We ontwikkelden een in vitro model van dormantie in het beenmerg voor oestrogengevoelige borstkankercellen. Het doel van dit protocol is om het gebruik van het model aan te tonen voor de studie van de moleculaire en cellulaire biologie van dormantie en voor het genereren van hypothesen voor verder testen in vivo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De studie van borstkankerdormantie in het beenmerg is een uiterst moeilijke onderneming vanwege de complexiteit van de interacties van inactieve cellen met hun micro-omgeving, hun zeldzaamheid en het overweldigende overschot aan hematopoëtische cellen. Hiertoe hebben we een in vitro 2D clonogene model van dormantie ontwikkeld van oestrogengevoelige borstkankercellen in het beenmerg. Het model bestaat uit een paar sleutelelementen die noodzakelijk zijn voor dormantie. Deze omvatten 1) het gebruik van oestrogengevoelige borstkankercellen, die het type zijn dat waarschijnlijk voor langere perioden inactief blijft, 2) incubatie van cellen bij clonogene dichtheid, waarbij de structurele interactie van elke cel voornamelijk met het substraat is, 3) fibronectine, een belangrijk structureel element van het beenmerg en 4) FGF-2, een groeifactor die overvloedig wordt gesynthetiseerd door beenmergstromacellen en sterk wordt afgezet in de extracellulaire matrix. Cellen die met FGF-2 zijn geïncubeerd, vormen na 6 dagen inactieve klonen, die bestaan uit 12 of minder cellen die een duidelijk vlakke verschijning hebben, significant groter en verder uitgespreid zijn dan groeiende cellen en grote cytoplasma tot nucleaire verhoudingen hebben. In tegenstelling daarmee vormen cellen die zonder FGF-2 zijn geïncubeerd voornamelijk groeiende kolonies bestaande uit >30 relatief kleine cellen. Verstoringen van het systeem met antilichamen, remmers, peptiden of nucleïnezuren op dag 3 na incubatie kunnen significante effecten hebben op verschillende fenotypische en moleculaire aspecten van de inactieve cellen na 6 dagen en kunnen worden gebruikt om de rollen van membraan-gelocaliseerde of intracellulaire moleculen, factoren of signaalroutes op de inactieve toestand of overleving van inactieve cellen te beoordelen. Ondanks het herkennen van de in vitro aard van de test, kan het fungeren als een zeer nuttig hulpmiddel om significante informatie te verkrijgen over de moleculaire mechanismen die noodzakelijk zijn voor het vestigen en overleven van inactieve cellen. Deze gegevens kunnen worden gebruikt om hypothesen te genereren die moeten worden getest in in vivo modellen.
Inleiding
Borstkanker metastaseren naar het beenmerg voordat de ziekte detecteerbaar 1, zodra kleine kankers bloedvaten 2,3. De metastatische proces is snel, maar inefficiënt. Cellen voer de nieuwe bloedvaten snel, met miljoenen per dag 4, maar enkele overleven de reis naar verre organen 5. Niettemin zijn sommige micrometastasen overleven in het bot en kan worden gevonden als enkelvoudige cellen of kleine celklonten in beenmergaspiraten van nieuw gediagnosticeerde patiënten 1. Deze cellen weerstaan adjuvante chemotherapie, die wordt toegediend voor het doel van het elimineren van hen 6. Deze weerstand is begiftigd, aanzienlijk, door de overleving signalering geïnitieerd door interacties met de beenmerg micro-omgeving 7,8. Micrometastasen te vinden bij ongeveer een derde van de vrouwen met gelokaliseerde borstkanker brengen en een onafhankelijke indicator van overleving bij analyse van univariate analyse 9. Sommige micrometastases zijn groei geïnitieerd, maar herhaling patronen afhankelijk van het type cel. Patiënten met triple negatieve borstkanker steeds terug komen tussen 1-4 jaar, wat suggereert slechte controle over de rusttoestand. Andere celtypen, waaronder ER / PR + cellen, tot 20 jaar slapend blijven, met een stationair continu recidief 10. Terwijl verschillen in slaaptoestand genexpressie handtekeningen tussen ER + en ER borstkanker cellijnen en tumoren weerspiegelen verschillende slaaptoestand potentials 11, interacties met beenmerg stroma waarschijnlijk betekenen een belangrijke bijdrage aan de kiemrust.
