De Double-H Maze: een robuuste Behavioral Test voor leren en geheugen in Knaagdieren

Summary

Het doel van dit protocol is om ruimtelijke cognitie bij knaagdieren te onderzoeken. Het double-H waterlabyrint is een nieuwe test, die bijzonder nuttig is om de verschillende componenten van leren, consolidatie en geheugen, evenals de interactie van geheugensystemen, te verduidelijken.

Abstract

Ruimtelijke cognitie onderzoek bij knaagdieren kenmerkend gebruik het gebruik doolhof taak, wiens kenmerken verschillen van doolhof naar de volgende. Deze taken verschillen per hun gedragsproblemen flexibiliteit en vereist geheugen duur, het aantal doelpunten en paden, en ook de algehele complexiteit van de taak. Een verwarrende functie in veel van deze taken is het gebrek aan controle over de strategie in dienst van de knaagdieren naar het doel, bijvoorbeeld, allocentric (declaratieve-achtig) of egocentrisch (procedurele) gebaseerde strategieën te bereiken. De dubbel-H doolhof is een nieuwe water-escape geheugen taak die deze kwestie behandelt, doordat de onderzoeker aan direct het type strategie geleerd tijdens de training periode. De dubbel-H doolhof is een transparante inrichting, bestaande uit een centrale steeg met drie armen uitsteekt aan beide zijden samen met een ontsnappingsplatform onder water aan het uiteinde van een van deze armen.

Ratten kunnen getraind worden met behulp van een allocentric strategie door afwisselend de stkunst positie in het doolhof in een onvoorspelbare manier (zie protocol 1, §4.7), hen waardoor het nodig om de locatie van het platform op basis van de beschikbare allothetic signalen te leren. Als alternatief, een egocentrische leerstrategie (protocol 2; §4.8) kan worden gebruikt door het vrijgeven van de ratten uit dezelfde positie tijdens elke proef, totdat ze leren de procedurele patroon die nodig is om het doel te bereiken. Deze taak is bewezen te staan ​​voor de vorming van een stabiele geheugen sporen.

Het geheugen kan worden onderzocht na de stage in een misleidende sonde proef, waarin de uitgangspositie voor de ratten plaatsvervangers. Na een egocentrische leren paradigma, ratten meestal hun toevlucht tot een allocentric-based strategie, maar alleen als hun eerste zicht op de extra-doolhof signalen verschilt sterk van hun oorspronkelijke positie. Deze taak is bij uitstek geschikt om de effecten van drugs / verstoringen op allocentric / egocentrisch geheugenprestaties alsook de interactie tussen th staandese twee geheugen systemen.

Introduction

Bij dieren, wordt het leren hoofdzakelijk gemedieerd door de hippocampal- en striatum gebaseerde geheugen systemen ^1,2, die een centrale rol ten aanzien van plaats- en procedurele-geheugen te spelen, respectievelijk. De relatie tussen deze twee systemen is complex, en ze zijn bekend om te interageren met elkaar in coöperatieve of competitieve omgangsvormen ^1,3. Bovendien hebben studies aangetoond dat de invloed van een van deze geheugensystemen op diergedrag kan verhogen na de afwezigheid of beschadiging van het andere systeem ^4-7. Beide systemen zijn verbonden met de prefrontale cortex via de thalamus.

Tal van neurologische aandoeningen en neurodegeneratieve ziekten kunnen ruimtelijke cognitie beïnvloeden bij de mens, die een beroep doen op de wisselwerking tussen procedurele en declaratief geheugen systemen. Voorbeelden zijn de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD) ^10/08, ziekte van Alzheimer (AD) ^11-14, enamyotrofe laterale sclerose (ALS) ^15. Diermodellen, die relevant zijn voor deze aandoeningen kunnen worden geïnduceerd door middel van verschillende medicamenteuze behandelingen waarbij bepaalde receptoren ¹⁶ blokkeren, en via gerichte laesies. Wanneer de dieren worden gebruikt met ruimtelijk geheugen taken kan een waardevol inzicht te krijgen in de onderliggende mechanismen gerelateerd aan deze aandoeningen, evenals diverse behandelingen.

