Met behulp van de electroretinogram om Function beoordelen in het knaagdier Retina en de beschermende effecten van Remote Limb Ischemische preconditionering

Samenvatting

Het elektroretinogram (ERG) is een elektrisch potentiaal dat door de retina wordt gegenereerd als reactie op licht. Dit artikel beschrijft hoe de ERG kan worden gebruikt om de retinale functie te beoordelen, bij in het donker aangepaste ratten, en hoe het kan worden gebruikt om een neuroprotectieve interventie te evalueren, in dit geval afstandsischemisch preconditioning.

Samenvatting

Het ERG is de som van alle retinale activiteit. Het ERG wordt meestal opgenomen vanaf de hoornvlies, die fungeert als een antenne die signalen van de retina verzamelt en samenvoegt. Het ERG is een gevoelige maat voor veranderingen in de retinale functie die pan-retinaal zijn, maar is minder effectief voor het detecteren van schade beperkt tot een klein gebied van de retina. In het huidige werk beschrijven we hoe we de ‘flash’ ERG kunnen opnemen, dat is het potentieel dat wordt gegenereerd wanneer de retina wordt blootgesteld aan een korte lichtflits. We beschrijven methoden voor anesthesie, mydriase en hoornvliesbeheer tijdens de opname; hoe de retina donker aangepast kan worden gehouden; elektrodematerialen en plaatsing; het bereik en de kalibratie van de stimulusenergie; opnameparameters en de extractie van gegevens. We beschrijven ook een methode om ischemie in een ledemaat te induceren, en hoe de ERG te gebruiken om de effecten van deze van de retina verwijderde ischemie op de retinale functie na lichtschade te beoordelen. Er wordt een twee-flitsprotocol beschreven dat het isoleren van de kegeltjes-gedreven component van de donker aangepaste ERG mogelijk maakt, en daardoor de scheiding van de staafjes- en kegeltjescomponenten. Omdat het kan worden opgenomen met technieken die minimaal invasief zijn, is het ERG veel gebruikt in studies van de fysiologie, farmacologie en toxicologie van de retina. We beschrijven een voorbeeld van deze bruikbaarheid, waarbij het ERG wordt gebruikt om de functie van de door licht beschadigde retina te beoordelen, met en zonder een neuroprotectieve interventie; preconditie door verwijderde ischemie.

Inleiding

De ERG is een elektrische potentiaal van het netvlies opgewekt in reactie op licht, en opgenomen van het corneale oppervlak van het oog. Wanneer opnameomstandigheden zorgvuldig beheer kan de ERG worden gebruikt in een verscheidenheid van manieren om de retinale functie bepalen. Hier beschrijven we hoe de "flash ERG, de potentiaal gegenereerd wanneer de retina wordt blootgesteld aan een korte, heldere flits gepresenteerd in een Ganzfeld achtergrond opnemen. De Ganzfeld verspreidt het licht homogeen en de lichtflits het hele netvlies bereikt ongeveer gelijkmatig. Als de retina wordt donker aangepast voor de opname, en de donkere aanpassing wordt gehandhaafd als het dier is voorbereid voor het opnemen, de ERG verkregen wordt opgewekt door zowel staafjes en kegeltjes fotoreceptoren.

De donker aangepaste flash ERG heeft een karakteristieke golfvorm, die is op twee manieren geanalyseerd. Ten eerste zijn vroege en late onderdelen van de ERG golfvorm onderscheiden, en met betrekking tot de sequentie van neuronal activering in de retina. De eerste component is een korte vertraging neergaande potentiaal, de a-wave (figuur 1). Dit wordt gevolgd door een opgaande potentiaal, de zogenaamde b-wave. De stijgende fase van de b-golf toont oscillaties, die worden beschouwd als een afzonderlijke component (oscillerende potentials of OP's). De a-golf wordt geacht zullen worden door fotoreceptoren, de b-golf door cellen van de binnenste kernlaag, en OP's door amacrine cellen ^1.

