Electrospun Nanovezel Steigers met gradaties in Fiber Organisatie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om elektrogesponnen nanovezel steigers met gradated organisatie van vezels fabriceren en hun toepassingen verkennen in het reguleren van de cel morfologie / oriëntatie. Verlopen met betrekking tot fysische en chemische eigenschappen van de nanovezel scaffolds biedt een grote verscheidenheid aan toepassingen op biomedisch gebied.

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om een eenvoudige methode te rapporteren voor het genereren van nanovezelschalmen met gradaties in vezelorganisatie en hun mogelijke toepassingen te testen in het beheersen van celmorfologie/oriëntatie. De nanovezelorganisatie wordt beheerst met een nieuw fabricageapparaat dat de geleidelijke afname van vezelorganisatie in een schaalmoeder mogelijk maakt. Het veranderen van de uitlijning van vezels wordt bereikt door de afzettingstijd van willekeurige elektrogesponnen vezels op een eenzijdig uitgelijnde vezelmatten te verminderen. Door de collector te bedekken met een bewegende barrière/masker, langs dezelfde as als vezelafzetting, wordt de organisatiestructuur gemakkelijk gecontroleerd. Voor weefsel engineering doeleinden kunnen vetafgeleide stamcellen op deze schalmen worden gezaaid. Stamcellen ondergaan morfologische veranderingen als gevolg van hun positie op de gevarieerde organisatiestructuur en kunnen potentieel differentiëren in verschillende celtypen afhankelijk van hun locaties. Bovendien verbetert de gradiëntorganisatie van vezels de biomimicry van nanovezelschalmen zodat ze de natuurlijke oriëntaties van collageennanovezels op de pees-tot-bot invoegplaats beter nabootsen in vergelijking met traditionele schalmen. Door middel van nano-incapsulatie bieden de gradiëntvezels ook de mogelijkheid om chemische gradiënten in vezelschalmen te construeren en daarmee hun potentiële toepassingen in snelle screening van cel-materiaal interactie en interfaasheling van weefsel verder te versterken. Deze techniek maakt de productie van continue gradiëntschalmen mogelijk, maar kan ook potentieel vezels in discrete stappen produceren door de beweging van de bewegende barrière/masker op een discrete manier te controleren.

Inleiding

Nanovezels zijn een populaire programma voor weefselregeneratie vanwege hun vermogen om de extracellulaire matrix in de structuur en relatieve grootte ¹ nabootsen. Sommige natief weefsel interfaces, zoals de pees te bone insertieplaats bevatten collageenvezels, die een variabele organisatiestructuur die toeneemt in aanpassing aan de pees en vermindert de botplaats ^2-5 vertonen. Dus, effectieve weefselregeneratie er behoefte aan een scaffold die effectief deze structurele verloop kan nabootsen fabriceren.

Eerder is er onderzoek gedaan naar geleidelijke veranderingen in vezelsamenstelling, specifiek mineraalgehalte ^6. Echter, herscheppen van de structurele component van bindweefsel blijft grotendeels onontgonnen. Een eerdere studie onderzocht morfologische verlopen door het bestuderen van het effect van oppervlakte silica deeltjesdichtheid op de proliferatie van rat calvarial osteoblasten en vond een inverse verhouding tussen siliciumoxide deeltjesdichtheid en celproliferatie ^7. Maar de morfologische veranderingen die celproliferatie gemedieerde in eerdere werk waren meestal gerelateerd aan oppervlakte-ruwheid ontbreekt het vermogen in het nabootsen van vezels organisatorische ^7,8 veranderingen. Een recente studie geprobeerd om een steiger die de unieke collageen vezeloriëntaties nagebootst met behulp van een nieuwe collector voor elektrospinnen ⁹ fabriceren. Hoewel deze studie geslaagd in het produceren van een steiger met zowel uitgelijnd en willekeurige vezels, is het niet aan de geleidelijke veranderingen tentoongesteld in de inheemse weefsels na te bootsen. Ook in het produceren van afzonderlijke componenten, met een onmiddellijke verandering van afgestemd op willekeurige oriëntatie, de biomechanische eigenschappen van deze steiger aanzienlijk afgenomen. Geen eerdere werk heeft kunnen toepasselijke nanovezel steigers te produceren met continue gradaties in vezeloriëntaties uit uitgelijnd en willekeurige geweest. Onze recente studie heeft aangetoond succesvol recreatie van nanovezel steigersmet gradaties aan vezels organisatie die mogelijk de inheemse collageen organisatie op pees-to-bone inbrengen ¹⁰ kan nabootsen. Dit werk beoogt de protocollen voor de productie van nanovezels scaffolds met een structuur die lijkt op die van vezels organisatie in de natieve pees naar botweefsel-interface aanwezig.

