Rechtop Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Samenvatting

De rechtopstaande beeldvormingsmethode die in dit protocol wordt beschreven, maakt de gedetailleerde visualisatie mogelijk van de polen van een zich ontwikkelend Drosophila melanogaster -ei. Deze uiteinden-op-weergave biedt een nieuw perspectief op de arrangementen en morfologieën van meerdere celtypen in het folliculaire epitheel.

Samenvatting

Drosophila melanogaster oogenese biedt een ideale context voor het bestuderen van verschillende ontwikkelingsprocessen omdat de eierstok relatief eenvoudig van architectuur is, goed gekarakteriseerd is en vatbaar is voor genetische analyse. Elke eicel bestaat uit kiemcellen omringd door een enkele epitheliale laag van somatische follikelcellen. Subsets van follikelcellen ondergaan differentiatie tijdens specifieke stadia om verschillende celtypen te worden. Standaardtechnieken laten voornamelijk een zijwaartse weergave van eicellen toe, en daarom een beperkt beeld van follikelcellen organisatie en identiteit. Het rechtopstaande beeldvormingsprotocol beschrijft een montagetechniek die een nieuwe, verticale weergave van eicellen mogelijk maakt met een standaard confocale microscoop. Samples worden eerst gemonteerd tussen twee lagen glycerine gel in een laterale (horizontale) positie op een glazen microscoopglas. De gel met ingebedde eicellen wordt vervolgens in blokken gesneden, overgebracht naar een dekglas en omgedraaid om eicellen rechtop te positioneren. Gemonteerde eicellen kunnen worden afgebeeld op een rechtopstaande of omgekeerde confocale microscoop. Deze techniek maakt de studie van follikelcellen specificatie, organisatie, moleculaire markers en eicontwikkeling mogelijk met nieuwe details en vanuit een nieuw perspectief.

Inleiding

Studie van Drosophila melanogaster heeft grote inzichten in de genetische regulatie van diverse verschijnselen. Met name is er uitgebreid onderzoek ei ontwikkeling, omdat oögenese biedt handelbaar manier om veel verschillende ontwikkelingsprocessen, waaronder weefsel patronen, cel polariteit, celcyclus schakelen en translationele regulering ^1,2,3,4 onderzoeken. Een belangrijke morfogene gebeurtenis tijdens oögenese is de specificatie verwerving van motiliteit en migratie van een set cellen genaamd grens cellen (beoordeeld in ^5). Aangezien celmigratie is een belangrijk kenmerk van dierlijke morfogenese en omdat de genetische regulatie van dit proces is goed geconserveerd mechanismen vastgesteld vliegen waarschijnlijk belangrijk in andere contexten zijn. Zo onderzoeken we de moleculaire controle van de grens cel migratie. Voor onze studies hebben we een nieuwe methode om de voorste polen ontwikkelen eieren observeren ontwikkeldwaar de grens cellen ontstaan, te onderzoeken hoe ze zich ontwikkelen in detail.

In de eierstok, ei kamers in verschillende ontwikkelingsstadia bestaan ​​langs ketens genaamd ovarioles, die zijn ingekapseld in een dunne omhulling (Figuur 1A). Elk ei kamer zal gaan om een ​​ei te vormen. Tijdens oögenese, moet een aantal verschillende celtypen te ontwikkelen op een gecoördineerde manier. De D. melanogaster ei kamer bestaat uit 16 kiembaan cellen, waaronder één eicel, omgeven door een single-layer folliculair epitheel ^6. Een klein aantal gespecialiseerde cellen, genaamd poolcellen, ontstaat op de voorste en achterste polen van het epitheel. De 6-8 grens cellen ontstaan ​​in de voorste epitheel van het ei kamer, veroorzaakt door de polaire cellen ^5,7. Medio oögenese (fase 9), de grens cellen los te maken van hun buren en migreren tussen de verpleegkundige cellen om de eicel te bereiken op de achterkant van het ei kamer ^5,7. Deze beweging moet worden bereiktterwijl de grens cellen blijven in een cluster rond twee niet-polaire beweeglijke cellen, waardoor dit een soort collectieve celmigratie. Succesvolle migratie van de grens celcluster zorgt voor een goede ontwikkeling van de micropyle van de eierschaal, die nodig is voor bevruchting.

