De rat, door zijn omvang, de beschikbaarheid en vrij volgzaam gedrag, is gebruikt als een onderzoeksmodel voor vele jaren. Het doel van dit protocol is om de rat als een ischemische huid wondgenezing model te gebruiken om waardevolle inzichten in de pathofysiologie van chronische wonden te bieden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Demonstratie van de Rat ischemische Skin wondmodel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De neiging voor chronische wonden bij mensen toe met veroudering, ziektetoestanden zoals diabetes en verminderde cardiovasculaire functie en unrelieved druk als gevolg van immobiliteit. Diermodellen zijn ontwikkeld die trachten deze voorwaarden bootsen met het doel een beter inzicht in de complexiteit van chronische wonden. Het hier beschreven model is een rat ischemische huidflap model dat een langdurige vermindering van de bloedstroom wat resulteert in wonden die ischemische geworden en lijken op een chronische wond fenotype (verminderde doorbloeding, verhoogde ontsteking en vertraagde wondsluiting) toelaat. Het bestaat uit een bipedicled dorsale flap met 2 ischemische wonden centraal geplaatste en 2 niet-ischemische wonden lateraal van de flap als controles. Een nieuwe Daarnaast ischemische huidflap model is de plaatsing van een silicone vel onder de klep die functioneert als een barrière en een spalk te revascularisatie voorkoming en vermindering contractie als wonden. Ondanks debehandeling van ratten met wondgenezing studies vanwege hun zeer verschillende anatomische en fysiologische verschillen met de mens (dwz de aanwezigheid van een panniculus carnosus spier, korte levensduur, toegenomen aantal haarzakjes en hun vermogen om geïnfecteerde wonden) de wijzigingen die werkzaam zijn in dit model maakt het een waardevol alternatief voor de eerder ontwikkelde ischemische huidflap modellen.
Inleiding
Effectieve ontwikkeling van geneesmiddelen en andere wondgenezing geneeswijze adequaat in-vivo-modellen vereisen, ondanks de gekende problemen bij het vertalen van bevindingen in diermodellen voor de menselijke therapieën 1. Wat volgt is een beschrijving van een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een rat model van ischemisch huid wondgenezing mechanismen die verder het begrip van pathologische wondgenezing onderzoeken. De rat species, vaak toegepast vanwege de brede beschikbaarheid, omvang en onderdanige natuur wordt gebruikt voor wondgenezing studies is groot genoeg om een geschikte huid voor incisie en excisie verwonding beeldvorming en weefselverzameling 2 verschaffen. Toch moet zorgvuldig in overweging dat de huid van een rat en mens verschillend anatomisch genomen, ratten aangeduid als losse huid dieren. Dit duidelijk kenmerk zorgt voor wondcontractie, in plaats van epithelialisatie belangrijke bijdrage leveren aan het sluiten van de huid rat wounds 2. Daarnaast is de aanwezigheid van een subcutane panniculus carnosus spier in ratten bij aan heling zowel contractie en collageenvorming 3,4. Deze zeer belangrijke anatomische verschillen werden gezien in de ontwikkeling van de rat ischemische huidwond model en specifieke modificaties werden uitgevoerd om wondcontractie verminderen en de invloed van de panniculus carnosus spier 5 verminderen.
In diabetische voet ulcera, veneuze ulcera en decubitus, wordt de genezing vertraagd en deze wonden zijn chronische beschouwd. De wonden worden gekenmerkt door overmatige ontsteking, die de wond voorkomt doorgaat naar de volgende fasen van wondheling 6. Een van de belangrijkste factoren in de ontwikkeling van een chronische wond gelokaliseerde weefsel ischemie (verminderde bloedtoevoer) 5 bijdragen tot het onvermogen om ontsteking te wissen. Op de tijd dat dit model werd ontwikkeld en gevalideerd (in 2003-4), Waren er geen gestandaardiseerde diermodellen die voldoende weefsel inductie van angiogenese testen in het wondbed, een belangrijke stap bij normale wondgenezing en de motivatie voor het ontwikkelen van dit model 5 invoert. Dat gezegd, de hier gepresenteerde model is een modificatie van de ischemische wond model oorspronkelijk beschreven door Schwartz et al. 7 en vervolgens gebruikt in gewijzigde vorm door Chen et al. 8
In de aangepaste ischemische wond model, zijn wijzigingen aangebracht in de hierboven genoemde anatomische kenmerken van de rat die leiden tot genezing door krimp in plaats van epitheelvorming omzeilen: (1) Twee volledige dikte excisional wonden worden gecreëerd binnen een bipedicled dorsale huid klep en de panniculus carnosus spier wordt verwijderd uit het wondbed door ontleden boven de spierfascia. (2) De flap zelf smaller dimensies, zodat bloedtoevoer is willekeurig en de wonden bij het midden van thij flap zijn ischemisch. (3) Een silicone vel onder de klep geplaatst, waardoor readherence en reperfusie van de flap van onderliggende weefsel. Wondcontractie is beperkt (niet geëlimineerd) door verankeren of het hechten van de flap aan de siliconen blad 5.
