Dit artikel beschrijft de meting van de functionele capaciteit van de linker ventrikel bij muizen door middel van druk/volume analyse bij verschillende hartslagfrequenties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hartkatheterisatie in Muizen bij de Pressure Volume Relationship Meet: Onderzoek naar de Bowditch Effect
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dierlijke modellen dat de menselijke cardiale aandoeningen nabootsen zijn gemaakt om potentiële therapeutische strategieën te testen. Een belangrijk onderdeel voor de evaluatie van deze strategieën is om hun effecten op de hartfunctie te onderzoeken. Er zijn verschillende technieken voor het meten van in vivo cardiale mechanica (bijvoorbeeld, echocardiografie, druk / volume relaties, etc.). In vergelijking met echocardiografie, real-time linkerventrikel (LV) druk / volume analyse via katheterisatie is nauwkeuriger en inzichtelijke bij de beoordeling van LV functie. Bovendien LV druk / volume-analyse biedt de mogelijkheid om onmiddellijk veranderingen opnemen tijdens manipulaties van contractiliteit (bijvoorbeeld β-adrenerge stimulatie) en pathologische beledigingen (bijvoorbeeld ischemie / reperfusie schade). Naast het maximum (+ dP / dt) en minimum (-dP / dt) snelheid van drukverandering in de LV, een nauwkeurige vaststelling van de LV functie via meerdere lastonafhankelijk indices (bijvoorbeeld end systolische drukvolume relatie en preload rekruteerbare beroerte werk) kan worden bereikt. Hartslag heeft een significant effect op LV contractiliteit zodat een verhoging van de hartfrequentie is het belangrijkste mechanisme hartminuutvolume (dwz Bowditch effect) te verhogen. Dus, bij het vergelijken hemodynamica tussen experimentele groepen, is het noodzakelijk om soortgelijke hartfrequenties hebben. Verder is een kenmerk van vele cardiomyopathie modellen van vermindering van contractiele reserve (dwz verminderde Bowditch effect). Bijgevolg kan belangrijke informatie worden verkregen door het bepalen van de effecten van toenemende hartfrequentie op de contractiliteit. Onze en andere gegevens heeft aangetoond dat de neuronale nitric oxide synthase (NOS1) knockout muis is afgenomen contractiliteit. Hier beschrijven we de procedure voor het meten van LV druk / volume met stijgende hartslag met behulp van de NOS1 knockout muismodel.
Inleiding
Het doel van het hart om bloed te pompen door het lichaam om de metabolische vereisten van het organisme te voldoen. Aangezien deze eisen voortdurend schommelen (bijvoorbeeld tijdens de training), moet het hart te passen (bijv toename hartminuutvolume). Het hart heeft bedacht tal van trajecten om deze prestatie te bereiken. De belangrijkste manier het hart bereikt dit is via een verhoging van de hartslag (dwz Bowditch effect) 1. Dat wil zeggen, als een hartslag toeneemt, resulteert in een toename van contractiliteit en een toename van de cardiale output. Zo hartfunctie is zeer afhankelijk van de hartslag. Helaas, hartaandoeningen (bijvoorbeeld hartinfarct, hypertrofie, enz.) Vermindert de hartfunctie waarbij het hart derhalve niet in staat om de metabolische behoeften van het lichaam te voldoen. Hartziekte is de voornaamste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de westerse samenleving. Dierlijke modellen die veel menselijke cardiomy recapitulerenopathies worden gebruikt om moleculaire mechanismen en mogelijke therapieën te testen. Om deze mechanismen te onderscheiden en te bepalen of een therapie levensvatbaar kan zijn, moeten de onderzoekers hartfunctie in vivo te beoordelen.