Er zijn veel verschillende soorten ruimtelijk geheugen taken knaagdieren, die collectief zijn in specifieke aspecten van leren en geheugen, evenals de effecten van mogelijke behandelingen voor verschillende aandoeningen ^17,18 beoordelen. Deze taken kunnen worden onderscheiden door het aantal doelen en paden, de mate van buigzaamheid gedrags oplossing van de taak, de opslagduur of vertraging, evenals de keuze van de strategie toegepast bij het oplossen van de taak. Een goede prestatie kan worden verkregen op basis van externe stimuli of monumenten die worden gebruikt voor het oriënterenhet dier naar het doel (een allocentric of plaats strategie). Alternatief kan een knaagdier een strategie die is gebaseerd op fysieke richting en signalen met betrekking tot de richting bewegen (een egocentrische of procedurele strategie), bijv ontwikkelen als een rat weet dat het doel is een linksaf gevolgd door een bocht naar rechts , dan is er weinig behoefte aan een allocentric of plaats strategie. Maze voeren taken verschillen, afhankelijk van de mate van flexibiliteit die het knaagdier lossen. Bijvoorbeeld, in de Morris Water Maze, een droge versie van de laatste (bijvoorbeeld ¹⁹⁾ of Barnes maze (bijvoorbeeld ^20), er potentieel oneindige routes de rat kan nemen om het doel te bereiken. In de Morris Water Maze, bijvoorbeeld de locatie van het doel kunnen worden geleerd berusten op externe of monumenten cues (allocentric strategie), of door eenvoudigweg zwemmen in cirkels naar het midden totdat het platform gevonden (egocentrisch strategie) ^21. Bepaalde taken hebben meerdere doelenen een hoge mate van flexibiliteit, zoals de conus-taakveld ²² of Olton de radiale doolhof ^23. Aan het andere eind van de schaal zijn taken die beperkte flexibiliteit in het bereiken van het doel, bijvoorbeeld het stenen labyrint of de afwisselende versie van de T-labyrint. Deze taken geven slechts één juiste manier van het bereiken van het doel en de opkomst van cognitieve routines die voornamelijk worden beheerst door het striatum gebaseerde procedureel geheugen te vergemakkelijken.

De dubbel-H doolhof is een nieuw ruimtelijk geheugen testen apparaat, die werd ontworpen om de experimentator aan direct het type strategie die wordt geleerd door knaagdieren in het oplossen van de taak ^24. Bestaande uit drie parallel run armen doorsneden door een loodrechte centrale steegje, de dubbel-H doolhof is een water-escape taak waarin knaagdieren leren om een ​​ontsnapping platform dat is ondergedompeld in een van de doolhof locaties te bereiken. Tijdens de training, kan een procedurele strategie worden ontwikkeld door het handhaven van thij dezelfde start en het doel locaties in. Als alternatief kan een allocentric strategie ontwikkeld worden door afwisselend de startlocatie in een willekeurige volgorde, waardoor het nodig de rat naar de locatie van de verborgen platform op basis van milieu-signalen te leren als het te maken heeft in een water doolhof. Dit overwint een obstakel in verschillende doolhof taak, waarbij de experimentator anderszins weinig controle over het type strategie die knaagdieren gebruiken. Dit is belangrijk bij het overwegen van dat de effecten van bepaalde-cognitie verbeteren drug kandidaten rekenen op de hippocampus-based place-geheugen-systeem, waardoor de opkomst van cognitieve routines of procedures kunnen de interpretatie van de gedragsobservaties beschamen bij dieren, bijvoorbeeld omschakeling van allocentric procedurele geheugen in de loop van de opleiding. Evenzo kan het gewenst zijn de effecten van geneesmiddelen en behandelingen procedureel geheugen inschatten, zonder de invloed van allocentric plaatsgebonden geheugen. Tenslotte, deze inrichtingkan worden gebruikt om de coöperatie of competitieve interacties tussen deze geheugen systemen, en de voorwaarden waaronder knaagdieren kunnen overstappen van het ene systeem naar het andere te bestuderen.