Gradiënt nanovezel structuren zijn mogelijk verregaande toepassingen in een verscheidenheid van terreinen. We concentreerden ons op de applicaties om tissue engineering van de pees-to-bone inbrengen site door het combineren van onze steigers met-vet-afgeleide stamcellen (ADSCs) die al worden gebruikt voor weefselregeneratie op diverse ondergronden ^11-14. Daarnaast ADSCs zijn zeer vergelijkbaar in de natuur te beenmerg stamcellen in termen van multipotentie en hun bron is er in overvloed die kan worden geoogst met behulp van een eenvoudige liposuctie procedure ^15,16. Zaaien deze cellen te gradated nanovezel steigers verder verbetert hun tissue technische toepassingen door de gecontroleerde verdeling van de cellen die potentieel kunnen differentiëren in verschillende weefsels. In aanvulling op het zaaien van stamcellen, kunnen nanovezels worden ingekapseld met signaalstoffen voor de regulatie van cellulaire respons. Koppeling nanoencapsulation de organisatorische verloop van deze scaffolds maakt voor de studie van cellulaire gedrag of mogelijke implantaatontwerpen en coatings. Inkapseling van functionele moleculen zoals bone morphogenetic protein 2 (BMP2), waarvan is aangetoond dat osteoblastdifferentiatie ^15,16 induceren, zou verdere versterking van de tissue engineering toepassingen van deze scaffolds ^10.

Protocol

1. Voorbereiding van de Oplossing

1. Bereid een oplossing van poly (ε-caprolacton) (PCL) _(Mw = 80.000 g / mol) bij een concentratie van ongeveer 100 mg / ml. Los PCL in een mengsel van dichloormethaan (DCM) en N, N-dimethlyformamide (DMF) in een verhouding van 4: 1 (v / v) met een concentratie van 10% (w / v).
2. Plaats de oplossing in een 20 ml glazen buis voor het mengen. Plaats glazen buis in ultrasone reiniger voor 30 minuten, of tot de oplossing is doorzichtig.

2. Inrichting Voorbereiding

1. Voeg de bereide PCL-oplossing in een 5 ml spuit met een 21 gauge stompe naald.
2. Plaats spuitpomp verticaal electrospinning positie volgens figuur 1.
3. Gebruik een RVS-gap collector met een open ruimte van 2 cm x 5 cm voor de lijn vezelsubstraat. Plaats de collector 12 cm vanaf de punt van de naald.
4. Sluit de gelijkstroom (DC) High Voltage stroomtoevoer naar denaald en aard de verzamelaar. Zorg ervoor dat de collector individueel geaard is met geen contact met de andere lab-apparatuur.

3. Electrospinning

1. Set injectiepomp tot 1,50 ml / uur, totdat de druppels die aan de naaldtip worden onmiddellijk vervangen bij het verwijderen. Stel vervolgens het debiet tot 0,50 ml / uur.
2. Draai de spanning operator 12 kV.
3. Electrospin totdat de eenassig uitgelijnde vezels volledig bedekken de kloof op de collector.
4. Breng lijm op de randen van een kleine glazen plaat en breng de vezels uit de spleet collector naar de glasplaat. Plaats de glasplaat boven op een stuk aluminiumfolie die dezelfde grootte als de glazen plaat en is geaard.
5. Plaats de tweede spuit collector volgens figuur 3.
6. Bevestig de plastic masker om de tweede spuit pomp en plaats het 2 mm boven de collector.
7. Voeg cumarine 6 1% (w / w) om de PCL-oplossing als nanoencapsulation is gewenst- en meng tot de oplossing doorzichtig.
8. Laad de PCL of PCL / Coumarine 6 oplossing in een 5 ml naald met een stompe naald van 21 gauge. Stel verticale pomp 0,50 ml / uur en horizontaal trekken aan 9 ml / uur of bij een snelheid van ongeveer 1 mm / min.
9. Electrospin totdat het masker bijna volledig verplaatst buiten de collector, maar het randgebied nog onder het masker.

