Synchronisatie van Caulobacter crescentus Voor Onderzoek van de bacteriële cel Cyclus

Samenvatting

Synchronisatie van bacteriële cellen is essentieel voor studies van de bacteriële celcyclus en ontwikkeling. Caulobacter crescentus kan worden gesynchroniseerd door middel van dichtheidscentrifugatie, wat een snelle en krachtige tool biedt voor studies van de bacteriële celcyclus. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de synchronisatie van Caulobacter-cellen.

Samenvatting

De celcyclus is belangrijk voor groei, genoomreplicatie en ontwikkeling in alle cellen. Bij bacteriën hebben studies van de celcyclus zich grotendeels gericht op niet-gesynchroniseerde cellen, waardoor het moeilijk wordt om de temporele gebeurtenissen die nodig zijn voor celcyclusprogressie, genoomreplicatie en deling te ordenen. Caulobacter crescentus biedt een uitstekend modelsysteem voor de bacteriële celcyclus waarbij cellen snel kunnen worden gesynchroniseerd in een G0-toestand door dichtheidscentrifugering. Experimenten met celcyclussynchronisatie zijn gebruikt om de moleculaire gebeurtenissen die chromosoomreplicatie en -segregatie regelen vast te stellen, om een genetisch regulatief netwerk te karteren dat de celcyclusprogressie regelt en om de totstandkoming van polaire signaalcomplexen te identificeren die nodig zijn voor asymmetrische celdeling. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de snelle synchronisatie van Caulobacter NA1000-cellen. Synchronisatie kan worden uitgevoerd in een grootschalige opzet voor genexpressieprofilering en western blot-assays, evenals in een kleinschalige opzet voor microscopie of FACS-assays. De snelle synchroniseerbaarheid en hoge celopbrengsten van Caulobacter maken dit organisme tot een krachtig modelsysteem voor studies van de bacteriële celcyclus.

Inleiding

De bacteriële celcyclus regelt zowel de replicatie van het genoom en de verdeling van dochtercellen. Belangrijker nog, zoals resistentie tegen antibiotica is een groeiende bedreiging voor de volksgezondheid, de bacteriële cel cyclus presenteert een onaangeboorde doelwit voor antibiotica ontwikkeling.

In de bacterie Caulobacter crescentus, elke celcyclus leidt tot een asymmetrische verdeling, waarbij twee dochtercellen van verschillende lot (figuur 1A) ^1,2. Een dochter cel erft een flagellum en is beweeglijk, terwijl de andere dochter erft een steel en is sessile. Een geïntegreerde genetische circuit controleert voortgang van de celcyclus en lot van de cel door gentranscriptieregulatie, fosfo-signalering, en gereguleerde proteolyse ^3. Bovendien chromosoom replicatie en gelijktijdige scheiding opbrengst dochtercellen die precies één kopie van het chromosoom ⁴ bevatten. Belangrijk is, kunnen deze twee celtypen snel worden gescheiden door colloidal silica deeltjesdichtheid centrifugatie in de synchroniseerbaar NA1000 stam ^07/05 waardoor de isolatie van de swarmer cellen van de rest van de populatie met hoge opbrengsten (Figuur 1B). Geïsoleerd swarmer cellen dan verder synchroon door asymmetrische celdeling. Hier hebben we detail het gebruikte protocol voor het synchroniseren van Caulobacter stam NA1000. Wij bieden protocollen en gemeenschappelijke tips voor probleemoplossing voor zowel groot- als kleinschalige synchronisaties. Deze experimentele procedure biedt een krachtig instrument om de spatiotemporele controle van de Caulobacter celcyclus en lot van de cel te ondervragen.