De voorste polaire cellen instrueren grens lot van de cel door het activeren van een signaaltransductie cascade. Polar cellen scheiden een cytokine, Unpaired (UPD), dat bindt aan een transmembraan receptor, Domeless (DOME), op aangrenzende follikel cellen tijdens fase 8 van eicelontwikkeling ^8,9. De binding van UPD veroorzaakt Janus tyrosine kinase (JAK) tot fosforylering het Signal Transducer en Activator van de transcriptie (STAT) ^8,10,11. STAT dan naar de kern om transcriptie te activeren. Langzaam Border Cells (SLBO) is een transcriptiefactor die een directe transcriptionele doel van STAT en is ook vereist voor grens celmigratie ^12. Zijdelings uitzicht ei kamers geven thoed STAT activiteit wordt geregeld in een gradiënt over de voorste epitheel ^8,11,13. Follikelcellen dichtst bij de polaire cellen de hoogste niveaus van geactiveerde STAT aldus worden zij rand cellen en binnenvallen aangrenzende kiemlijn weefsel.

Om te begrijpen hoe de grens cellen worden gespecificeerd binnen en losmaken van het epitheel, moeten we om te zien hoe het weefsel wordt georganiseerd. Als we ei kamers bekijken vanuit een anterieure-on perspectief, zouden we radiale symmetrie van STAT activiteit verwachten in de follikel cellen rondom de polaire cellen. Een eindaanzicht ook beter verschillen van membraaneiwitten en cel-cel-interfaces tonen vóór en tijdens losmaken dan vergeleken cellen in verschillende beeldvlakken. Omdat ei kamers zijn langwerpig en aan elkaar steel cellen, zij regelen op objectglaasjes lateraal, waardoor het moeilijk om de voorste architectuur observeren. Zo veel informatie over de cellen bij de polen van de ei kamer heeftis afgeleid uit een zijdelings uitzicht. Hoewel sommige informatie kan worden verkregen via algoritmische 3-D reconstructies van optische secties, lichtverstrooiing, fotobleken, en de armere grenzen van de resolutie in de Z-as te maken van deze informatie minder gedetailleerd en betrouwbaar in de afwezigheid van dure technieken als super-resolutie microscopie ¹⁴ . Andere soorten doorsnede Beeldvormende (bijvoorbeeld elektronenmicroscopie of microtoom snijden) dat uitgebreide manipulatie van weefsels, zoals uitdroging, waardoor de kans op artefacten. Zo, een nieuwe methode om de afbeelding D. ontwikkelden we melanogaster ei kamers terwijl rechtop. Deze methode heeft zijn nut al bewezen in het ophelderen hoe beweeglijke cellen zijn gedoemd (zie Representatieve resultaten en Manning et al, onder review), en zal waarschijnlijk meer in het algemeen waardevol in studies van andere aspecten van oögenese zijn.

Protocol

1. Dissectie van Ovarioles

1. Breng ongeveer vijftien 2-4 dagen oude vrouwtjes en een paar mannetjes om een ​​frisse vlieg voedsel flacon met toegevoegde actieve droge gist. Gebruik katoen als een plug voor de flesjes, en voeg een paar druppels water aan de katoen om de luchtvochtigheid hoog te houden.
2. Plaats flacon in een 25 ° C incubator gedurende 14-16 uur bij podiummonitoren 8-10 ei kamers maximaliseren.
   OPMERKING: Incubatie varieert afhankelijk van de temperatuur en de gewenste fase.
3. Bereid dissectie media, 0,1M KPO ₄ en NP40 oplossingen als nodig is voor de volgende dag (zie Materials).
4. Verdoven de vliegen met _CO2 en onder een dissectie microscoop. Pipet enkele druppels dissectie media in elke holte in het glas depressie glijbaan.
5. Houd pincet in elke hand op een ongeveer 30 ° hoek met de tafelblad en oriënteren één vrouwelijke vliegen met de vleugels naar beneden. Met uw niet-dominante hand, pak je de vrouw met behulp van een tang, grijpen haar op de eennterior van de buik, in de buurt van de thorax, en dompel ze in de dissectie media in de depressie dia (Figuur 1A inzet).
6. Met de andere tang, pakt het exoskelet op de ventrale achterste van de buik en doorboren. Pak de eierstokken aan het achterste einde, en trek ze uit van de buik en plaats in het vers medium aan de andere kant van de depressie dia. (Figuur 1A inzet). Vermijd elkaar trekken van de darmen. Gooi het karkas.
7. Herhaal dit met de andere vrouwelijke vliegen totdat alle eierstokken worden ontleed. Gooi de mannetjes.
8. Met een pincet, bezit een eierstok aan het achterste uiteinde (dichtbij de grootste ei kamers), en met de andere hand te gebruiken pincethelften één van de meest voorste ei kamers (germarium) knijpen. (Figuur 1A).
9. Langzaam en gestaag, trek een ovariole ketting uit de eierstok schede. Blijven ovarioles individueel ontleden tot alle gewenste ei kamers zijn removed.
10. Herhaal stap 1,7-1,8 voor ontleed eierstokken.
11. Eenmaal voltooid, overdragen ovarioles naar een 0,6 ml buis met behulp van een plastic transferpipet.
12. Laat ovarioles naar de bodem van de buis, dan overgaan tot vaststelling en vlekken stappen.