4. karakteriseren van glasvezels

1. Leg monsters met dubbelzijdige geleidende tape om de metalen stud en jas met platina voor 40 sec met een sputter coater op 40 mA.
   1. Onderzoek vezels door scanning elektronenmicroscoop (SEM) volgens onze eerdere studies ^17,18.
   2. Verzamel beelden met een versnellingsspanning van 15 kV.
2. Voer fast Fourier transformatie (FFT) -analyse op een afzonderlijke vezel monster vezel uitlijning te meten. De gedetailleerde informatie over het meten van glasvezel uitlijning door FFT kan t verwijzeno eerdere studies ^19,20.

5. Seeding Stem Cells.

1. Steriliseer de vezel monsters in een bad met 70% ethanol oplossing gedurende 2 uur. Was daarna de vezels met gedestilleerd water om eventuele verontreinigingen te verwijderen.
2. Verkrijgen menselijke ADSCs en cultuur cellen in een 25 ^cm2 kolf bij 37 ° C in een atmosfeer van 95% lucht / 5% _CO2. Verander het celkweekmedium om de andere dag ^10.
3. Trypsinize de cellen en tel het aantal cellen. Specifiek, verwijder alle kweekmedium uit de celkweek kolf en was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal. Voeg dan 1 m ^l een 0,25% trypsine-EDTA-oplossing (vooraf warm waterbad tot 37 ° C) tot de cel monolaag bedekken en incubeer de kolf in de celkweek incubator gedurende 2-3 minuten. Voeg 4 ml kweekmedium en was alle cellen van het oppervlak door pipetteren het medium in het oppervlak. Centrifugeer de celsuspensie en opnieuw dispergeren the celpellet in het kweekmedium. Tellen cellen via hemacytometer. Zaad ongeveer 1 × 10 ⁴ cellen naar de nanovezel schavot geplaatst in een 35 mm -cultuur schotel en incubeer gedurende 3 en 7 dagen.
4. Stain cellen met fluoresceïne diacetaat (5 mg / ml in aceton) (FDA) dan beeld de monsters met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Specifiek, voeg 100 ul FDA oplossing van de kweekschaal en incubeer gedurende 30 minuten. Was de cellen met PBS drie keer voordat fluorescerende beeldvorming. Analyseer cel oriëntatie door een aangepaste mat-lab-programma op basis van onze eerdere studies ^10.

Resultaten

Met dit protocol, een vezelmat met een organisatorische gradiënt werd gevormd. Figuur 3 toont de SEM beelden die op verschillende locaties op de nanovezel schavot. Kwalitatief kan worden vastgesteld dat er een overgang van het uniaxiaal uitgelijnde vezels bij 0 mm (figuur 3A) om een willekeurige vezel assortiment 6 mm (Figuur 3D). De FFT geeft een kwantitatieve waarde voor de vezel uitlijning details over de kwantitatieve processen gedetailleerd hier ^19. Veze...

Discussie

Het meest cruciale onderdeel van het protocol is de generatie van de gradiëntscaffold. Het is essentieel dat de masker die de collector bedekt met een constante snelheid beweegt, zodat er een geleidelijke verandering is binnen het vezelscaffold. De juiste voorbereiding van de PCL-oplossing is ook belangrijk om het succes van het elektrospinnen te garanderen. Het is aan te raden de vezelmorfologie te controleren voor het elektrospinnen, vooral na de inkapsling van Coumarine-6, wat een hogere spanning kan vereisen om corre...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarine 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluoresceïne Diacetaat	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsine-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Gemodificeerd Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Aceton	Fisher Scientific	s25120a
Fosfaatbufferoplossing	Invitrogen	10010023
Glazen platen	VWR international, LLC	101412-842
Spuitpomp	Fisher Scientific	14-831-200	Enkele spuit
Ultrasoonreiniger	Branson	1510
Gelijkstroom-voeding met hoog voltage	Gamma High Voltage Research	ES30
Rasterelektronenmicroscoop	FEI	Nova 2300
Fluorescentiemicroscoop	Zeiss	Axio Imager 2