Een eenvoudige en goedkope methode voor het bepalen Koude Gevoeligheid en aanpassing in Muizen

Summary

De Cold Plantar Assay (CPA) meet de koudsensitiviteit tussen 30 °C en 5 °C en kan ook koudaanpassing meten. Dit protocol beschrijft hoe de CPA te gebruiken om koudgevoeligheid, analgesie en aanpassing bij muizen te meten.

Abstract

Koude overgevoeligheid is een ernstig klinisch probleem dat een brede groep patiënten treft en een aanzienlijke afname van de kwaliteit van leven veroorzaakt. De koude plantar assay maakt de objectieve en goedkope beoordeling van koudegevoeligheid bij muizen mogelijk en kan zowel analgesie als overgevoeligheid kwantificeren. Muizen worden geacclimatiseerd op een glazen plaat, en een gecomprimeerde droogijskorrel wordt tegen het glazen oppervlak onder de achterpoot gehouden. De latentie tot terugtrekking van het koelende glas wordt gebruikt als een maatstaf voor koudegevoeligheid.

Koud gevoel is ook belangrijk voor overleven in regio's met seizoensgebonden temperatuurverschillen, en om gevoeligheid te behouden, moeten dieren hun thermische responsdrempels kunnen aanpassen aan de omgevingstemperatuur. De Cold Plantar Assay (CPA) maakt ook de studie van aanpassing aan veranderingen in omgevingstemperatuur mogelijk door de koudegevoeligheid van muizen te testen bij temperaturen variërend van 30 °C tot 5 °C. Muizen worden geacclimatiseerd zoals hierboven beschreven, maar de glazen plaat wordt afgekoeld tot de gewenste starttemperatuur met behulp van aluminium dozen (of aluminiumfolie zakjes) gevuld met heet water, nat ijs of droog ijs. De temperatuur van de plaat wordt in het centrum gemeten met een T-type thermokoppelsondev. Zodra de plaat de gewenste starttemperatuur heeft bereikt, worden de dieren getest zoals hierboven beschreven.

Deze assay maakt het mogelijk om muizen te testen bij temperaturen variërend van onschadelijk tot pijnlijk. De CPA levert ondubbelzinnige en consistente gedragsreacties op bij niet-gewonde muizen en kan worden gebruikt om zowel overgevoeligheid als analgesie te kwantificeren. Dit protocol beschrijft hoe de CPA te gebruiken om koude overgevoeligheid, analgesie en aanpassing bij muizen te meten.

Introduction

Meten koude responsiviteit bij knaagdieren is van belang voor een beter begrip van de mogelijke mechanismen van koude gevoeligheid bij mensen zowel onder normale en pathologische omstandigheden. De Koude Plantaire Assay (CPA), oorspronkelijk ontwikkeld enkele jaren geleden ^1, is ontworpen om reproduceerbare, eenduidige muizen gedragsreacties op een koude stimulus afgeleverd bij RT genereren. Meer recente verbeteringen van deze assay kon de reproduceerbare meting koude gevoeligheid uiteenlopende temperaturen ^2. Beide versies zijn ook ontworpen om relatief hoge doorvoer, en goedkoop te gebruiken.

Een groot deel van de vooruitgang is geboekt in het begrijpen van de mechanismen van koude gevoeligheid gebruik van andere gedragsproblemen methoden. Een methode is de aceton verdampen test, wat inhoudt deppen of sproeien aceton op de muis poot en het meten van de hoeveelheid tijd dat de muis besteedt aantikt poot ^3,4. Helaas,de reacties op aceton verdamping verstoord door het nat gevoel en de geur van de aceton. Ook kan de koude stimulus die wordt toegepast in de aceton verdampen proef is afhankelijk van de hoeveelheid aceton toegepast en is moeilijk te kwantificeren. Tenslotte verwonde muizen minimale reactie op aceton bij basislijn, waardoor het onmogelijk analgesie gemeten in afwezigheid van overgevoeligheid deze methode.

Een andere klassieke test voor koude reacties is de staart flick test, waar de latentie tot de intrekking wordt gemeten na de staart wordt ondergedompeld in koud water ^5,6. Terwijl de gedragsreacties in deze test eenduidig ​​en meet het onderzoek antwoorden op een bepaalde temperatuur worden de dieren worden tegengehouden tijdens de test, die koud flexibiliteit door welomschreven stress geïnduceerde analgetische mechanismen ⁷ kan veranderen.