De studie slaaptoestand in vivo is buitengewoon moeilijk, omdat micrometastasen zeldzaam en worden overtroffen door hematopoietische cellen met meer dan 10 6-voudige. Daarom moet relevante modellen worden gegenereerd die voorzien in vitro data die mechanismen kunnen suggereren en het genereren van toetsbare hypothesen in vivo. Een aantal slaaptoestand modellen, waaronder matheuitkraging modellen 12,13, in vitro modellen 7,8,14,15, in vivo xenograft modellen 16 combinaties van in vitro en xenograft modellen 17,18 en spontane tumoren en metastase model 19, hebben enig inzicht in kankercel rusttoestand 20 opleverde . Elk van deze modellen hebben hun eigen beperkingen en zijn van zichzelf vooral nuttig voor het genereren van hypothesen over moleculaire signalering en interacties die bepalen slaaptoestand te testen in meer biologisch relevante modellen.
Met het algemene doel van het definiëren van de moleculaire mechanismen van slaaptoestand, de interacties met de micro-omgeving die resulteert in cyclus arrest, redifferentiatie en therapeutische weerstand en mechanismen die leiden tot een herhaling in ER + cellen, we een in vitro model dat zorgt voor geselecteerde relevante elementen van de ontwikkelde stromale micromilieu 7. Dit model, terwijl relatief schaars in zijn componenten, voldoende robuust is om onderzoekers mogelijk om specifieke moleculaire mechanismen die significant functies slaaptoestand invloed afleiden. Deze experimenten genereren hypotheses die direct kunnen worden getest in vivo. Het model is gebaseerd op een aantal belangrijke elementen die we aangetoond relevant rusttoestand zijn. Zij omvatten het gebruik van oestrogeen-afhankelijke borstkanker cellen, kweken van cellen in een klonale dichtheid waar hun interactie primair bij de ondergrond en oplosbare bestanddelen van het medium, een fibronectine substraat en de aanwezigheid van basische fibroblast groeifactor (FGF-2) in het medium.
We kenmerk mechanismen die het systeem regelen in vitro, waaronder de inductie van celcyclus arrestatie door FGF-2 21, gemedieerd door TGFp 22, overleving signalering door PI3 kinase ERK 7,8 tot 8 en morfogene differentiatie epitheliale fenotype, dat op afhing RhoA inactivering integrine45, 5β1 opregulatie en ligatie van stromale fibronectine voor overleving 7,15 (figuur 1). De in vitro celcyclus effecten van FGF-2 aan MCF-7 cellen beginnen bij concentraties ten minste één log dan 10 ng / ml 21,23. De grondgedachte was gebaseerd op de temporele controle van FGF-2 expressie betreffende mammaire ductale morfogenese, cyclische expansie en recessie in een aantal zoogdiersystemen 24-27. We toonden aan dat FGF-2 induceert, waaronder ductale morfogenese in 3D cultuur 28 en dat FGF-2 expressie algemeen verloren maligne transformatie van humane tumoren 29. De expressie van FGR1 bleef intact in borstcarcinomen ondervraagde 29 en MCF-7 cellen blijven alle 4 FGF-receptoren 30 te drukken. In de context van de slaaptoestand, is FGF-2 werd uitgevoerd door en zwaar afgezet op beenmerg stroma 31,32 wanneer het functioneert in het behoud van hematopoietische stamcellen 33. We demonstrated dat FGF-2 leidt tot een slapende toestand in ER + borstkankercellen gekweekt op fibronectine substraten, ook overvloedig in het beenmerg, waar het induceert morfogenisch differentiatie 7. In het model borstkankercellen zijn groei geremd, inactiveren Rho A via RhoGap GRAF, redifferentiate een epitheliaal fenotype en re-express integrinen α5β1 lost met maligne progressie. Ze binden fibronectine door middel van integrine α5β1 en activeer survival signaleren dat ze bestand zijn tegen cytotoxische therapie 7,8,15 (figuur 1) te maken. Remming van Rho GTPases klasse is eerder aangetoond dat een slapende fenotype 34 induceren.
Hier zullen we de specifieke procedures die onderzoekers zullen toelaten om het model vast te stellen en te bestuderen specifieke moleculaire en cellulaire mechanismen die rustperiode van ER + borstkankercellen schetsen. In de experimenten die hier ter illustratie van het gebruik van het modelWij gerichte PI3K (Figuur 1B) met een Akt-remmer en een PI3K remmer en alle leden van de Rho familie (Figuur 1B) met een pan-Rho inhibitor en een Rho kinase (ROCK) inhibitor.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Klonale Assay
- Bereid een enkele cel suspensies van oestrogeen-afhankelijke borstkanker cellijnen MCF-7 en T47D cellen met behulp van de onderstaande stappen
- Zuig het kweekmedium (DMEM / 10% door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum / glutamine en pen / strep) uit een 10 cm weefsel kweekplaat die niet meer dan 50% confluent met MCF-7 en T-47D-cellen. Spoelen met PBS. Incubeer met 0,25% trypsine / 2,21 mM EDTA opgelost in DMEM hoog glucose bij 37 ° C gedurende 1-4 min.
