Afleiding van zeer gezuiverde Cardiomyocyten van Human geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van kleine moleculen gemoduleerd Differentiatie en Latere Glucose Verhongering

Samenvatting

Hier beschrijven we een robuust protocol voor de afstamming van menselijke cardiomyocyten dat klein molecuul-gemoduleerde cardiogene differentiatie combineert met glucosedeprivatie-gemedieerde zuivering van cardiomyocyten, waardoor het mogelijk wordt om gezuiverde cardiomyocyten te produceren voor het modelleren van hart- en vaatziekten en voor geneesmiddelenonderzoek.

Samenvatting

Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CMS) hebben een belangrijke bron van cellen aan het ontbreken van primaire cardiomyocyten beschikbaar voor fundamenteel onderzoek en translationeel toepassingen pakken geworden. Om hiPSCs naar cardiomyocyten onderscheiden, zijn verschillende protocollen, waaronder embryoid body (EB) gebaseerde differentiatie en groeifactor inductie ontwikkeld. Echter, deze protocollen zijn inefficiënt en zeer variabel in hun vermogen om gezuiverd cardiomyocyten genereren. Onlangs heeft een klein molecuul gebaseerd protocol gebruik te maken van modulatie van de Wnt / β-catenine signalering werd aangetoond dat cardiale differentiatie met een hoge efficiëntie te bevorderen. Met dit protocol, meer dan 50% -60% van de gedifferentieerde cellen waren troponine-positieve hartspiercellen werden consistent waargenomen. Voor een nog grotere zuiverheid cardiomyocyten werden de gedifferentieerde cellen blootgesteld aan glucose honger specifiek elimineren niet- cardiomyocyten gebaseerd op de metabolische verschils tussen cardiomyocyten en niet- cardiomyocyten. Met deze selectie strategie, we consequent een toename van meer dan 30% in een verhouding van hartspiercellen op niet- cardiomyocyten als een populatie van gedifferentieerde cellen verkregen. Deze zeer gezuiverde hartspiercellen moet de betrouwbaarheid van de resultaten uit menselijke iPSC-gebaseerde in vitro ziekte modelstudies en screeningstesten voor geneesmiddelen te verbeteren.

Inleiding

Primaire menselijke cardiomyocyten moeilijk te verkrijgen vanwege de vereiste invasieve cardiale biopsies moeilijk dissociëren tot enkele cellen, en vanwege de slechte lange termijn overleving van de cel in kweek. Gezien dit gebrek aan primaire menselijke hartspiercellen, patiënt-specifieke humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyte (iPSC-CM) technologie is beschouwd als een krachtig alternatief cardiomyocyte bron voor fundamenteel onderzoek, evenals klinisch en translationeel toepassingen zoals de ziekte van modellering en drugs discovery ^1. Vroege pogingen in differentiërende pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten toegepast differentiatie protocollen met embryo lichamen (EB's), maar deze methode is inefficiënt produceren cardiomyocyten omdat vaak minder dan 25% van de cellen in een EB zijn slaan cardiomyocyten ^2,3. Relatief, een monolaag gebaseerde differentiatie protocol met de cytokines activine A en BMP4 vertoonde een hoger rendement dan EBS, maarDit protocol is nog relatief inefficiënt, vereist kostbare groeifactoren en werkt alleen in een beperkt aantal humane pluripotente stamcellijnen ^4. Onlangs werd een zeer efficiënte, iPSC monolaag gebaseerde hartspierceldifferentiatie protocol ontwikkeld door moduleren Wnt / β-catenine signalering ^5. Deze iPSC-CM's te uiten troponine T en alpha actinine, twee sarcomeer eiwitten die standaard markers van hartspiercellen ⁶ zijn. Het protocol beschrijft hier is een aanpassing van deze kleine moleculen gebaseerde, feeder cel-vrij, monolaag differentiatie methode ^5,7. Wij zijn in staat om te verkrijgen verslaan hartspiercellen uit hiPSCs na 7-10 dagen (figuur 1). Overeenkomstig een hartspierceldifferentiatie resulteert in 50% verslaan cellen consistent immunokleuring blijkt dat er een populatie van niet- cardiomyocyten die negatief voor cardiomyocyt- specifieke merkers zoals cardiaal-specifieke troponine T en alfa-actinine zijn. Om further zuiveren cardiomyocyten en niet- cardiomyocyten elimineren, werden heterogene gedifferentieerde celpopulaties blootgesteld aan honger glucose door ze te behandelen met een extreem lage glucose kweekmedium voor meerdere dagen (figuur 2). Deze behandeling selectief kunnen de niet-cardiomyocyten wegens het vermogen van cardiomyocyten, maar geen niet-cardiomyocyten, lactaat als primaire energiebron metaboliseren om te overleven in een lage glucose omgeving ^8. Na deze zuiveringsstap wordt een 40% toename in de verhouding van hartspiercellen op niet- cardiomyocyten waargenomen (Figuur 3, Figuur 4) en deze cellen kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse genexpressie analyse, ziektemodel en screeningstesten voor geneesmiddelen.