Protocol

1. Grootschalige Synchrony - Optimaal voor Western Blot, microarray / RNA-Seq, en ander materiaal Intensive Testen

1. Uit een vriezer voorraad of een bord, groeien een 5 ml O / N cultuur van stam NA1000 door schudden bij 28 ° C in PYE medium.
2. Inoculeer 0,5 ml van de cellen van stap 1 in 25 ml M2G (tabellen 1-2) en schud bij 28 ° C totdat de kweek een OD ₆₀₀ tussen 0,5 en 0,6 bereikt.
3. Te enten de cellen in 1 L van M2G en schudden bij 28 ° C.
4. Zodra OD ₆₀₀ bereikt 0,5-0,6, bevestigen de aanwezigheid van swarmer cellen met behulp van vloeibare gemonteerd fase microscopie. Spot 1 ui van cellen op een glasplaatje, dek af met een deksel slip, en het beeld van fase microscopie. Controleer de aanwezigheid van swarmer cellen door visualiseren zwemmen snel cellen in de populatie.
5. Spin cellen gedurende 15 min bij 7 kxg bij 4 ° C in een JA-10 rotor.
6. Verwijder het supernatant en voeg 180 ml koud M2 (tabellen 1-2) en voorzichtig resuspend alle cellen met behulp van een serologische pipet. Gooi losjes afgedraaid cellen; ze zijn predivisional en gestalkt cellen.
7. Voeg 60 ml koud Colloïdaal siliciumdioxide-oplossing (zorg ervoor dat de Colloïdaal siliciumdioxide schorsing meng goed voor het toevoegen aan de cellen) en meng de celsuspensie goed.
8. Giet de celsuspensie in acht 30 ml buizen en draaien gedurende 30 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor.
   OPMERKING: Men moet twee verschillende bands te zien; de swarmer band is de onderste band terwijl gestalkt / predivisional cellen zijn in de top-band (Figuur 1B).
9. Aspireren zorgvuldig de topband uit en verwijder de vloeistof tot ~ 1 cm boven de swarmer band (de onderste band).
10. (Kritiek) Met behulp van een Pasteur pipet, verwijder voorzichtig de swarmer band en plaats in een schone buis. Om wegspoelen de Colloidal silica, boven de buis met koud M2 en centrifugeren gedurende 10 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor.
11. Gooi de supernatant voorzichtig en resuspendeer decellen in 20 ml koude M2 ​​en centrifugeren gedurende 10 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor.
12. Resuspendeer de pellets in 30 ml koud M2 en meet de _OD600 met een spectrofotometer blanco met koud M2 medium. Opslaan 1 pl voor fase beeldvorming om te controleren op swarmer cellen; 90-95% van de cellen moet zwermers.
13. Spin down de cellen gedurende 5 min bij 6.4 kxg bij 4 ° C in een JA-20 rotor. Resuspendeer cellen in 28 ° C M2G medium zodat de A ₆₀₀ ~ 0,3-0,4 en beginnen schudden bij 28 ° C.
    OPMERKING: Typische opbrengsten zijn tussen de 30 en 60 ml van swarmer celcultuur van 1L van niet-gesynchroniseerde cellen.
14. Beginnen met het nemen tijdstippen (wild type cultuur zal ongeveer 135-140 minuten duren om te verdelen) ^8,9. Op elk tijdstip, het meten van de OD _600. Controleer of de OD ₆₀₀ na deling is ongeveer 2X de eerste OD _600.
15. Voor western blot of genexpressie testen, verwijder 1 ml porties van de culture op de gewenste tijdstippen, het afsluiten bij maximale snelheid in een tafelblad centrifuge gedurende 30 seconden, snel decanteren of zuig het medium en flash bevriezen de celpellet in vloeibare stikstof. Bewaar de cellen bij -80 ° C totdat stroomafwaarts analyse.

2. Kleinschalig Synchrony - Optimaal voor Microscopie

1. Uit een vriezer voorraad of een bord, groeien een 5 ml O / N cultuur schudden bij 28 ° C in M2G.
2. Verdunnen in 15 ml M2G (tabellen 1-2) en groeien tot mid-log (OD ₆₀₀ = 0,5-0,6).
3. Spin 6,4 kxg gedurende 10 min bij 4 ° C in een JA-20 rotor, en resuspendeer in 1 ml koude M2 ​​(Tabellen 1-2) overgebracht in een 2 ml microcentrifugebuis.
4. Spin op 15 kxg gedurende 3 min in een microcentrifugebuis om cellen pellet, zuig het supernatant, zet de pellet op ijs, en resuspendeer in 900 ul van koude M2.
5. Voeg 900 ul koud PVP beklede colloïdale silica en centrifugeren gedurende 20 min bij 15 kxg bij 4 ° C in een microfoonrocentrifuge buis.
6. (Kritiek) Zuig of een pipet uit de top gestalkt / predivisional cel band en het verzamelen van de bodem swarmer band in een nieuwe microcentrifugebuis.
7. Was de swarmer cellen tweemaal in 1 ml koude M2 ​​tijdens centrifugeren bij 15 kxg gedurende 3 min.
8. Voor het centrifugeren, zet de cellen in een voorgekoeld 1 ml glazen reageerbuis en meet de OD ₆₀₀ van de cellen in vergelijking met een blanco van M2.
9. Resuspendeer de laatste cel pellet in 28 ° C M2G bij een OD tussen 0,3-0,4 en schud / roll cellen bij 28 ° C.
   OPMERKING: Typische opbrengsten zijn tussen de 2 en 4 ml swarmer celkweek.
10. Voor microscopie experimenten op de gewenste tijdstippen plaats 1 ul van cellen op een M2G agarose pad voor beeldvorming.

Resultaten

Synchronisatie levert doorgaans twee banden van de cellen (Figuur 1B): het swarmer band, die een hogere dichtheid heeft, en een gestalkt / predivisional cel band van lagere dichtheid. Te zorgen voor een efficiënte synchronisatie gemeenschappelijke controles omvatten het toezicht op de OD ₆₀₀ en het meten van de niveaus van Ctra eiwit door western blot op verschillende celcyclus tijdstippen. De OD ₆₀₀ moet stijgen ongeveer 2-voudig tijdens de celcyclus (Figuur 2). D...

Discussie

De bacteriële celcyclus is een fundamenteel proces in het leven en is belangrijk voor de studie van groei en als doelwit voor antibiotica van de volgende generatie. Hier beschrijven we gedetailleerd de snelle synchronisatieprocedures voor C. crescentus NA1000, een modelorganisme voor de studie van de bacteriële celcyclus en asymmetrische celdeling. Deze methode is geschikt voor western blot, genexpressieprofilering en fluoresceringmicroscopie-assays om de ruimtelijk-temporele regulatie van de bacteriële celcyclu...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PVP Coated Colloidal Silica (Percoll)	Sigma-Aldrich	P4937
Colloidal Silica (Ludox AS-40)	Sigma-Aldrich	420840
JA10 Rotor	Beckman-Coulter	369687
JA20 Rotor	Beckman-Coulter	334831
Ferrous Sulfate Chelate Solution	Sigma-Aldrich	F0518
30 ml Centrifuge Tubes	Corning	8445
Na2HPO4	EMD	SX0720-1
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
NH4Cl	Amresco	0621-500g