Het model is onlangs gebruikt in studies variëren van hyperbare zuurstof gevolgen ischemische wondgenezing 9,10 ischemische wondgenezing bij jonge versus oude ratten 11 en heeft bewezen een betrouwbaar model voor langdurige weefsel ischemie. De afmetingen van de bipedicled flap zijn ook aangepast aan verschillende rattenstammen, waaronder Sprague Dawley (11 cm lang en 2 cm breed) en F344 ratten (10,5 cm lang en 3,0-3,5 cm) en andere species, zoals varkens 12 en muizen 13,14. Deze video maakt gebruik van de F344 inteelt rattenstam aan de demonstratie van de ischemische huid wond model.
Goedkeuring voor alle procedures waarbij dieren worden hieronder gepresenteerd was te verkrijgened van de Universiteit van Animal Care Committee van Zuid-Florida (IACUC) en zich houden aan alle eisen van de Animal Welfare Act en de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Goedkeuring voor procedures waarbij dieren worden hieronder gepresenteerd werd verkregen van de Universiteit van Animal Care Committee van Zuid-Florida (IACUC) en zich houden aan alle eisen van de Animal Welfare Act en de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren.
1. Voorbereiding van het Silicone Sheets en chirurgische instrumenten
- Voorgesneden strips (10,5 cm x 3,0 cm) van niet-versterkte 0,01 dikte, medische kwaliteit siliconen lakens en steriliseren met behulp van een autoclaaf.
- Reinigen en steriliseren geschikte chirurgische instrumenten (schaar, pincet en gordijnen of handdoeken op een steriel veld te creëren tijdens de operatie).
2. Proefdieren
- Gebruik volwassen mannelijke of vrouwelijke ratten met een gewicht binnen het bereik 250-350 g verkregen van een commerciële kweker. Als oude ratten worden gebruikt, moeten zij ≥350 g om betere overleving postoperatieve waarborgen. Vóór het begin van een experiment acclimatiseren alle dieren ten minste7 dagen onder standaard condities van een 12 uur licht-donker cyclus met voedsel en water ad libitum.
3. Anesthesie, Pre-operatieve analgesie en Operative Voorbereiding
- Induceren algemene verdoving met behulp van isofluraan op 3% -4% via een inductie kamer en met O 2 tijdens de voorbereiding van de huid en chirurgie behouden (via het gebruik van een neuskegel) bij 1% -2%. Bewaken van de diepte van de anesthesie door waarneming van de snelheid en diepte van de ademhaling, interdigitale snuifje of palpebrale knipperreflex.
OPMERKING: Op dit moment kan een dierenarts zalf op de ogen worden geplaatst droogheid voorkomen terwijl het dier onder narcose. - Op een locatie op afstand van de steriele chirurgische gebied, plaatst de rat in buikligging en scheren het dorsale gedeelte met tondeuse uit de basis van de nek naar beneden ongeveer 11 cm. Stencil met een permanent marker, de schets voor de 3,0 cm x 10,5 cm flap (zie figuur 1A).
- Verplaats de rat aan een schone, aangewezen surgical ruimte die is uitgerust met een goedgekeurde verwarming pad en steriele chirurgische gordijnen of handdoeken. Injecteer 5 mg / kg subcutaan Ketoprofen vóór de eerste chirurgische incisies voor pijnbestrijding. Bijkomende vloeistoffen (zoutoplossing) worden gegeven (tot 5 cc) subcutaan als nodig.
- Bereid de huid verder door eerst zwabberen met 70% isopropylalcohol en tweede plaats met 0,2% chloorhexidine, dan steriele doeken van toepassing op een steriel veld te creëren. 10% povidonjood (Betadine) kunnen ook worden gebruikt.
Opmerking: Een antibioticum (ampicilline bij 15 mg / kg) kan subcutaan worden toegediend, maar als goede aseptische technieken worden gebruikt niet noodzakelijk.