- Controle cellen op 1 minuut intervallen onder een fasecontrastmicroscoop een enkele cel verdeling ontstaat. Resuspendeer de cellen met een pipet 2 ml door pipetteren en neer meerdere malen verstoren cel-cel contact tot een bijna onveranderlijk enkel statuscel bereiken.
- Blijf cellen incuberen in trypsine bij 37 ° C gedurende 4 minuten als je klompjes cellen waarnemen na slechts 2 min incubatie. Heeft deze cellen voor Monogene studies niet gebruiken als ze aanhanger e blijvenandere na 4 min van trypsinisatie ach, omdat fout zal in de kolonie aantal opbrengst worden ingevoerd.
OPMERKING: Indien cellen samengeklonterd, wordt het aantal gevormde kolonies het product van minder cellen dan het aantal geïncubeerd weerspiegelen. Als cellen overmatig worden getrypsiniseerd, hun clonogene potentiaal verminderd. - Bereid een enkele celsuspensie van 1500 cellen / ml kweekmedium voor 24 putjes of minder (+ 500 cellen / ml, afhankelijk van het celtype of passage nummer) door seriële verdunningen in een master buis met het gehele volume nodig voor alle variabelen in het experiment.
Opmerking: Het doel is een uiteindelijke celdichtheid van 800 cellen / cm 2 (bereik van ongeveer 500 tot 1100 cellen / cm2). Het doel is om ongeveer 100 + 50 kolonies verkregen, die relatief eenvoudig tellen toelaat, voorkomt crowding en voldoende kan kolonies tot significante statistische verschillen wanneer kolonies worden verhoogd of verlaagd met experimentele perturbaties.
- Incubeer cellen op Klonale Density Met behulp van onderstaande stappen
- Incubeer cellen in viervoud putjes on 24 goed fibronectine beklede platen bij een dichtheid van clonogene 1500 cellen / well van een meester enkele celsuspensie tube 1.500 cellen / ml. Vermaal het medium dat cellen met een pipet 5 ml door het opstellen van 3 ml en het doseren van 1 ml medium in elk van 2 waterputten.
OPMERKING: fibronectine beklede platen worden gekocht pre-coated van een commerciële leverancier. Coating platen buiten een kwaliteitscontrole, geautomatiseerd proces resulteert in een ongelijk oppervlak ongeschikt voor deze assay. - Meng de schorsing door en neer te pipetteren met een pipet 5 ml, opstellen 3 ml celsuspensie en vul 2 putten met elk 1 ml. Fill slechts 2 wells per keer van de ene pipet. Zet de resterende volume in de pipet om de celsuspensie in de master buis, resuspendeer cellen weer door en neer te pipetteren en het opstellen van een 3 ml aan een andere 2 wel te vullenls met elk 1 ml.
OPMERKING: Continue menging van de master buis is noodzakelijk, omdat cellen continu zal sediment. Het opstellen van voldoende volume om slechts 2 putten te vullen is het noodzakelijk om soortgelijke cel aantallen aan elk putje toevoegen omdat cellen sediment in de pipet ook. - Werk snel tot grote hoeveelheden cellen te verdelen, omdat waardoor cellen te zitten in suspensie bij kamertemperatuur en CO 2 concentratie zal de clonogene potentiaal (ongepubliceerde observaties) moduleren.
- Optimaliseren van de ruimtelijke verdeling van de cellen tijdens de handeling van het pipetteren hen in putten voor kolonie assays. Doe dit door langzaam pipetteren de suspensie die de uiteindelijke celconcentratie in het midden van de put. Laat de plaat om de beweging verder niet bloot voordat de cellen naar de bodem. Niet zwenk de plaat omdat cirkelvormige vermenging effectief Centrifugeer de cellen aan de omtrek van de put het hoge celdichtheden en ontelbare confluente kolonies 6 dagen.
OPMERKING: indien noodzakelijk niet mengen want dit is minder wenselijk dan geen vermenging helemaal na de introductie van het volume met de cellen in suspensie. Indien het noodzakelijk is om cellen te mengen, doen aan door de plaat heen en weer loodrechte richtingen, terwijl daarvoor een vlakke ondergrond. - Incubeer de cellen bij 37 ° C 5% CO 2 zonder media verandering voor 6 dagen. Het kleine aantal cellen in een goed na 6 dagen niet significant zal invloed hebben op de nutriënt of cytokine samenstelling of de pH van het oorspronkelijke medium.