Protocol

OPMERKING: Vendor informatie voor alle reagentia die in dit protocol is opgenomen in tabel 1 en Materialen List. Alle oplossingen en materialen in contact komen met cellen moeten steriel zijn en aseptische techniek moet dienovereenkomstig worden gebruikt. Voer alle incubaties cultuur in een bevochtigde 37 ° C, 5% _CO2 incubator tenzij anders vermeld. In dit protocol wordt elk verschil uitgevoerd in 6-well platen, waarbij de hiPSCs worden uitgezet. Volgende differentiatie en zuivering, kunnen cellen worden losgekoppeld en opnieuw uitgeplaat voor downstream gebruik.

1. Medium Bereiding

1. Voor het E8 medium, maak een voorraadoplossing per mediumbestanddeel _(NaHCO3, L-ascorbinezuur 2-fosfaat, natrium seleniet, transferrine, insuline, FGF2, TGFB1) en bewaar de oplossing bij -20 ° C. Voeg de juiste hoeveelheid voorraad oplossingen om de fles van DMEM / F12 en filteren om te steriliseren. De oplossing krachtvatie en reactie setup voor de voorraad onderdelen en E8 medium is te vinden in tabel 1.
2. Voor de extracellulaire matrix oplossing ontdooien de basaalmembraan matrix (gewoonlijk 10 mg / ml bijgeleverd) bij 4 ° CO / N. Matrigel wordt gebruikt voor pluripotente stamcellen kweek omdat de humane pluripotente stamcellen goed kan hechten aan dit materiaal met de alfa-6-beta-1 integrine ^9. Eenmaal ontdooid, maak 2.25 mg (250 ui) monsters op ijs met ijskoude pipetpunten en buisjes en bewaar het bij -80 ° C.
   1. Wanneer precoating platen met ECMS, ontdooien en aliquot de extracellulaire matrix-oplossing (ECMS) op ijs. Meng de ECMS en ijskoude DMEM / F12 medium in een verhouding van 1: 200 op ijs. Koel bewaren om voortijdige ECMS stolling te voorkomen.
3. Voor de RPMI / B27 zonder insuline medium, voeg 10 ml B27 Minus Insuline in 500 ml RPMI media.
4. Voor de RPMI / B27 (met insuline) medium, voeg 10 ml B27 supplement (met insulin) en 5 ml Pen-Strep antibioticum in 500 ml RPMI medium.
5. Voor de lage glucose medium, voeg 10 ml B27 supplement en 5 ml Pen-streptokokken antibiotica in 500 ml glucose vrij RPMI media.
6. Voor het bevriezen / cryopreservatie medium, meng foetaal runderserum met dimethylsulfoxide (DMSO) in een 9: 1 verhouding. Het invriesmedium kan maximaal 1 maand bij 4 ° C.
   Opmerking: Alle media moeten worden gefilterd en opgeslagen in 4 ° C en binnen 2 weken tenzij anders vermeld. Alle reagens / oplossing volumes hierna gebruikte bestemd voor een enkel putje in een 6-well plaat, tenzij anders vermeld.