Protocol

1. Algemene overwegingen

Dit protocol wordt goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van het Universitair Ziekenhuis Freiburg (hetzelfde voor Straatsburg). Gezichtsscherpte is noodzakelijk voor de prestaties in het testen van de ruimtelijke leren. Knaagdieren met verminderde visuele systemen zijn dus niet geschikt. Ook moet voldoende verlichting zijn opdat de ratten voor de verschillende signalen op de omringende wanden zien. Het is nuttig om eenvoudige vorm (vierkant, cirkel, driehoek) maar goed contrast signalen te gebruiken (bijvoorbeeld zwart-geschilderd signalen op een wit geschilderde achtergrond). Evenzo ernstige motorische tekorten uitsluitingscriteria omdat zwemmen is vereist voor deze test en verdrinken optreden. Tenslotte kan hyper-angstig knaagdieren sterk bevooroordeeld zoekgedrag, die invloed op de prestaties te geven.

2. Apparaat instellen

1. Construct a double-H doolhof bestaat uit een 160 cm centrale gang, die wordt doorsneden aan beide uiteinden en in het middendrie 160 cm parallel armen (zie Figuur 1). Zorg ervoor dat de centrale steegje en de loodrechte armen zijn 20 cm breed en worden omringd door 35 cm hoog transparant plexiglas muren. De dikte van het plexiglas is 6 mm voor alle onderdelen.
2. Bevestig de muren in plaats met behulp van lijm en schroeven, en waterdicht het doolhof met behulp van siliconen gewrichten op alle interne hoeken. Deze verbindingen kunnen gemakkelijk worden vervangen, moeten zij hun waterdichtheid verloren. Plaats een afvoer aan het uiteinde van een van de armen hoek (of in het midden van het labyrint) te legen.
3. Plaats het doolhof op een 80 cm hoge tafel, met voldoende ruimte er omheen voor een) lopen rond het doolhof, en b) de plaatsing van een goed contrast cues. Wijzen elke arm in het doolhof van zijn positie, dat wil zeggen, ten noordwesten (NW), het noorden (N), ten noordoosten (NE), zuidwesten (SW), zuid (S), en zuidoosten (SE).
4. Plaats een plafond gemonteerde camera boven het doolhof voor post-test analyse van het gedrag van dieren, met behulp van handmatige of automatic (video tracking) methoden (zie § 5).

3. Algemene opmerkingen

1. Voorafgaand aan gebruik vullen het doolhof met water tot een hoogte van ongeveer 18 cm (200 L). Dit is hoog genoeg om te voorkomen dat ratten niet tegen de bodem van het doolhof met hun voeten, maar ondiep genoeg om ontsnapping te voorkomen.
2. Na de pre-training, maken het water ondoorzichtig door het mengen van 250 g magere melkpoeder. Ververs het water op een dagelijkse basis om de melk-water voorkomen ranzig. Houd de temperatuur van het water tussen de 21-23 ° C tot stimulans voor de ratten om de ontsnapping platform zoeken.
   LET OP: Als ratten vertrouwd te raken met de positie van het platform tijdens de pre-training, is haar positie naar een andere arm bewoog tijdens de training.
3. Voor gebruik dompelen een 17 cm hoog, 10 cm diameter platform aan het uiteinde van een van de hoek armen (NE, NW, SE en SW). Zorg ervoor dat de hoogte ondergedompeld is 1 cm onder het oppervlak van het wateroppervlak. Train de ratten te bereikenhet doelplatform met behulp van een allocentric of egocentrisch leerstrategie, die afhankelijk is van het soort paradigma gebruikt (zie §4).

4. Basic Training Protocollen

OPMERKING: Ratten zijn meestal voorzien van een eerste dag van de pre-opleiding, die hen in staat stelt om vertrouwd te raken met het doolhof geworden.