Er zijn verschillende manieren om de hartfunctie te bepalen in vivo (bijv echocardiografie, MRI, etc.), welke op routinematige wijze ejectiefractie, fractionele verkorting, hartminuutvolume, etc. Echter, deze parameters zijn sterk afhankelijk afterload, preload en hartslag Naast contractiliteit 2. Het meten van de contractiliteit is onmisbaar voor de intrinsieke eigenschappen van het hart te begrijpen in zijn natuurlijke omgeving. De maximale (dP / dt max) snelheid van de druk ontwikkeling brengt ons een stap dichter bij het begrijpen van de contractiliteit. Helaas, dP / dt is ook afhankelijk van de hartslag en het inladen 3. Daarom technieken zijn ontwikkeld om de belasting (en hartslag te meten, zie below) onafhankelijke indices van myocard contractiliteit (dwz eind systolische druk volume relatie (ESPVR) en voorspanning rekruteerbare beroerte werk (PRSW)) 4-6. ESPVR beschrijft de maximale druk die kan worden ontwikkeld door het ventrikel op elk LV volume. De helling van ESPVR vertegenwoordigt het eind-systolische elastantie (Ees). PRSW is de lineaire regressie van een beroerte werk (gebied binnen de PV lus) van eind-diastolische volume. Deze procedures zijn een nauwkeurige en precieze meting van contractiliteit vergeleken met hemodynamische parameters zoals de ejectiefractie, cardiac output en slagvolume. ESPVR en PRSW kan worden verkregen via de tijdelijke blokkering van de vena cava inferior (IVC). Het blokkeren van de IVC kan worden uitgevoerd met een gesloten kist op het effect van het veranderen intrapleurale druk hartfunctie voorkomen.
Het verhogen van de hartslag verhoogt ook contractie en ontspanning 1. Dus, bij het vergelijken van de hartfunctie tussen Experimental groepen (bijvoorbeeld ± dP / dt), moeten hart tarieven vergelijkbaar zijn. Echter, vergelijkbare hartslag gewoonlijk niet voorkomen in elk dier als gevolg van diverse aandoeningen (ziekte, research ingrijpen, etc.). Opgemerkt zij dat anesthesie (injecteerbare en inhalatie) verlaagt de hartslag. Hartslag is een belangrijke determinant van contractiliteit, zal verdoving aanzienlijk beïnvloeden contractiliteit. Daarom zijn we procedure beschrijft. Bovendien, een kenmerk van vele cardiomyopathieën is een verminderde contractiele reserve (dwz een verminderde Bowditch effect). Daarom moet hartfunctie gemeten over een bereik van hartslagen. Hier beschrijven we hoe een stimulator gebruiken (met gesloten borst) om deze effecten te bereiken.
Naast hartslag, stikstofoxide (NO) is een belangrijke modulator van contractiliteit 7. NO wordt geproduceerd via enzymen genaamd NO synthase (NOS). Wij en anderen hebben aangetoond dat muizen met knockout van neuronale NOS (NOS1 - / -) zijn afgerond myocyte contractie en in vivo cardiale hemodynamica 8,9. Deze muis wordt gebruikt voor de meting van de linker ventriculaire contractiliteit te tonen via de LV druk / volume analyseprocedure uitgevoerd bij verschillende hartfrequenties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
NB: Dit dier protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Ohio State University. Deze procedure kan worden gebruikt op elke muis, waarbij de binnendiameter van de halsslagader groot genoeg is om de katheter in te brengen. Gebruik muizen die boven 16 g (ouder dan ~ 2 maanden).
1. Voorbereiding Muis voor Catheterization
- Seal alle chirurgische instrumenten en benodigdheden in een sterilisatie zakje. Steriliseer het zakje in een autoclaaf machine. Zorg voor een steriele veld tijdens de gehele procedure en draag steriele handschoenen.
- Verdoven muizen met ketamine (55 mg / kg) plus xylazine (15 mg / kg) door intraperitoneale injectie.
LET OP: De hele procedure het meten van zowel de druk / volume op verschillende hartslag en ESPRV duurt minder dan 20 min. Als er extra tijd nodig (dat wil zeggen meer dan 30 min), geeft extra ¼ dosis van anesthesie iedere 30 min. - Verwijder de haren in de voorste rEgion van nek en borst met haar verwijderen lotion (bijv Nair) en plak de ledematen van de muis op het schuim platform. Bevestig een staat van diepe anesthesie door een teen knijpen.
- Plaats een rectale sonde controleren van de lichaamstemperatuur (37 ± 1 ° C) en onderhouden met behulp van een thermisch gestuurde verwarmingselement (gelegen tussen de chirurgische doek en platform).