Op basis van de prikkelsterkte, reacties op erg zwak flitsen zogenaamde scotopische drempel respons mogelijk. De scotopic drempelwaarde respons wordt verstaan ​​worden gegenereerd uit de retinale ganglioncellen ^2-4. Ten tweede kan de flitser ERG worden gescheiden door lichte aanpassing, of door een twee flash protocol hieronder beschreven, in staaf- en-cone gedreven componenten. Onder fotopische omstandigheden, de a-golf is niet detecteerbaar in ratten omdat de kegel bevolking is laag, maar OP's en b-wave zijnduidelijke ^5. In primaten, waarvan het netvlies hebben hogere kegel bevolking, zowel staaf- en kegel- paden genereren een detecteerbaar een golf ^6.

Twee nuttige maatregelen vaak uit het flash ERG zijn de amplitudes van de a- en b-golven, gemeten zoals in figuur 1, met typische flash responsen getoond in figuur 2. Wanneer de fotoreceptor populatie wordt verminderd, bijvoorbeeld door blootstelling aan licht tot schadelijk licht, alle onderdelen van de ERG verminderd. Neurobeschermende interventies, zoals remote ischemische preconditionering (RIP), kan worden gevalideerd door het behoud van de amplitudes van de a- en b-golven (Figuur 3). Samengevat, de analyse van de ERG een vergelijking mogelijk tussen gezond, licht beschadigd en neuroprotected netvlies.

Protocol

Dit protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Universiteit van Sydney.

1. Het maken van elektroden

1. Teken de positieve elektrode (degene die contact cornea) vanaf een korte (5 cm) lengte van platinadraad 1-2 mm in diameter. Mode het in een lus enkele mm in diameter. Sluit deze lus een huidige lood, lang genoeg om de ingangstrap van de versterker bereikt (zie figuur 4).
2. Construct de negatieve elektrode (die zal gaan in de mond van het dier) met behulp van een Ag / AgCl pellet 1-2 mm in diameter, ook verbonden met een conventie lead (zie figuur 4).
3. Als een referentie-elektrode (die in romp van het dier gaat), een schone injectienaald (23 G), ook verbonden met een leiding van geschikte lengte (zie figuur 4).
4. Idealiter gebruik drie-lood kabels die door de fabrikanten instrument, om de drie elektroden te verbinden (positieve U94; hoornvlies, negatieve → mond, verwijzing → stuit) naar de versterker.

2. Aansluiting en kalibratie van Licht Stimulus en ERG Set-up

1. Maak (of zoek) een opname laboratorium, die donker kan worden gemaakt. Uit te rusten met een of beide van een over-the-bank lichtrode gemaakt of een rood hoofd-lamp.
2. Gebruik een luxmeter die rood licht verlichtingssterkte bereiken van het oog van de rat tijdens de installatie te bevestigen niet meer dan 1 lux.
   Opmerking: een grijsfilter kan worden gebruikt om de helderheid van de lamp te verminderen en de bron van de lamp licht moeten specifiek uitstralen rood licht. Dark aanpassing zal worden aangetast als lichtbronnen uitstoten lager (zichtbaar) golflengten.
3. Afdichten van alle strooilicht invoeren van de opname laboratorium (dit vereist vaak volharding met ondoorzichtige tape) en bereiden een grijsfilter (dit kan worden gekocht in platen) groot genoeg is om op te passen, en zo zwak, een computerscherm, je zal hebben in de lab.
   Opmerking: Stray licht enhet licht van het scherm voldoende zijn om donkere aanpassing van het oog rat schaden.
4. Sluit de versterker data-acquisitie hardware. Verbind positieve, negatieve en verwijzing leidt naar de versterker. Zorg ervoor dat de computer en de LED Ganzfeld voedingseenheid zijn aangesloten op een grond bron.
   Opmerking: Sommige laboratoria hebben zich gespecialiseerd aarding punten, aangesloten op een bouwgrond; een waterleiding is een effectief alternatief.
5. Kalibreren van de LED-lichtbron met een research-kwaliteit radiometer. Bevestig sensor van de meter in de stand van de ogen van het dier zal worden gevestigd tijdens een experiment.
6. Programmeer de Ganzfeld LEDs naar een full-field ERG protocol met stapsgewijze verhogingen van de flits van energie, flash duur, flash herhaling en tijd tussen de flitsen rennen, genaamd interstimuls interval (ISI), de instellingen. Voor een voorbeeld full-field-protocol zie tabel 1.
   Opmerking: De full-field ERG flitsen toenemen van repetitieve dim flitsen naar brechts knippert in een stapsgewijze manier. De twee flash-programma is een vervolg op de full-field-protocol en maakt isolatie van staafjes en kegeltjes reacties.