Een andere veel gebruikte tool is de koude plaat test, die de gedragsmaatregelenresponsen van muizen na een Peltier-gekoelde plaat ^8-10 geplaatst. Hoewel deze tool geeft informatie over het dier de reacties bij een bepaalde temperatuur, het is ook niet consequent toegepast; verschillende groepen verschillende reacties waaronder het aantal sprongen ^8,11, de latentie eerste reactie ^{8,11- 13} gemeten en het aantal poot liften ^11,13,14 met zeer verschillende resultaten. De koude plaat test is ook relatief lage omzet als alleen een dier kunnen worden getest in een tijd, en het een dure en kwetsbare peltier-apparaat vereist.

De 2-plaat temperatuur voorkeur test is een veelgebruikte afgeleide van de koude plaat test die de relatieve hoeveelheid tijd dat de dieren doorbrengen op 2 verbonden platen van verschillende temperaturen ^{9,15- 17} meet. Een ander soortgelijk gebruikte assay is de temperatuurgradiënt assay, waarbij de hoeveelheid tijd die muizen brengen in verschillende temperatuurzonestussen 5 ° C en 45 ° C op een lange metalen plaat gemeten ^16. Hoewel deze testen laten vergelijking van temperaturen, is het onduidelijk of het gedrag vertegenwoordigt temperatuur afkeer of om de temperatuur voorkeur.

Ten slotte heeft de dynamische koud bord test is gebruikt om te meten hoe muizen reageren op veranderende omgevingstemperatuur ^18. Deze werkwijze omvat het plaatsen van muizen op een RT Peltier apparaat en ramping minimumtemperatuur 1 ° C terwijl meten hoeveel de muizen springen of likken hun poten bij verschillende temperaturen plaat. Hoewel deze proef waar muizen aanpassen aan een koelomgeving, verschaft het niet een manier om te testen hoe muizen reageren op een koude stimulus in de setting van een koeler omgevingstemperatuur. Bovendien vereist dure apparatuur te voeren en biedt geen manier aan muizen tot de testapparatuur acclimatiseren voordat meten de koude gevoeligheid.

Als aanvulling op deze testen, de CPA test de acclimated responsies op een welbepaalde koude stimulus op verschillende temperatuurbereiken, of tijdens het proces van aanpassing aan koude omgevingstemperaturen. Het kan testen 14 muizen tegelijk met de huidige inrichting, met de potentie om goedkoop worden opgeschaald voor high-throughput testing.

Protocol

Alle muis protocollen waren in overeenstemming met de National Institutes of Health richtlijnen en werden goedgekeurd door de Animal Studies Committee van de Washington University School of Medicine (St. Louis, MO).

1. Voorbereiding van de testplaat en behuizingen

1. Reinig het glasoppervlak.
2. Zet het T-type filament thermokoppel aan de oppervlakte in het midden van de glasplaat met laboratorium tape.
3. Plaats de dierenverblijven op de glasplaat in één lijn langs het midden van de plaat.
4. Rijg de thermokoppelsonde door het centrum dierenverblijf en steek de stekker in de datalogger. Draai de datalogger op terwijl deactiveren van de functie voor automatisch uitschakelen, en bevestig de datalogger aan op de computer met de meegeleverde kabel.
   1. Als het opnemen van de plaat temperatuur tijdens het experiment, opent u de data logger software om de opname van de plaat temperaturen beginnen.
   2. Pas indien nodig de software opnieuw tekoord de plaat temperatuur één keer per seconde.
   3. Beginnen met het opnemen van de temperatuur met behulp van de software geleverd met de thermische datalogger.
5. Scheid de behuizing met zwarte inzetstukken aan visuele interactie tussen muizen te voorkomen.
6. Plaats spiegels onder het glas, zodat de onderkant van de behuizingen zichtbaar vanuit een comfortabele zitpositie.