4. Het creëren Excisional Wonden en Bipedicled Flap
- Met behulp van een steriele wegwerpspuit 6 mm biopsie ponsgereedschap Maak twee cirkelvormige "ischemische" wonden in het midden van de aangewezen flap gebied (Figuur 1B). De diepte van de wond worden vastgesteld om (niet via) de onderliggende fascia van de panniculus Carno zijnsus spier (figuur 1B inzet).
- Behulp van een tang heffen de huid in het midden van de wond omtrek door de incisiebiopsie en vervolgens irisschaar (met gebogen uiteinden) om de cirkelvormige stuk weefsel (waaronder panniculus carnosus spier) te snijden. Het resultaat is een volle dikte gewikkeld met de fascia als de basis van de wond.
Opmerking: Het uitgesneden weefsel (wond pluggen) worden snel bevroren in vloeibare stikstof of in 10% gebufferde formaline O / N voor latere verwerking als controle, normale huid vast. - Een bipedicled flap door insnijdingen met een steriele scalpel aan weerszijden van de ischemische wonden langs de pre-getekende lijnen (figuur 1C) die 10,5 cm lang en 3,0 cm van elkaar zijn. De diepte van de insnijdingen worden vastgesteld om de paraspinous spieren. Met behulp van iris schaar, scheiden de panniculus carnosus fascia van de paraspinous spieren, let daarbij goed op de fascia intact als de "basis" van de 6 mm stoten te houden (Figure 1D).
- Neem 1 steriele voorgesneden siliconen blad en plaats het in tussen de panniculus carnosus fascia en de paraspinous spieren (figuur 1E) ervoor te zorgen dat de plaat niet omkrullen of folden. Met zwart, niet-absorbeerbare hechtdraden (grootte 4,0) sluit beide insnijdingen verankerd het silicone blad aan de huid met minstens 8 onderbroken steken aan weerszijden langs de lengte van de flap (Figuur 1F en 1G).
- Met behulp van een steriele, wegwerpbare biopsie ponsgereedschap Maak twee interne controle "niet-ischemische" wonden (naar de voorste fascia van de panniculus carnosus spier) 1 cm lateraal van de ischemische wonden aan weerszijden van de klep (figuur 1G).
- Plaats een liniaal onder de wonden en digitale foto's nemen voor wond meting doeleinden (zie figuur 3A). Op dit moment kan doorbloeding (perfusie) te controleren met behulp van laser-Doppler of andere manipulaties (plaatselijk geneesmiddel plaatsing) uitgevoerd.
- Toepassing van een goedgekeurde vloeibare lijm zowel craniaal en caudaal van de wonden en een transparante film het wondje milieu vochtig en schoon (steriel) te houden. Een extra vulling worden geplaatst aan het caudale einde van de flap om te voorkomen dat het dier verwijderen van de meest caudale hechtingen.
5. Post-operatieve procedures
- Plaats dieren in kooien (afzonderlijk gehuisvest) voorzien ondiepe feeders om te voorkomen dat het chirurgisch schuren tegen de feeder. De dieren mogen niet onbeheerd worden achtergelaten of teruggegeven aan het gezelschap van andere dieren, totdat zij weer voldoende bewustzijn te borstligging onderhouden en vertonen doelgerichte beweging. Verwarmingsmatten moet de helft van de kooi tot 2 dagen gedurende herstel worden geplaatst.
- Pijn na operatie beheerder toedienen ketoprofen (5 mg / kg) subcutaan dieren de volgende ochtend en 1x per dag gedurende maximaal 48 uur na de operatie. De dieren moeten ook dagelijks worden gecontroleerd oplangdurige tekenen van pijn, gewichtsverlies of postoperatieve wondinfecties.
6. Latere Wond Metingen en verbandwisselingen
- Meet ischemische en niet-ischemische wonden vaak onder algemene verdoving met behulp van isofluraan op 3% -4% via een inductie kamer en onderhouden (via een neuskegel) bij 1% -2% met O 2 als in stap 3.1.
- Verwijder het verband voorzichtig om de lijm uit de huid niet trekken. Op dit moment extra digitale foto's zijn genomen voor wond metingen, actuele behandelingen opnieuw aangebracht, laser Doppler imaging (LDI) of andere manipulaties uitgevoerd aan de behoeften van de onderzoeker aan te passen.
- Breng de lijm en een schone dressing en laat het dier om te herstellen als in stap 5.1.
7. Wond Collection en euthanasie
- Oogst ischemische en niet-ischemische wonden (op dagen de onderzoeker passend acht), terwijl het dier onder narcose met behulp van isofluraan op 3% -4% via een induction kamer en onderhouden (via een neuskegel) 1% -2% met O2 als in stap 3.1.