3. Dag Voorafgaand aan ERG Experimenteren

1. Dark passen Sprague-Dawley ratten gedurende 12 uur voor de opname. Het is handig om deze in de opname laboratorium, nadat strooilicht is geëlimineerd.

4. Dag van de ERG Experimentation

1. Schik voor het dier zachtjes verwarmd tijdens het opnemen zijn. We maken gebruik van een lichte metalen platform gebouwd, zodat het hoofd van het dier kan rusten op het juiste moment bij de ingang van de Ganzfeld. Het platform heeft ingebouwde buis waardoorheen we pompen water voorverwarmd tot 40 ° C in een waterbad.
   Opmerking: Gebleken is dat dit blijft de kerntemperatuur van het dier bij 37 ° C.
2. Weeg de rat onder donkere omstandigheden. Gewicht opnemen en maken correcte ketamine (60 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg) dosis. Restrain de rat genTLY en injecteer verdoving intraperitoneaal.
3. Let op de tijd van de injectie. Zodra het dier bewusteloos is (meestal binnen 5 min) Controleer de diepte van de anesthesie door licht te knijpen een voet pad, om te zien of een reflex reactie aanwezig is. Het is het beste om te wachten tot deze reflex is afwezig of zwak is, alvorens verder te gaan.
4. Breng een enkele druppel atropine en een andere van proxmethacaine aan hoornvlies.
5. Snijd een 10 cm lengte van de zwarte draad. Maak een lus met een simpele knoop en zet de lus over de evenaar van het oog. Draai het iets; het effect is om de oogbol iets naar voren trekken, met minimale druk. Dit houdt het hoornvlies duidelijk uit de oogleden.
6. Breng carbomeer oogdruppels op de cornea oppervlak. Zorgen carbomer blijft aan hoornvlies en niet morsen op de oogleden of het gezicht.
7. Plaats absorberend beddengoed bovenop verwarmde platform.
8. Positie rat op het beddengoed, met het hoofd in de aanbevolen plaats in de opening van de Ganzfeld.
9. Int Inserternal temperatuursonde in het rectum. Secure temperatuursensor in de positie door taping sonde aan op de staart.
10. Plaats de referentie-elektrode (de 23 G-naald) subcutaan in het achterste been, en verbinding maken met versterker.
11. Plaats de negatieve elektrode (Ag / AgCl pellet) stevig in de mond. Om dit te voorkomen uitglijden uit de mond, brengt de verbindende leiden tot een stabiele ondergrond.
12. Plaats de positieve elektrode in het midden van de cornea. Met behulp van een micromanipulator, ervoor te zorgen dat de elektrode raakt het hoornvlies voorzichtig.
13. Controleer de lichaamstemperatuur is bij 37,0-37,5 ° C.
14. Zodra het dier goed is gepositioneerd en elektroden zijn in de plaats, draperen de hele setup (Ganzfeld en dier) met een ondoorzichtig materiaal (naar donker aanpassing behouden). We maken gebruik van een zachte zwarte doek.
15. In de acquisitie software ingesteld op een 2 KHz sampling rate met een collectie tijd van 100-1000 msec met 5 msec van pre-collectie sampling. Stel de band pass filters om 1-1,000Hz en ervoor te zorgen dat de bemonstering wordt geactiveerd om de periode van ~ 250 msec na een flits proeven.
16. Controleer de opname baseline. Het moet vrij zijn van externe ruis, maar tonen enkele versterker lawaai en een respiratoire oscillatie.
17. Als de basislijn toont externe ruis, begint het oplossen van problemen. De meeste problemen zijn gerelateerd aan afwijkingen in elektrodepositie of aarding. Gebruik een kooi van Faraday om ervoor te zorgen opnames zijn vrij van externe ruis.
18. Voer een proefflits, 0,4 log scot cd.sm ^-2. Een ERG golfvorm gelijk aan figuur 2A moeten verschijnen. In ons laboratorium typische antwoorden voor een 0,4 log scot cd.sm ^-2 flash zijn (a-wave: -474 ± 39 mV en b-golf: 1512 ± 160 mV, n = 11).
19. Laat dier dark opnieuw aan te passen voor 10 min. Het is handig om de 10 min om de basislijn opnieuw te controleren.
20. Na de bevestiging van stabiele signaal te beginnen opnemen.
21. Aan het einde van de opname sessie, controleer dan of het lichaam temperature werd gehandhaafd. Verwijder elektroden. Reapply carbomeer polymeer hoornvliezen. Laat het dier te herstellen op een warmte-pad totdat het is volledig mobiel en actief, voordat hij terugkeerde naar stallen.