- Ontwerp van het tijdsverloop van de assay als volgt: Incubeer cellen aan fibronectine gecoate substraten op dag 1. Vervang bestaande medium met 1 ml vers medium en vers medium dat FGF-2 10 ng / ml op dag 0. Stain cellen op dag 6 als hieronder in 1.4). Gedrag elke experimentele storingen op dag 3, zoals hieronder in 1.3).
- Incubeer cellen in viervoud putjes on 24 goed fibronectine beklede platen bij een dichtheid van clonogene 1500 cellen / well van een meester enkele celsuspensie tube 1.500 cellen / ml. Vermaal het medium dat cellen met een pipet 5 ml door het opstellen van 3 ml en het doseren van 1 ml medium in elk van 2 waterputten.
- Set Up Experimentele Verstoringen van Molecular Signaling of adhesiemoleculen
- Op dag 3, voeg 10056, l van een oplossing die 10x van de uiteindelijke beoogde concentratie van het verstorende middel aan het 1 ml medium in de putjes. Niet mengen. Blijf de cellen te incuberen bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende nog 3 dagen.
OPMERKING: verstorende stoffen kunnen omvatten een scala van remmers en blokkerende middelen van adhesie moleculen, receptoren of andere oppervlakte-eiwitten, remmers van intracellulaire signaalroutes, moleculen, factoren, co-factoren of structurele eiwitten, die rol kunnen spelen in het ondersteunen van de slapende toestand. - Stain kolonies op dag 6 als volgt.
- Op dag 3, voeg 10056, l van een oplossing die 10x van de uiteindelijke beoogde concentratie van het verstorende middel aan het 1 ml medium in de putjes. Niet mengen. Blijf de cellen te incuberen bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende nog 3 dagen.
- Stain Kolonies
- Stain cellen na 6 dagen in kweek met een vers bereide 0,1% kristalviolet in 2% ethanol / 10 mM natriumboraat (pH 9,0) oplossing. Zuig media en voeg een ml kristalviolet oplossing in elk putje gedurende 20 min.
- Spoel de platen door onderdompeling ze met de goed openingen naar beneden in een scherpe hoek in een ijs emmer vol met continu lopende kraanwater in de gootsteen. Kantel de plaat naar een horizontale hoek eenmaal onder water, ook het openen naar beneden, en dan kantelen terug naar een scherpe hoek bij het verwijderen in een zachte vloeiende beweging.
- Herhaal de onderdompeling 2 of 3 totdat het water op de bodem van de putjes niet langer blauw. Krachtige wassen kunnen cellen of kolonies die minder hechtend wijten aan experimentele interventie verwijderen, aanzienlijk bijdraagt aan de fout in het tellen en de gegevens.
- Droge platen 's nachts door ze ondersteboven op handdoeken op de bank top grenzend aan hun corresponderende label covers.
- Count Kolonies
- Tel het aantal groeiende en slapende kolonies in elk putje na 6 dagen incubatie kleuring en drogen. Telling kolonies optimaal bij een vergroting van 40x op een omgekeerde fase contrast microscoop. Telling kolonies van> 30 cellen groeien en kolonies van 12 of meer cellen met morfologische tekenen van zeer grote omvang in vergelijking met groeiende cellen, grote expanded cytoplasma met grote cytoplasma verhoudingen, getoond in figuur 1 7,15 kern.
OPMERKING: Clusters van 13-29 cellen normaal geteld zij niet zeer frequent in eenvoudige kiemrust assays. Ze kunnen worden geteld als verstoringen verschuiven van het groeipotentieel van zowel groeien of slapende cellen. Deze resultaten zullen dan moeten worden gecorreleerd met biologische betekenis.
- Tel het aantal groeiende en slapende kolonies in elk putje na 6 dagen incubatie kleuring en drogen. Telling kolonies optimaal bij een vergroting van 40x op een omgekeerde fase contrast microscoop. Telling kolonies van> 30 cellen groeien en kolonies van 12 of meer cellen met morfologische tekenen van zeer grote omvang in vergelijking met groeiende cellen, grote expanded cytoplasma met grote cytoplasma verhoudingen, getoond in figuur 1 7,15 kern.
2. Klonale Incubatie Immunofluorescentie studies
- Pas celaantallen ongeveer 7,500-8,000 cellen / putje in 6-puts platen, overeenkomen met nummers / oppervlaktegebied analoog aan 24 goed cel experimenten.