- Met een scalpel een vierkante uitsnijding rond de wond wat gezonde weefsel rond de wond omvat. Plaats de excisie in een 1,5 ml snap cap buis en snap bevriezen in vloeibare stikstof (bewaar bij -80 ° C) voor toekomstige moleculaire analyse of incuberen in 10% gebufferde formaline O / N bij KT histologische verwerking.
OPMERKING: De wond excisies kan ook worden gehalveerd om meer monsters voor analyse. - Na wondweefsel verwijdering, euthanaseren het dier met behulp van de goedgekeurde methode van CO 2 inademing.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De rat ischemische wondgenezing model protocol moet ongeveer 20 min per dier nemen als efficiënt uitgevoerd. Voorafgaande aan het aanbrengen van een dressing het model moet verschijnen zoals weergegeven in figuur 1G. Het zal belangrijk zijn om te controleren of de bipedicled flap en wonden daarin zijn ischemisch. Subcutane zuurstofspanning (PscO 2) ter hoogte van de wonden werd tijdens de validatie van dit model 5 gemeten door een polarografische elektrode in het subcutane weefsel ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wondgenezing bij ratten is vaak het onderwerp van discussie vanwege hun vermogen om geïnfecteerde wonden en een hoge mate van interanimal 5 variabiliteit genezen. Eén van de oorspronkelijke doelstellingen van de verworven in de ontwikkeling is deze variatie te verminderen. Wijzigingen in de breedte van de klep, waardoor het aantal wonden specifieke plaatsing (gecentreerd op de flap consistente cranio-caudale locatie) en invoering van een siliconenplaat dit doel bereikt. Wondgenezing door contractie is o...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag de steun van de University of South Florida, Department of Surgery (Mack Wu, MD, PhD) erkennen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Sil-Tec medische kwaliteit plaatwerk | Technical Products Inc. | 500-3 | niet-versterkt, 0,01 inch dik |
| Mini Iris schaar, 8 cm, gebogen, SS | World Precision Instruments | #503671 | |
| Ethilon Nylon Hechndraden | Ethicon | 1964G | zwart, maat 4,0, PC-3 16 mm naalden (3/8 cirkel) |
| Laser Doppler Imager | Moor Instruments | moorLDI2-IR | Standaard bloedstroom imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8 |
| ImageJ | NIH | gratis download | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
| Mastisol | Henry Schein | Cat # 7289210 | Fisher Scientific NC9774929 |
| Tegaderm | Medical Specialties | 3M1624W | Fisher Scientific NC9922128 |
Referenties
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it. Experimental dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).
- Dorsett-Martin, W. A. Rat models of skin wound healing: a review. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 12 (6), 591-599 (2003).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290 (S1-11), (1998).
- Finn, G., Magnus, S. A., Tonny, K. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue). Wound Repair and Regeneration. 8, (2000).
- Gould, L. J., Leong, M., Sonstein, J., Wilson, S. Optimization and validation of an ischemic wound model. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 13 (6), 576-582 (2004).
- Loots, M. A., et al. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. The Journal of investigative dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
- Schwartz, D. A., Lindblad, W. J., Rees, R. R. Altered collagen metabolism and delayed healing in a novel model of ischemic wounds. Wound Repair Regen. 3 (2), 204-212 (1995).
- Chen, C., et al. Molecular and mechanistic validation of delayed healing rat wounds as a model for human chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 7, (1999).
- Zhang, Q., Chang, Q., Cox, R. A., Gong, X., Gould, L. J. Hyperbaric oxygen attenuates apoptosis and decreases inflammation in an ischemic wound model. The Journal of investigative dermatology. 128 (8), 2102-2112 (2008).
- Zhang, Q., Gould, L. J. Hyperbaric oxygen reduces matrix metalloproteinases in ischemic wounds through a redox-dependent mechanism. The Journal of investigative dermatology. 134 (1), 237-246 (2013).
- Moor, A. N., et al. Consequences of age on ischemic wound healing in rats: altered antioxidant activity and delayed wound closure. Age (Dordrecht, Netherlands). 36 (2), 733-748 (2014).
- Roy, S., et al. Characterization of a preclinical model of chronic ischemic wound). Physiological genomics. 37 (3), 211-224 (2009).
- Biswas, S., et al. Hypoxia inducible microRNA 210 attenuates keratinocyte proliferation and impairs closure in a murine model of ischemic wounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6976-6981 (2010).
- Winocour, S., Vorstenbosch, J., Trzeciak, A., Lessard, L., Philip, A. CD109, a novel TGF-beta antagonist, decreases fibrotic responses in a hypoxic wound model. Exp Dermatol. 23 (7), 475-479 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