2. Immunofluorescente (IF) kleuring van Ovarioles

1. Verwijder dissectie media voorzichtig uit ovarioles met een pipet. Zorg ervoor dat u geen ovarioles of ei kamers te verwijderen. Laat ongeveer 50 ul van ovarioles en dissectie media.
2. Voeg 50 ul van 16% paraformaldehyde 150 gl 0,1 M KPO ₄ buffer in een buis en voeg oplossing ei kamers ze op te lossen. Incubeer terwijl schommelen gedurende 10 min. LET OP: paraformaldehyde is giftig.
3. Verwijder fixatief en spoel tweemaal met 0,5 ml NP40 wasbuffer.
4. Was tweemaal gedurende 15 min elk bij kamertemperatuur.
5. Raadpleeg standaard IF-protocol ¹⁵ voor vervolgstappen.
   1. Kort na fixatie toevoegenprimaire antilichamen op geschikte verdunningen en geïncubeerd O / N bij 4 ° C. Was in NP40 meerdere malen, voeg dan secundaire antilichamen (1: 200 verdunningen).
   2. Was verscheidene malen in NP40, voeg DAPI (1: 1000) gedurende 10 min en herhaal wasbeurten. Zodra IF protocol is voltooid, voeg 200 pl 50% glycerol in PBS met ei kamers en laat zitten bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
   3. Verwijder oplossing, deze vervangen door 70% glycerol in PBS, en dek af met folie. Plaats monster bij 4 ᵒC tot klaar voor montage. Ondertussen, verder met stap 3.

3. Advance Voorbereiding van Glycerine Jelly Slides

1. Meet minstens 4 ml glycerine gelei met een spatel en vul een glazen celcultuur buis naar het halverwege merk. Smelt glycerine gelei in een waterbad bij 55 ° C gedurende 30 min.
2. Giet een kleine druppel glycerol, ongeveer 300 ul, uit de voorraad oplossing op twee objectglaasjes. Met een tissue, glycerol uitgespreid in een dunne layer over elk van de schuiven. Dit verschaft een basis en maakt gemakkelijke verwijdering van glycerine gelei in stap 5.6.
3. Snijd de tip van een gefilterde 1.000 III pipettip. Gebruik cut pipettip 1000-1500 pi warme glycerine gelei overdragen langzaam aan elke microscoop dia. Zorg om bellen te voorkomen.
4. Laat glycerine jelly dia zitten 5 minuten bij kamertemperatuur te stellen.
5. Plaats elke glycerine gelei dia in 60 mm × 15 mm petrischaal en afdekken met folie. Plaats bij 4 ° CO / N. Eventueel opslag glycerine jelly dia tot 5 dagen bij 4 ° C.