2. Pre-coating 6-well platen met ECMS

1. Voeg ECMS door mengen basaalmembraan matrix (bv Matrigel) met ijs-koude DMEM / F12 medium in een verhouding van 1: 200, breng 2 ml vers bereide ECMS aan elk putje van een 6-wells plaat. Elk putje in een 6-wells plaat duurt ongeveer 90 mg ECMS ontvangen.
2. Incubeer de ECMS beklede platen gedurende 1 uur bij 37 ° C. Onmiddellijk voorafgaand aan uitplaten cellen zuig DMEM / F12 oplossing uit elk putje. De platen zullen dan klaar zijn om cellen te ontvangen.

3. Het ontdooien van de bevroren hiPSCs

OPMERKING: Nauw deze procedure volgen als het kan leiden tot een optimale kweken en downstream differentiatie van hiPSCs in iPSC-CM's na de vries / dooi cyclus.

1. Dooi een flacon van hiPSCs voor elk putje van een 6-wells plaat. Bereid een 15 ml conische buis met 9 ml koud E8 medium met ROCK-remmer (10 uM) voor elke flacon. ROCK-remmer verbetert hiPSCs overleving na cryopreservatie ^10. De injectieflacons van 37 ° C waterbad om de cellen ontdooien tot een ongeveer 5 mm diameter ijs kristal verlaten.
2. Spuit de buitenkant van de flesjes met 70% ethanol. Veeg de flesjes met tissue papier voordat ze te verplaatsen naar de steriele laminaire kap.
3. Breng de cellen in de voorbereide conische buis. Spoel thij eenmaal flesje met 500 pl E8 medium en breng het medium dat de cellen ontdooid op dezelfde conische buis. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 4 min bij 200 x g.
4. Zuig de supernatant na centrifugeren en voorzichtig resuspendeer de celpellet met 2 ml E8 medium met ROCK inhibitor (10 uM). Breng de geresuspendeerd cellen om één putje van een 6-wells plaat pre-gecoat met ECMS.
5. Vervang het medium met E8 medium zonder ROCK inhibitor na 24 uur kweken. De cellen moeten hebben gehandeld door deze tijd.

4. passage van de hiPSCs

1. Typisch passage hiPSCs na het bereiken van 75% -80% confluentie in een 6-wells plaat. Zuig het kweekmedium. Snel wassen putjes met 1 ml steriele PBS RT. Aspireren PBS.
   1. Voeg 500 ul 0,5 mM EDTA of 1x cel losraken oplossing (bijv Accutase) en incubeer gedurende 1-7 minuten bij kamertemperatuur. Geschikte tijd voor EDTA incubatietijd varieert met de iPSC lijn. Verwachten zichtbare krullen o zienr verdikking kolonies rond de randen, aangezien dit dat EDTA of cel losraken oplossing geeft gereed te verwijderen.
2. Zuig het EDTA of de cel onthechting oplossing. Voeg 1 ml E8 medium aangevuld met 10 uM ROCK inhibitor. Verdringen iPSC kolonies in de put door herhaaldelijk en neer te pipetteren en spuiten kolonies af met een P1000 pipet. Kolonies moet worden opgesplitst in 5-10 celklonten na afloop.
3. Breng de kolonies die zijn gesuspendeerd in 1 ml medium met E8 ROCK inhibitor in een 15 ml conische buis.
4. Verstoren van de grote cel klonten in kleine groepjes in de E8 medium. Voeg een geschikte hoeveelheid E8 media remmer aan de celsuspensie om de cellen te verdunnen. De media volume toevoegen verdunning afhankelijk van de celdichtheid en het aantal putten worden gezaaid. Idealiter zou een 80% confluente putje hiPSCs verdund 1:12.
   1. Voeg 11 ml E8 medium met ROCK-remmer op de bestaande 1 ml van cell oplossing in genoemde 15 ml conische buis met een 1:12 verdunning te verkrijgen.
5. Verder vermaal de cel klonten in kleine cel fragmenten (ongeveer 50-200 cellen in elk fragment is het beste). Voorkomen dat over-triturating als dit vermindert celoverleving.
6. Zuig ECMS uit de pre-gecoate platen en voeg 2 ml geresuspendeerd cellen in elk putje. Ongeveer 100.000 cellen per putje van een 6-wells plaat is ideaal. Doel om de cellen gelijkmatig doseren rond de put om clustering van cellen in het midden van de put te vermijden.
7. Na 24 uur kweken, vervang het medium met E8 medium zonder ROCK-remmer. Verander het kweekmedium elke 24 uur tot cellen 80% samenvloeiing. Vervolgens worden de cellen weer klaar voor passage. Het duurt meestal 3-6 dagen tussen passages tot 80% samenvloeiing bereiken.