5. Remote ischemie

1. Voer remote ischemie in ofwel wakker of verdoofd knaagdieren.
2. Als het dier is verdoofd, leg het op een verwarmd platform (boven) en zet de bloeddrukmeter manchet over het bovenste deel van de achterste ledematen, uit de buurt van de knie.
3. Wanneer de dieren worden gebruikt om verschillende handelingen is het mogelijk om deze procedure uit te voeren zonder verdoving; Dit vereist twee personen. Een persoon weerhoudt het dier voorzichtig en de tweede past de bloeddrukmeter manchet en exploiteert de bloeddrukmeter.
4. Voor wakkere dieren, gebruik dan een stuk handdoek ~ 15 cm x 30-50 cm om voorzichtig wikkel de dieren, met één achterbeen gratis. Leg het dier op zijn rug op (bijvoorbeeld) de linker onderarm, met zijn hoofd verscholen tussen arm en de romp van de houder, en plaatsde manchet zoals zojuist beschreven.
5. Leeglopen van de manchet en zorgen voor de luchtdruk gesloten is. Pomp de manchet 160 mmHg in dieren verdoofd en op 180 mmHg in wakkere dieren. Dit overschrijdt systolische druk (meestal 140 mmHg en 160 mmHg respectievelijk).
6. Handhaaf die belasting met gebruikmaking van de handbediende pomp.
7. Na de geplande tijd voor ischemie (we gebruiken 2 periodes van 5 minuten, gescheiden door 5 min reperfusie), laten leeglopen van de manchet druk door de luchtdruk ventiel los te draaien.
8. Bevestig het effect op afstand ischemie met huidtemperatuur probe bevestigd aan de voetzool. Skin temperatuur daalt meestal 32-30 ° C, meer dan 5 minuten en herstelt op reperfusie.

6. Licht Schade

1. Zorg ervoor dat de ratten zijn in een donker aangepaste nachts, voordat het licht schade procedure.
2. Op het juiste moment na ischemie van de ledematen (in onze experimenten zonder vertraging), wordt elk dier afzonderlijk in een plexiglas dozen, wi geplaatstth water en voedsel in de vloer op basis van containers.
   Opmerking: Licht-geïnduceerde schade kan alleen in albino dieren worden uitgevoerd.
3. Schakel op een pre-gekalibreerde 1000 lux wit licht op een standaard tijd (meestal 09:00) en deze toestand gedurende 24 uur behouden.