1. Voor pre-training laat de rat vanaf het uiteinde van een van het centrum armen (bijvoorbeeld S arm) en zet het doel platform aan het uiteinde van een van de hoek armen (bijvoorbeeld NE), dan geeft de ratten 4 opeenvolgende 60 sec studies waarin om het doel platform.
2. Bij het bereiken ontsnappingsplatform, zodat de rat om daar te wachten op 15 sec, zodat zij kunnen rusten en de omgeving te observeren. Ongeacht de startpositie, altijd blokkeren de andere arm met een transparante guillotinedeur, die verhindert dat.
   LET OP: Tijdens de pre-training, laat het water transparant, en stel het platform hijechts zodanig dat het uitsteekt 1 cm boven het wateroppervlak, waardoor het zichtbaar voor de rat.
3. Voer dagelijks training bestaat uit maximaal 4 opeenvolgende proeven gescheiden door een 10 seconden spleet minimaal (discrete training, dat wil zeggen, met tussenpozen van enkele minuten tussen de proeven, is een alternatief).
4. Voor training, verplaatsen van het platform van de vooraf trainingspositie de gekozen arm (bijvoorbeeld NW), en onderdompelen aan zijn uiteinde 1 cm onder het wateroppervlak. Nu maken het water ondoorzichtig door toevoeging van melk macht en voert u de volgende training (hoofdstuk 4).
5. Voor ratten die niet het doel platform binnen 60 sec niet bereiken, ze terug naar de startpositie, en zachtjes begeleiden ze naar het platform door de experimentator.
6. Meet meerdere variabelen tijdens de training en probe te registreren, zoals, afstand zwommen latency doel arm / platform, tijd doorgebracht in elke arm, alsmede het aantal initiële / herhalend fouten (zie figuur2). Houd in gedachten dat wachttijden kunnen worden beïnvloed door motorische problemen. In voorkomend geval, de afstand en fouten verschijnen als betrouwbaarder variabelen over cognitieve prestaties.
7. Allocentric Strategie Training:
   1. Dag 1 - Pre-Training:
      1. Laat melkpoeder niet toevoegen voor deze stap. Plaats ontsnapping platform uitsteekt 1 cm boven het wateroppervlak op een vaste locatie. Trein ratten in 4 opeenvolgende proeven om het platform te bereiken.
   2. Dagen 2-5 - Training:
      1. Voeg 250 g magere melkpoeder aan het water om het ondoorzichtig maken. Verplaats het platform naar een andere arm (bijvoorbeeld van NE naar NW) en voeg water toe zodat het platform is 1 cm onder het wateroppervlak. Vrijgeven ratten ofwel het N of S arm onvoorspelbare sequenties voor elke sessie, zodat beide armen dubbel worden gebruikt als proefgebieden start in een enkele zitting (4 trials / dag, bijvoorbeeld SNNS, NSNS; zie figuur 3).
   3. Dag 6 - Probe Sessie:
      1. Verwijder platform voor de sonde proef. Laat ratten een andere arm die tijdens training (bv SW) en laat ze zwemmen 60 sec. Zie figuur 4 voor representatieve zwemmen tracks. Analyse van de tijd doorgebracht op het doel arm (voormalige locatie van het platform) geeft een indicatie over of ratten gebruikt een ruimtelijke strategie, een dergelijke strategie, een sequentiële combinatie van verschillende strategieën (zie hieronder), of een ongeorganiseerde zoekpatroon.
8. Egocentrische Strategie Training:
   1. Dag 1 - Pre-Training:
      1. Dit is hetzelfde als de eerste stap in de allocentric strategietraining (stap 4.1). Laat melkpoeder niet toevoegen voor deze stap. Plaats ontsnapping platform uitsteekt 1 cm boven het wateroppervlak op een vaste locatie. Trein ratten in 4 opeenvolgende proeven om het platform te bereiken.
   2. Dagen 2-5 - Training:
      1. Voeg 250 gmagere melkpoeder aan het water om het ondoorzichtig maken. Beweeg het platform naar een andere arm en voeg water zodat het platform 1 cm onder het wateroppervlak. Vrijgeven ratten van dezelfde start arm (S of N; zie figuur 5) voor elke proef (proeven 4 / dag).
   3. Dag 6 - Probe Sessie:
      1. Verwijder platform voor de sonde proef. Ratten worden vrijgemaakt uit een arm anders waar tijdens de training vrijgegeven. Laat de ratten zwemmen 60 sec. Blokkeer de andere arm met een transparante guillotinedeur.
         OPMERKING: Wijzig de bovenstaande training strategieën volgens de eisen van het betreffende experiment, bijvoorbeeld, testen Drug Effects etc.
9. Droog de rat met absorberende handdoeken na elke sessie in het water.