5. Bevriezing hiPSCs

OPMERKING: Nauw deze procedure volgen als het kan leiden tot een optimale kweken en downstream differentiatie van hipSC's in iPSC-CM's na de vries / dooi cyclus.

1. Labelen cryogene buizen met de cellijn naam, het type cel, passage nummer, en invriezen datum. Als algemene richtlijn, gebruikt u een flesje voor elk putje van een 6-wells plaat. Bereid een 15 ml conische buis gevuld met 9 ml E8 medium met ROCK-remmer (10 uM). Bereid invriesmedium met 90% FBS en 10% DMSO, en houdt het bij 4 ° C tot gebruik.
2. Zuig het kweekmedium, voeg 500 ul 0,5 mM EDTA of 1x cel losraken oplossing en incubeer gedurende 2-7 minuten bij kamertemperatuur. De duur van de blootstelling EDTA of mobiele onthechting oplossing varieert van cellijn tot cellijn.
3. Aspireren EDTA of mobiele onthechting oplossing. Voeg 1 ml E8 medium.
4. Verdringen iPSC kolonies in de goed door en neer te pipetteren en spuiten kolonies af met een P1000 pipet. Kolonies mogen niet worden gebroken in kleinere dan 100 celklonten. Breng de geschorste cellen naar de voorbereide conische buis met E8. Centrifugeer bij RT gedurende 4 min bij 200 x g.
5. Zuig het supernatant en voeg 500 ul koud freezing medium om de pellet. Resuspendeer de pellet door pipetteren 1-2 keer. Celoverleving wordt verbeterd door hem cellen in grote massa.
6. Breng de geresuspendeerde cellen in een gemerkte cryogene buis. Bewegen snel de flesjes in een bevriezing container met isopropanol, die zal zorgen voor geleidelijke afkoeling. De container met cellen bij -80 ° C gedurende 24 uur, vervolgens over de cellen vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

6. Cardiale differentiatie van humane iPSC

OPMERKING: Alle media moeten op zijn minst bij RT wanneer toegevoegd.

1. Na dissociatie met EDTA of 1x cel onthechting oplossing, zaad ongeveer 100.000 menselijk iPSCs op ECMS gecoat 6 putjes voor differentiatie (dezelfde stappen als cel passage procedures). Wanneer de cellen te bereiken 85% samenvloeiing, veranderen de middellange tot RPMI / B27 zonder insuline medium met 6uM GSK3-beta-remmer CHIR99021 (CHIR) en te onderhouden voor 48 uur.
2. Na 48 uur, vervang de CHIR bevattende kweekmedium met RPMI / B27 zonder insuline medium en laat staan ​​voor 24 uur (tot dag 3).
3. Op dag 3, veranderen de media om RPMI / B27 zonder insuline met 5 uM Wnt-remmer IWR1 en onderhouden voor 48 uur (tot dag 5).
   OPMERKING: Wnt remming kan ook worden geprobeerd op andere kleine molecule verbindingen, zoals beschreven in eerdere studies ^11. IWR1 werd gekozen boven andere kleine molecule inhibitoren Wnt vanwege de toegenomen bereik waarin is aangetoond effectief in het remmen Wnt signalering ¹¹ zijn.
4. Op dag 5, verandert het medium terug naar RPMI / B27 zonder insuline medium en laat voor 48 uur (tot en met dag 7).
5. Op dag 7, vervang het medium met RPMI / B27 medium (met insuline) en vervang medium om de 3 dagen daarna met hetzelfde medium. Spontane kloppen van hartspiercellen moet eerst duidelijk zichtbaar zijn op ongeveer dag 8 tot dag10.