2. Warming / Koeling van de Plaat van het Glas

1. Vul aluminium dozen met verwarmd water, nat ijs of droog ijs en plaats ze adequaat op de glasplaat (aluminiumfolie pakketten gevuld met droogijs kan ook worden gebruikt om het glas te koelen Figuur 1) ^2.
   1. Voor het testen bij 30 ° C, de positie van de aluminium dozen ongeveer 0,25 '' weg van de dierenverblijven (Figuur 2B) ^2.
      1. Stel een verwarmde circulatiepomp aan weerszijden van de glasplaat. Stel de circulatiepomp om 45 - 60 ° C en onse aan de aluminium dozen vullen met een gestage stroom van warm water (figuur 1C) ^2.
      2. Plaats de circulatiepompen zodat het hete water uit de aluminium kisten afvoert direct terug in het reservoir van de circulatiepomp aan elke kant (figuur 1C) ^2.
   2. Voor het testen bij RT, laat u de vakken leeg (figuur 2) ^2.
   3. Voor het testen bij 17 ° C, de positie van de boxen ongeveer 0,25 '' weg van de dierenverblijven aan beide zijden en vullen met nat ijs (Figuur 2) ^2.
   4. Voor het testen bij 12 ° C, de positie van de boxen ongeveer 1.25 '' weg van de behuizingen aan beide zijden en vullen met droog ijs (Figuur 2) ^2.
   5. Voor het testen bij 5 ° C, plaats de boxen ongeveer 0,25 '' weg van de behuizingen aan beide zijden en vullen met droog ijs (Figuur 2) ^2.
      1. Bij koeling het glas met droog ijs, zorg ervoor dat er voldoende ventilatie om de CO ₂ opbouw in de ruimte te voorkomen.
2. Wacht tot het glas naar de gewenste temperatuurbereik bereikt.
3. Voeg de muizen om de behuizingen op de plaat.
   OPMERKING: Een witte ruis generator kan worden gebruikt om geluidsoverlast te verminderen.
4. Wacht tot de muizen om te acclimatiseren.
   LET OP: In onze faciliteit neemt dit ongeveer 2,5 uur, maar dit kan sterk variëren op basis van dierlijke huisvesting en behandeling voorwaarden.
5. Handhaaf het glas bij het gewenste temperatuurbereik te zorgen dat de dozen met verwarmd water, nat ijs of droog ijs worden bewaard.
   OPMERKING: Met onze apparaten moeten de vakken worden bijgevuld met ijs ongeveer elke 90 min.
   OPMERKING: Voor de 17 ° C staat, is het nuttig om het grootste deel van het water uit de aluminium kisten door de afvoer gaten te legen voordat het navullen met ijs. Dit zal de temperatuur beter, en pr te stabiliserengebeurtenis overflow
   OPMERKING: De exacte hoeveelheid van het droogijs wordt seizoensinvloeden variëren, maar over het algemeen houden de vakken meer dan ¼ volledig over de gehele lengte van het vat zal de temperatuur constant te houden.

3. Testen van de Muizen op een vaste temperatuur

1. Buiten de gedrags kamer, vult een ijsemmer ongeveer de helft vol met droogijs.
2. Met behulp van een hamer of een hamer, verpletteren de droogijs tot een fijn poeder.
   OPMERKING: Bij een te volle bak zal het moeilijk maken om volledig te verpletteren het droogijs tot poeder.
3. Met behulp van een straight scheermesje of een schaar, knip de bovenkant van een spuit van 3 ml.
4. Met behulp van een 21 G naald, poke 3 gaten aan tegenoverliggende zijden van de spuit (totaal 6 holes).
   LET OP: Deze gaten zal de druk wordt gegenereerd door sublimatie verminderen, terwijl het comprimeren van het droogijs. De cut-off spuit kan worden hergebruikt voor meerdere experimenten.
5. Neem de spuit, droog ijs poeder, en een hand-held stopwatch in de gedrags-kamer.
6. Vul de spuit kamer half vol droge poeder ijs. Houd het afgesneden uiteinde van de spuit tegen een plat voorwerp, en aandrukken van de poeder met de plunjer. Wees voorzichtig; de plastic plunjer verbuigen of breken van de druk. Als dit gebeurt, vervang dan de zuiger van een nieuwe spuit.
7. Verleng de punt van het gecomprimeerde droog ijs pellet langs de rand van de injectiespuit.
8. Test muizen die volledig in rust zijn.
   1. Bij 30 ° C, 23 ° C en 17 ° C, proefmuizen alle 4 poten op het glas en niet beweegt, maar niet volledig slaap ^19.
   2. Bij 12 ° C en 5 ° C, testen muizen die op 2 poten of 4 poten en stil of springen.
9. Met behulp van de spiegels voor targeting, voorzichtig maar stevig op de vlakke pellet vlak tegen het glazen oppervlak onder de muis achterpoot (Figuur 1A) ^2. Start de kant-timer.
10. Stop de timer en verwijder de pellet wanneer de muis beweegt weg van de gekoelde glazen.
    OPMERKING: De terugtrekking beweging kan verticaal of horizontaal zijn.
    1. Als de muis heel kort beweegt de poot en dan stuurt het terug naar het koeloppervlak, blijven de timing en het stimuleren totdat de muis maakt een permanente beweging weg.
       OPMERKING: Ons laboratorium gebruikt maximaal stimulus van 20 seconden voor muizen in de meeste gevallen.
11. Herhaal deze testprocedure tot ten minste 3 waarden op elke poot van elk dier worden verzameld. Afzonderlijke proeven testen tegenover poten op dezelfde muis met tenminste 7 min en afzonderlijke opeenvolgende proeven met een enkele poot met ten minste 15 min.
12. Gebruik indien nodig verschillende diktes van glas verschillende tarieven van koeling (figuur 3) ¹ genereren.
    OPMERKING: De koelsnelheid is omgekeerd gecorreleerd met de dikte van het glas.