5. Analyse

1. Voer metingen van latencies, de initiële en herhaalde fouten, de eerste keuzes en het type reactie toestlly door het opnemen van deze variabelen van de video uit de overhead camera.
2. Anderzijds indien beschikbaar, gebruik commercieel verkrijgbare video tracking software en geconfigureerd voor deze variabelen automatisch opnemen.
3. Statistische Analyse:
   NB: De specifieke implementatie van de statistische analyse is afhankelijk van de studie, die plaatsvindt.
   1. Voer een één, twee of drie-weg ANOVA's met betrekking tot de initiële / repetitieve fouten, latency tot doel arm / platform, en de tijd doorgebracht in het doel arm; met factoren die de testdag en behandelingsgroep (s) bevatten.
   2. Waar nodig, volgt u deze ANOVA met post-hoc Newman-Keuls meerdere vergelijkingen testen. Om prestaties te vergelijken, gebruikt een referentiewaarde (bijvoorbeeld de tijd doorgebracht op het doel arm tijdens een probe proef versus kansniveau) regelen en t-test.
   3. Indien nodig, gebruik maken van niet parametrische statistiek in aanvulling (bijv χ², zie hieronder) of in plaats wanneer de omstandigheden voor PARAMETric degenen die niet zijn vervuld.

Results

Egocentric Learning Strategy

Een studie werd uitgevoerd om te bepalen of de gekozen geheugen strategie bij ratten veranderingen gebaseerd op veranderingen van hun perspectief van externe omgevingsfactoren, na een egocentrisch-learning paradigma ^25. Ratten werden getraind in 4 dagen (4 trials / dag) om een doel arm zich op NE bereiken en werden vervolgens getest op de vijfde dag met een misleidende probe proces, waarbij de start arm was ofwel verplaatst 60 cm naar links (dat wil z...

Discussion

Reacties op Study Design and Analysis

Sinds opzet, heeft een dubbele-H doolhof is gebruikt in een aantal gedragsexperimenten bij ratten die gezamenlijk zijn ontworpen egocentrische en / of allocentric respons studie in ratten onder normale ^24,25 en veranderde ^26-29 hersentoestanden. Deze laatste studies omvatten striatale deep-hersenstimulatie (DBS) ^26, diermodellen van neurologische aandoeningen ^27,28, en bilaterale deactivaties verschillende cortico...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ratten of Muizen	Charles River
Handdoeken voor drogen	Universitair Ziekenhuis		1 / dier
Water			~200 L / dag
Magermelkpoeder	Supermarkt		250 g / 200 L water
Tuinslang	Hardwarewinkel
Drogeraad voor handdoeken	Hardwarewinkel
Kinect-camera	Kinect
PC-computer	elke
[header]
Double H Maze, (plexiglas) (Op maat gebouwd)
Externe zijwanden, 1600 × 350 × 6 mm			2
Interne zijwanden, 706 × 350 × 6 mm			8
Centrale gangpanelen, 500 × 350 × 6 mm			4
Armuiteinden, 188 × 350 × 6 mm			6
Gillotinedeuren, 187 × 350 × 6 mm			3
Uiteindendekkingen, 200 × 250 mm			6
Dwarsbalken, 200 × 40 mm			6
[header]
Double-H Maze Platform (te ballasteren) (Op maat gebouwd)
Metalen platform, 100 mm diameter × 150 mm			2
Platformdeksel, 100 mm diameter × 6 mm			2