4. Montage Egg Chambers

1. Met behulp van monsters uit stap 2.5, pipet meerdere 3 pl druppels ei kamers in 70% glycerol aan weerszijden van een glycerine gelei glijbaan. Doorgaan pipetteren 3 pl druppels totdat alle ei kamers zijn op deze dia. Zorg ervoor dat elke druppel bevat ten minste tien ei kamers. Verhit ondertussen een cultuur buis van glycerine gelei in een 55 ° C waterbad.
2. Plaats de glycerine gelei dia met ei kamers onder een dissectie microscoop. Stel vergroting zodat slechts één druppel ei kamers in het gezichtsveld (figuur 1B).
3. Met behulp van een 30 gauge naald als een lepel, pak je de gewenste stadium ei kamer. Indien nodig, aparte gewenste ei kamers van een ovariole keten met de naald als een mes.
4. Om vuil die kunnen interfereren met de beeldvorming te voorkomen, brengt u de ei kamer op de tweede glycerine gelei glijbaan, met de voorste naar links kijkt (figuur 1E -1). Herhaal dit tot er minstens zeven ei kamers opgesteld in een kolom (figuur 1C).
5. Vorm nieuwe kolommen van zeven tot alle gewenste ei kamers worden overgedragen naar de tweede glycerine gelei dia.
6. Scheur een klein stukje weefsel en twist. Gebruik dit om het overtollige PBS-glycerol absorberen uit het ei kamers door lichtjes aanraken van elk een. Zorg ervoor dat geen ei kamers te verwijderen.
7. Snijd detip van een gefilterde 200 ul pipetpunt. Gebruik dit om 150 ul overdragen van glycerine gelei om alle kolommen van ei kamers te dekken.
   OPMERKING: De hoeveelheid glycerine gelei nodig kolommen dekken is gebaseerd op ei kamer fasen en het aantal kolommen. Bedrag kan worden aangepast.
8. Laat gemonteerd ei kamers zitten gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur totdat de bovenste laag van glycerol gelei volledig gestold (figuur 1D).
9. Plaats dia van gemonteerde ei kamers in een 60 mm × 15 mm petrischaal en afdekken met folie. Bewaren bij 4 ° CO / N om de glycerine gelei lagen samen te stollen (plaats in het donker als er bezorgdheid over fotobleking).

5. Voorbereiding van Egg Chambers for Imaging

1. Plaats dia van gemonteerde ei kamers onder een dissectie microscoop. Stel vergroting zodat slechts één kolom ei kamers in het gezichtsveld.
2. Met behulp van een hoek van 45 ° miniatuur scalpel, snijd een straight lijn langs de rechterkant van de eerste kolom van ei kamers (dicht bij de achterste zijde van het ei kamers). (Figuur 1D-E)
3. Vervolgens bezuiniging de eerste ei kamer boven en onder de laatste ei kamer in de kolom. Op dit punt de kolom ei kamers aan drie zijden worden afgesneden.
4. Met een microknife, doorsnede is langs de linkerkant van de kolom zo dicht mogelijk bij de voorste kant van het ei kamers (figuur 1E -3).
5. Pipet 100 ul koud 1X PBT over de kolom cut.
6. Gebruik een ronde randen spatel om de overtollige glycerine gelei rond drie zijden van de snede kolom van ei kamers en gooi te verwijderen, en de rest op de dia.
7. Plaats de spatel in de snede gemaakt aan de anterieure zijde van ei kamers en scheiden de kolom uit de primaire glycerine gelei blok.
8. Bereiden monsters voor een van beide omgekeerd (5.8.1) of rechtop (5.8.2) microscopie.
   1. Voor omgekeerde microscoop: Transfer tHij kolom van ei kamers om een ​​dekglaasje met anterieure zijde van ei kamers naar beneden. Herhaal stap 5,2-5,8 totdat alle kolommen glycerine gelei verwijderd en gemonteerd. Voeg een paar druppels van 50% PBS-Glycerol op elk blok van ei kamers om te voorkomen dat ze uitdrogen. Afbeelding ei kamers direct aan het dekglaasje.
   2. Voor Upright Microscoop: Breng de kolom van ei kamers om een ​​microscoop dia met de anterieure zijde naar boven. Herhaal de stappen 5,2-5,9 totdat alle kolommen van glycerine gelei zijn verwijderd en gemonteerd op de microscoop dia's. Voeg een paar druppels van 50% PBS-Glycerol op elk blok van ei kamers en deksel blokken met een # 1 ½ dekglaasje.