- Bereid een lengte van 4-0 hechtdraad (~ 10 cm). Loop hechtdraad rond de bovenste snijtanden en tape naar platform. Hierdoor wordt de nek recht te houden.
- Steriliseer de chirurgische gebied door zwabberen het gebied met Betadine en 75% alcohol drie keer.
2. Catheterization
- Bereid de catheter door voorweken de tip in zoutoplossing of gedestilleerd water (37 ° C) gedurende ten minste 30 min voorafgaand aan gebruik (volgens de instructies van de fabrikant) met de druksensor membraan acclimatisatie gedurende het natte biologische omgeving en druksignaal drift en negatieve voorkoming drukregistraties.
- Wordt longitudinale 0,8 cm incisie tussen de onderkaak en sternum in het voorste gebied van de nek. Met de fijne schaar, scheid de huid intramusculaire bindweefsel de luchtpijp onder de stemohyoideus spier bloot.
- Scheid de vet- en spierweefsel aan de rechterzijde van de trachea met gebogen tang om de rechter halsslagader bloot.
OPMERKING: De halsslagader is de grootste slagader in het voorste gebied van de hals, bevat heldere rode bloedcellen en pulserend. Niet te verwarren met de halsader, dat parallel aan de halsslagader loopt. De halsslagader is donkerrood en niet-pulserend. Bovendien, tijdens de isolering van de halsslagader dient de gebruiker zich bewust van niet beschadigen pneumogastricus zenuw. - Ontvet uit de rechter halsslagader met de gebogen forceps. Indien er vertakking van het vat dat deze operationele techniek zal belemmeren, snij ze een Bovie cauterisatie de halsslagader dissociëren.Scheid zoveel van het weefsel mogelijk onder de halsslagader via gebogen pincet.
- Snij twee 5 cm 6-0 zijden draden. Leid elke zijde draad onder de rechter halsslagader.
- Positie één thread nabij het proximale gedeelte en het andere bij het distale deel van de slagader. Maak een strakke knoop op de draad aan het distale deel, en maak een losse knoop op de draad aan het proximale deel.
- Blokkeer de bloedstroom door klemmen het proximale gedeelte van de slagader met een kleine hemostaat vasculaire klem (plaats de klem onder de proximale schroefdraad). De verzegelde gebied van de slagader zal worden gevuld met bloed waardoor het gemakkelijk is om stap 2.8 uit te voeren.
- Doorboren gaatje in de rechter halsslagader tussen de twee draden (maar dichter bij het distale schroefdraad) met een 26 G naald. Breng de katheter in de halsslagader. Iets Draai de losse knoop aan het proximale deel van de halsslagader op de katheter op zijn plaats te houden.
LET OP: Het gebruik van de naald punctie wordt de voorkeur in vergelijkingschaar incisie. Door een stevige knoop in het distale deel van de slagader, en dan klemmen van het proximale gedeelte, wordt de slagader volledig opgevuld met bloed. Dit maakt het zeer eenvoudig te porren door het bloedvat. Bovendien is de grootte van de naald (26 G) vernietigt de slagader met een gat dat goed past bij de afmeting van de katheter. Bij gebruik van de schaar incisie werkwijze, was het moeilijker om de grootte van de incisie regelen. Toch moet de gekozen methode afhankelijk zij van welke de chirurg voelt comfortabel. - Start de opname druksignalen zoals in stap 3.
- Maak de hemostaat klem en verder het inbrengen van de katheter naar voren in de linker hartkamer. Als enige weerstand wordt ervaren bij het bevorderen van de katheter, trek het voorzichtig terug en probeer het opnieuw bevorderen. Bij een muis met een gewicht van 18-25 g ~, de geschatte lengte van de katheter die ingebracht is 18 mm.
OPMERKING: De arteriële druk signaal zal fluctueren 70-120 mm Hg. Eenmaal tHij katheter in de linkerventrikel de vorm van het druksignaal verandert en de druk fluctueert 0-120 mm Hg (zie figuur 1). Hartfunctie stabiliseert binnen 2-3 minuten na het inbrengen van de catheter. - Continu monitoren lichaamstemperatuur, anesthesie-niveau, en ademhaling.
