215 (2008).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2011).
- Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nat Methods. 11, 629-632 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