Resultaten

De opstaande beeldvormingswerkwijze konden we direct de organisatie van cellen in de voorste folliculaire epithelium zien in stap 8. een algemene merker voor follikel lot van de cel, de ogen Afwezig (EYA) proteïne, alsmede de nucleaire DNA merker DAPI vertoonde zelfs expressie in dit gebied van cellen, en dat voor alle cellen konden worden waargenomen met gelijke kleuring intensiteit (Figuur 2B "). Eiwitten geregeld in reactie op de cytokine UPD toonde echter variabele patronen en expressieniveaus....

Discussie

Hier wordt een methode beschrijven we te monteren en het imago kleine, ontwikkelen ei kamers van een end-on perspectief. Gemeenschappelijke technieken voor beeldvorming ei kamers zijn geoptimaliseerd voor een zijdelings uitzicht en in de eerste plaats maken een nauwkeurige visualisatie van medio-laterale follikel cellen na kleuring met fluorescerende antilichamen. Het gebruik van Z-stacks of 3-D reconstructies helpt bij het ​​bekijken van meerdere focale vlakken, maar is nog steeds onvoldoende voor subcellulaire resolut...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer)			Voeg 3,1 g van NaH2PO4•H2O en 10,9 g van Na2HPO4 (watervrij) toe aan gedestilleerd H2O om een volume van 1 L te maken. De pH van de uiteindelijke oplossing zal 7,4 zijn. Deze buffer kan tot 1 maand worden bewaard bij 4°C.
16% Paraformaldehyde waterige oplossing, EM-kwaliteit	Electron Microscopy Sciences	15710	methanolvrij om GFP-fluorescentie te behouden
30G x 1/2 inch naald	VWR	BD305106	Regelmatige snede
Actieve Drooggist	Genesee Scientific	62-103	Om vrouwelijke vliegen te vetten
Bovine Serum Albumine	PAA-celkweekbedrijf	A15-701	Gebruikt in NP40 Wash Buffer
Dumont #5 Pincet	Fine Science Tools	11295-10	Dumostar-legering, biologiepunt; scherpe punten zijn essentieel voor ovariolen dissectie
DAPI (4′,6-Diamidino-2-fenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich	D9542	5 mg/ml stockoplossing
Fetaal bovien serum (FBS)	Life Technologies	16140-071	Toegevoegd om dissectiemedium aan te vullen (10%)
Glas kweekbuisje	VWR	47729-576	14 ml
Glas Depression Slides	VWR	470019-020	1,2 mm dik, dubbele holte
Glycerin Jelly	Electron Microsocpy Sciences	17998-10	Montagemedium
Glycerol	IBI Scientific	IB15760	70% in PBS
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I3021-500ML	(uitwisselbaar voor Nonidet P-40) Gebruik in NP40 Wash Buffer
Leica Fluorescent Stereoscoop	Leica Microsystems
Leica SP5 Confocale Microscoop	Leica Microsystems		40x/0.55NA droge objectief
Micro spatel	VWR	82027-518	Roestvrij staal
Microscoopglas	VWR	16004-368	75x25x1 mm
NP40 Wash Buffer			50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Ipegal, 1 mg/ml BSA en 0,02% natriumaziet
Penicilline-Streptomycine-Glutamine	Life Technologies	10378-016	Toegevoegd om dissectiemedium aan te vullen (0,6X)
Petrischaal- Polysterine, steriel	VWR	82050-548	60 B x 15 H mm
Fosfaatbufferzoutoplossing	Sigma Aldrich	P3813-10PAK	10 verpakkingen Poeder
Kaliumfosfaat dibasisch	Sigma Aldrich	P3786-500G	Gebruikt in 0,1 M KPO4 Buffer
Kaliumfosfaat monobasisch	Sigma Aldrich	P9791-500G	Gebruikt in 0,1 M KPO4 Buffer
[header]
Schneider's Insect Medium	Life Technologies	11720018	Met L-glutamine en natriumbicarbonaat
Natriumaziet	Sigma Aldrich	S2002-25G	Gebruikt in fluorescente antilichaamkleuring
Natriumchloride	Sigma Aldrich	S3014-500G	Gebruikt in NP40 Wash Buffer
TRIS-HCl	IBI Scientific	IB70144	1 M TRIS-HCl, pH 7,4
Volocity 3D Image Analysis Software	PerkinElmer		Voor het verwerken van confocale Z-stacks