3. Data Acquisition
- Gebruik LabChartPro 7-software (of vergelijkbare software). Gebruik de workflow optie van de PV-Loop LabChart Module. Met deze module, selecteert u de druk en het volume Loops standaardinstelling.
- Set-up drie kanalen: een kanaal voor de druk, één kanaal voor volume, en één kanaal voor de hartslag. Set schaal reeksen van bovenstaande parameters als 0-150 mm Hg, 0-100 ui en 0-800 ritme / min, respectievelijk.
- Druk op start-toets om op te nemen.
4. Bowditch Effect
- Maak een 1 cm incisie in de precordium evenwijdig aan het manubrium. Snijd de spierlaag en expose de intercostale ruimte met een schaar.
- Met behulp van een vierkante puls stimulator, stel de volgende parameters: Voltage van 2 V, de duur van 2 ms, en mogelijk herhaalmodus.
- Houd de negatieve elektrode met een tang en steek het door de vierde intercostale ruimte aan de apicale regio van het hart. Houd de positieve elektrode met een tang en steek deze door de tweede intercostale ruimte rechts atrium gebied van het hart.
- Schakel de stimulator en verandert de frequentie naar het hart tempo van 4 Hz (240 slagen / min) tot 10 Hz (600 slagen / min). Bij elke nieuwe hartslag, het stimuleren van het hart voor 1 min voor het verzamelen van gegevens.
5. Het genereren van de ESPVR en PRSW
- Snijd de huid en spierweefsel loodrecht op het manubrium in de buikstreek met een schaar. Open de enterocoelia en de lever bloot.
- Sleep het Arcus costarum naar het hoofd met behulp van metalen tractie.
- Duw de lever naar beneden meteen wattenstaafje. Wees voorzichtig niet te veel te duwen om de borstholte beïnvloeden. Dit zal hartfunctie veranderen.
- Snijd de falciform ligament van de lever met een schaar om de suprahepatic vena cava inferior (IVC) bloot te leggen.
- Met gebogen pincet snel knijp de IVC voor 5 seconden om de terugkeer van bloed naar het rechter atrium blokkeert. De linker ventriculaire druk en volume zal dalen als gevolg van de verminderde instroom naar het hart. Bij het genereren van deze waarden niet loops dan 60 mm Hg gebruiken. De 60 mm Hg is in verwijzing systolische druk.
Opmerking: Deze waarde wordt ingesteld op 60 mm Hg omdat dit een aanzienlijke daling van de perfusiedruk zal leiden tot coronaire perfusie aanzienlijk verminderen en invloed contractiliteit.
6. Volume Calibration
- Heparinize de muis met 0,1 ml van 1: 5000 heparine-oplossing (verdund met normale zoutoplossing) door intraperitoneale injectie.
- Verwijder de catheter uit de halsslagader. Wanneer de katheter wordt uitgetrokken frOM de halsslagader, gehepariniseerd bloed sijpelt uit de opening waar de catheter werd ingebracht.
- Verzamel dit bloed voor volume kalibratie met behulp van een injectiespuit 1 ml. Vul elk putje in kalibratie cuvette.
- Verwijder het hart om de muis te euthanaseren via verbloeding.
- Plaats de katheter in elk putje en krijg een gestage relatieve volume-eenheid (RVU) waarde. Genereer een standaardcurve met behulp van de diverse standaardvolumes en RVU waarden uit elk putje.
- Zet de opgenomen RVU aan ul.
7. Data Processing
- Om de Bowditch effect te onderzoeken, selecteert steady-state druk / volume sporen uit elke hartslag. Klik op de basislijn analyse om gegevens te verkrijgen.
- Voor ESPVR en PRSW gegevens, selecteert u de eerste ~ 15 druk / volume sporen, klik occlusie analyse in de software om de ESPVR (helling van de druk die wordt ontwikkeld door de LV eind diastolische volume) en PRSW (de lineaire regressie van een beroerte werk genereren met het eind-diastolischevolume) hellingen.