7. Zuivering van Human Cardiomyocytes door Glucose Verhongering

1. Op dag 10 na differentiatie, wijzigt het medium in elk putje van de 6-well plaat 2 ml lage glucose medium en de cellen behouden in dit medium gedurende 3 dagen (tot dag 13).
2. Op dag 13, terug cellen om RPMI / B27 medium (met insuline).
3. Eventueel replate cardiomyocyten vóór de tweede ronde van glucose honger te helpen los niet- cardiomyocyten van de kweekplaat, waardoor gemakkelijker dissociatie van niet- cardiomyocyten in glucose uithongering.
   1. Op dag 13, aspireren medium, eenmaal wassen met PBS, en dissociëren de cellen in enkele cellen met 500 ul cel dissociatie enzym gedurende 5 min bij 37 ° C. Specifiek, na 5 min enzym behandeling, gebruik 1.000 ul pipet handmatig cardiomyocyten van de 6-well plaat dissociëren door herhaaldelijk trekken de cel dissociatie enzym en sproeien tegen cardiomyocyte monolaag. Tot 30 pipetteren herhalingen kan worden verplicht om de hartspiercellen distantiëren in enkele cellen.
   2. Nadat cellen gedissocieerd en in eencellige vorm verzamel alle cellen in een 15 ml conische buis gevuld met 5 ml van RPMI / B27-medium met insuline verdund uit de cel dissociatie enzym en centrifugeer gedurende 4 min bij 200 x g. Zuig en gooi het supernatant.
   3. Resuspendeer de cellen met 2 ml RPMI / B27 medium en plaat op een nieuw ECMS-beklede 6-wells plaat. Typisch, hogere samenvloeiing van hartspiercellen helpt met celoverleving tijdens opnieuw platen. Streven naar 2 miljoen cellen per nieuwe 6-well schotel voor optimale overlevingskansen replate tijdens opnieuw platen.
4. Op dag 14, verandert het weer als 2 ml van laag glucose medium voor een tweede glucosedeprivatie cyclus. De cultuur van de cellen in deze laag glucose staat voor 3 dagen. De meeste niet-cardiomyocyten zal sterven in dit lage glucose kweekomstandigheid.
5. Op dag 17, veranderen de middellange tot 2 ml RPMI / B27 medium met insuline. De resterende cellen wordt sterk gezuiverde cardiomyocyten. Deze hartspiercellen kunnen worden gebruikt voor gen-expressie analyse, drug screening, metaboolanalyse en diverse andere stroomafwaarts assays.

Resultaten

De morfologische veranderingen tijdens iPSC differentiatie.

De iPSC gekweekt in voedingsvrije platen groeide als platte, tweedimensionale kolonies. Bij het ​​bereiken van ongeveer 85% samenvloeiing, werden hiPSCs behandeld met 6 uM CHIR voor differentiatie (figuur 1A). Aanzienlijke hoeveelheden van celdood, een normaal en veel voorkomend verschijnsel, werden waargenomen na 24 uur van CHIR behandeling. Na twee dagen van CHIR behandeling, de hiPSCs verder diff...

Discussie

Het verkrijgen van een grote hoeveelheid zeer zuivere-iPSC afgeleide cardiomyocyten cruciaal voor fundamenteel cardiale onderzoek als klinische en translationele toepassingen. Cardiale differentiatie protocollen enorme verbeteringen ondergaan in de afgelopen jaren, overgang van embryoid body gebaseerde werkwijzen die gebruik cardiogene groeifactoren ^2, sandwich werkwijzen ¹² matrix, en uiteindelijk naar kleine moleculen gemoduleerd en monolaag-gebaseerde methoden ^5. Van de bovengenoemde ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Matrigel (9-12 mg/ml)	BD Biosciences	354277
RPMI media	Invitrogen	11835055
Glucose free RPMI media	Invitrogen	11879-020
B27 Minus Insulin	Invitrogen	A1895601
B27 Supplement (w/ insulin)	Invitrogen	17504-044
Pen-strep antibiotic	Invitrogen	15140122
Fetal bovien serum	BenchMark	100-106
DMSO	Sigma	D-2650
ROCK inhibitor Y-27632	EMD Millipore	688000
CHIR99021	Thermo Fisher	508306
IWR1	Sigma	I0161
EDTA	Invitrogen	15575-020
Accutase	Millipore	SCR005
Cell lifter	Fisher	08-100-240
Cryovial	Fisher (NUNC tubes)	375418
TrypLE Select Enzyme	Invitrogen	12563-011