4. Het testen van de Muizen Tijdens Koude Adaptation

LET OP: Dit is een alternatieve protocol dat het testen toestaat als het glas plate koelt, plaats nadat de plaat is gestabiliseerd en de muizen volledig aan de koude omgeving.

1. Volg de in deel 1 voor het opzetten van het apparaat vermelde instructies.
2. Volg de in rubriek 3 van de uitgangswaarde van metingen bij kamertemperatuur (Figuur 7A) ² instructies.
3. Pre-koelen aluminium dozen met droogijs.
4. Zodra basislijn terugtrekking latencies zijn gemeten, plaatst u de voorgekoeld dozen op de plaat ongeveer 1.25 '' weg van de behuizingen aan weerszijden (Figuur 7A, pijl met het label "Dry ice toegevoegd") ^2.
5. Volg de in hoofdstuk 3 genoemde om metingen te nemen als de glazen plaat koelt, het nemen van metingen zo vaak mogelijk instructies.

Results

De gedragsreacties ontlokt muizen beginnend bij 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C en 12 ° C zijn zeer reproduceerbaar (figuur 4A) ^20. Om de koude stimulus onder de achterpoot wordt gegenereerd meten, werden muizen geanesthetiseerd met ketamine / xylazine / acepromazine cocktail en de poten zijn bevestigd aan het glas op een T-type thermokoppel filament (figuur 4B) ^20. Het glas werd gekoeld of verwarmd tot de gewenste testbereik. Hoewel de plaat gelijkmatig gekoeld langs de le...

Discussion

De CPA kan worden gebruikt om koudsensitiviteit en koudaanpassing bij muizen te beoordelen. Het biedt een betaalbare, efficiënte manier om koudreacties te meten bij ongehinderde, geacclimatiseerde dieren binnen een breed scala aan temperatuurbereiken. Het biedt ook een ondubbelzinnige gedragsreactie met een gemakkelijk te kwantificeren en te analyseren uitvoervariabele. Het is al gebruikt om veranderingen in koudsensitiviteit veroorzaakt door ontsteking¹, neuropathische letsels¹, analgetica¹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
T-type thermocouple probe	Physitemp	IT-24p	Gebruikt om de oppervlaktetemperatuur van het glas te meten (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glazen plaat	Lokaal glasbedrijf (in St. Louis, Stemmerich Inc)		We gebruiken pyrex glas (borosilicaat float). Ons lab gebruikt over het algemeen 1/4'', maar 3/16'' en 1/8'' zijn ook nuttig
Thermische Data logger	Extech	EA15	Thermologger om de glastemperatuur bij te houden (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Spuit	BD	309657	De bovenkant wordt afgesneden en droog ijs wordt in de spuit geperst om een koude sonde te genereren
Computer	Als u de Extech-logger gebruikt, zal elke Pc werken
Aluminium dozen	Washington University in St. Louis machinewerkplaats		dozen zijn 3' lang, 4.5'' breed en 3'' hoog met een afgesloten deksel.  Er is een 1/2'' gat in één korte zijde van elke doos, dicht bij de bodem. Deze gaten worden gevuld met rubberen stopkokers wanneer de dozen worden gevuld met nat ijs of heet water.
Verwarmde watercirculator	VWR		Elk watercirculatormodel met een pomp zal werken
21 G naald	BD	305165	De exacte naaldmaat is niet belangrijk
Handtimer			Elke handtimer zal werken
Spiegel			Elke platte spiegel zal werken