- Luistert aan de vorm van de lussen. Zorg ervoor dat de lus wordt gesloten zonder hoekpunten of wendingen. Dit is een teken van onjuiste katheter of teveel lawaai. Controleer regelmatig lussen tijdens het experiment om te zorgen voor een goede druk en volume data worden gegenereerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De juiste insertie van de katheter in de linker ventrikel is een belangrijke stap om geschikte druk en volume waarden bereiken. Weergegeven in figuur 1, gebruik LabChart Pro 7, is de verandering van de drukcurve (shape and waarden) wanneer de katheter gaat van de slagader in de ventrikel.
Na het correct plaatsen van de katheter in de linker ventrikel, de druk (P) en het volume (V) verkregen waarden worden vervolgens gebruikt om de PV loops (zie figuur 2).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een kritische stap voor deze techniek een betrouwbare maat van contractiliteit verkrijgen juiste plaatsing van de katheter in de LV. Als de katheter niet correct is geplaatst, wanneer de LV samentrekt de wanden contact opnemen met de katheter leidt tot zeer hoog en niet fysiologische drukwaarden waardoor onregelmatig gevormde PV lussen. Indien nodig, kan de katheter worden geroteerd om de correcte plaatsing te bereiken. Een andere belangrijke stap voor deze techniek is om ervoor te zorgen dat de muis ontvangen juiste an...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door NIH-subsidies HL091986 (JPD) en HL094692 (MTZ).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Xlyzine 100 mg/ml | Ana Sed | 4821 | |
| Katamin 50 mg/ml | Ketalar | 310006 | |
| Heparine | APP Pharmaceuticals | 6003922 | |
| 4-0 zijdedraad | Chirurgische specialiteiten | SP102 | |
| 6-0 zijdedraad | Chirurgische specialiteiten | MBKF270 | |
| Pincet | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Gebogen pincet | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Schaar | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Vasculaire klem | Fine Science Tools | 18555-03 | |
| Microscoop | World precision instruments | PZM-3 | |
| Drukkatheter | Millar instruments | SPR-839 | |
| Druk- en volumesysteem | Millar instruments | MPVS-300 | |
| PowerLab4/35 | AD instruments | N12128 | |
| LabchartPro 7 | AD instruments | ||
| Temperatuurregelaar | CWE | TC-1000 | |
| Stimulator | Grass | SD-5 | |
| Steriele handschoen | Micro-Touch | 1305018821 | |
| Haarverwijderingslotion | Nair | ||
| Betadine chirurgische scrub | Veterinair | NDC 6761815401 | |
| Alcohol | Decon Laboratories | 2801 | |
| Bovie cauterisatie | Bovie | AA29 | |
| 1 ml spuit (26 G naald) | BD | 8017299 |
Referenties
- Janssen, P. M. Myocardial contraction-relaxation coupling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1741-H1749 (2010).
- Roman, M. J., Devereux, R. B. Comparison of noninvasive measures of contractility in dilated cardiomyopathy. Echocardiography. 8, 139-150 (1991).
- Hamlin, R. L., del Rio, C. dP/dt(max)--a measure of 'baroinometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 66, 63-65 (2012).
- Feneley, M. P., et al. Comparison of preload recruitable stroke work, end-systolic pressure-volume and dP/dtmax-end-diastolic volume relations as indexes of left ventricular contractile performance in patients undergoing routine cardiac catheterization. J Am Coll Cardiol. 19, 1522-1530 (1992).
- Kass, D. A., et al. Comparative influence of load versus inotropic states on indexes of ventricular contractility: experimental and theoretical analysis based on pressure-volume relationships. Circulation. 76, 1422-1436 (1987).
- Nemoto, S., DeFreitas, G., Mann, D. L., Carabello, B. A. Effects of changes in left ventricular contractility on indexes of contractility in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2504-H2510 (2002).
- Ziolo, M. T., Kohr, M. J., Wang, H. Nitric oxide signaling and the regulation of myocardial function. J Mol Cell Cardiol. 45, 625-632 (2008).
- Barouch, L. A., et al. Nitric oxide regulates the heart by spatial confinement of nitric oxide synthase isoforms. Nature. 416, 337-339 (2002).
- Wang, H., et al. Neuronal nitric oxide synthase signaling within cardiac myocytes targets phospholamban. Am J Physiol Cell Physiol. 294, C1566-C1575 (2008).
- Georgakopoulos, D., et al. In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry. Am J Physiol. 274, H1416-H1422 (1998).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