7. ERG Data Extraction en Analyse

1. Verwerven gemiddeld golfvormen van de ERG. Eventueel corrigeren voor een niet-nul basislijn, door aftrekking.
2. Meet de amplitude van een golf (ingediend op gemiddelde tot hogere stimulus intensiteit), als het spanningsverschil tussen de basislijn en de eerste (<30 msec latentie) goot (figuur 1).
3. Meet de b-golf amplitude als het spanningsverschil tussen de top van het a-golf en de positieve van de volgende golven, gewoonlijk optreedt bij een latentie van 80-100 msec (figuur 1).
4. Isoleer oscillerende potentialen via een Fourier transformatie om gegevens 60-235 Hz filter, met een 90 Hz transitie band ^{7. Indien nodig kan de geïsoleerde oscillatiepotentiaal signaal kan dan worden afgetrokken van de ongefilterde golfvorm om de identiteit van een golfdal bevestigen.}
5. De impliciete tijd (latency) van de a- en b-golf pieken kan ook een nuttige maatregel (figuur 1) zijn. Gebruik de twee flitsen om de staaf reactie te isoleren. Trek de conus response (flash 2) vanaf het gemengde respons (flash 1) aan de stang response isoleren (Figuur 2).
6. Normaliseren individuele lichtintensiteit een-wave en b-golf amplitudes (post-behandeling / post-behandeling-baseline) of gemiddeld voor de behandeling groepen. Intensiteit-respons curves plot de groep amplitudes en opstaan ​​tegen flash energie.

Resultaten

Het protocol kan worden gebruikt om visuele functie van knaagdieren retina in vivo meten. De een-golf, een maat voor de afdrukband functie en de b-golf, een maatregel van innerlijke netvlies functie worden geannoteerd in figuur 1.

De staaf gedomineerde ERG signaal toeneemt met de toenemende licht stimulus, zoals weergegeven in figuur 2A. De a-golf blijkt bij ~ 0,4 log scot cd.sm ^-2 en de amplitude van de a-golf neemt toe tot verzadiging 2...

Discussie

De donker aangepaste flash ERG hierboven beschreven is een betrouwbare methode voor het beoordelen van de retinale functie bij ratten. Zowel de een-wave en b-golf werden gereduceerd met lichte schade. Remote ischemische preconditionering getemperd licht schade veroorzaakte reducties in de een-wave en b-golf. Dit behoud van retinale functie suggereert dat remote ischemische preconditionering heeft geïnduceerde neuroprotectie, die lijkt op andere vormen van beschermende preconditionering zoals hypoxie, ischemie en lichaam...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PC computer
Powerlab, 4 kanaals acquisitie hardware	AD Instruments	PL 35044	Acquisitie van ERG
Animal Bio Amp	AD Instruments	FE 136	Versterker voor ERG
Lab chart	AD Instruments		Software voor signaalverzameling
Ganzfeld	Photometric solutions	FS-250A	Lichtstimulatie
Ganzfeld besturingssysteem	Photometric solutions
Research Radiometer	International light technologies	ILT-1700	Lichtreeks kalibreren
Luxmeter		LX-1010B	Rode lichtverlichting controleren
Excel	Microsoft
Leidingdraden	AD Instruments		Verbind positieve, negatieve grondelektroden met versterker
Leidingdraden - alligator	AD Instruments		Aarding ganzfeld en acquisitiehardware op computer
Platinedraad 95%	A&E metals		Positieve elektrode
Mondelektrode Ag/AgCl Pellet	SDR	E205	Negatieve elektrode
26 G naald	BD		Grondelektrode
Waterpomp
Waterbad
Slangen
Homeotherm dekensysteem met flexibele sonde	Harvard Apparaten	507222F
Atropine 1% w/v	Bausch & Lomb		Topische mydriase
Proxmethycaine 0,5% w/v	Bausch & Lomb		Topische verdoving
Visco tears oogdruppels	Novartis		Carbomerpolymeer
Draad			Ooglid terugtrekken
Pincet
Herbruikbaar kleefmiddel	Blu tac		Dim rode koplamp. Bevestig elektroden
Absorbeerbare bedden
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		Dissociatieve
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		Spierverslapper
Weegschaal