- Plaats een ronde, steriel, met fibronectine gecoate dekglaasje in elk putje voet van 6 goed platen voor imaging studies voorafgaand aan de cel toevoeging. Pipet cellen in 3 ml volumes in elk putje 2 wells per keer bij concentraties uiteengezet, zoals beschreven voor de clonogene experimenten beschreven in 1.2).
- Incubeer cellengedurende 6 dagen, zoals beschreven in 1.2.4 en 1.2.5. Voeg verstorende factoren op dag 3 10x concentraties in 300 gl volumes, zoals beschreven in de kolonie testprocedures in 1,3).
- Stain cellen op dag 6 met antilichamen tegen adhesiemoleculen cel zoals integrinen α4, α5, α6, β1, β3 bijvoorbeeld focal adhesion molecules complex FAK, paxillin en vinculin bijvoorbeeld eiwitten betrokken bij motiliteit zoals α-tubuline, bijvoorbeeld, signaling pathway leden, zoals fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, bijvoorbeeld, of elk ander eiwit dat het doelwit van onderzoek op zijn rol in slaaptoestand, onder toepassing van standaardtechnieken voor directe of indirecte immunofluorescentiekleuring.
- Verwijder dia's met een pincet dag 6. Fix in aceton / methanol 1: 1 op -20 ° C gedurende 20 min en de lucht drogen. Een alternatief fixatief, zoals paraformaldehyde kan worden toegepast, indien nodig. Permeabilize cellen met 0,1% Triton X-100, 0,1% natriumcitraat gedurende 2 min fof detectie van intracellulaire antigenen. Was de cellen met PBS.
- Voor indirecte immunofluorecence kleuring block objectglaasjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 5% BSA of met 10% pre-immuun serum van de soort waarin het tweede antilichaam was opgewekt.
- Incubeer overnacht bij 4 ° C met primaire antilichamen tegen adhesiemoleculen, focal complexe moleculen cel, signaling pathway leden of enig ander eiwit dat het doelwit van onderzoek op zijn rol in rusttoestand verdund specifieke verdunningen aanbevolen door de fabrikant in PBS 0,1% TRITON X -100.
- Was 3 maal met PBS. Incubeer dekglaasjes met fluorofoor geconjugeerde antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Als voorbeeld kan Alexa Fluor 488 Ezel anti-muis IgG antilichaam worden gebruikt om monoklonale primaire antilichamen te detecteren. Mount coverslips cel naar beneden op glasplaatjes met behulp van een antifade agent met Dapi. Sluit de perimeters met nagellak.
- Voor directe immunofluorescentie, het uitvoeren van de BSAblokkering zoals beschreven in 2.4.2), incubeer met fluorofoor geconjugeerd primair antilichaam overnacht bij 4 ° C. Was 3 maal met PBS. Incubeer de glaasjes met een antifade middel en Dapi en afdichting met nagellak.
- Cover slide trays met aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C voor imaging en fotografie op elk gewenst moment tot enkele weken later. Bekijk en foto cellen met behulp van een fluorescentie microscopische beeldvormende systemen uitgerust met een camera op 1000x.
- Voor fibrillair actine kleuring blok glaasjes in 1% runderserumalbumine (BSA) gedurende 30 min en incubeer in BODIPY FL-Phallacidin (groen) of Rhodamine phalloidin (red) bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Voeg een antifade middel en afdichting als hierboven.
3. Klonale Incubation voor Moleculaire Studies
- Western Blots
- Incubate ER + borstkankercellen MCF-7 of T47D op klonogene dichtheid van 20.000 cellen / 60 mm plaat en 50.000 cellen / 100 mm plaat op fibronectin-beklede platen bij 37 ° C in 5% CO 2.
- Incubeer cellen tegen iets hogere dichtheden van 75.000 cellen / 100 mm plaat voor moleculaire studies vereisen mg bedragen voor eiwit uit lysaten. Gebruik maximaal tien platen per experimentele punt om voldoende eiwitten te verzamelen voor moleculaire studies met behulp van Western blots of voor RNA-isolatie voor Northern vlekken.
- Cell nummer gel op basis van laden is een noodzakelijke aanvulling voor het vergelijken van eiwitexpressie in enorm verschillend formaat groeiende en slapende cellen. Verzamel cellen door trypsinizing en tel een portie in een hemocytometer in 0,2% trypan Blue voor de bereiding van lysaten voor Western blots in plaats van het afschrapen van de cellen met een enkele rand mes.
- Centrifugeer cellen bij 10.000 xg gedurende 2 minuten, verwijder media door aspiratie, voeg 200 ul lysisbuffer, ultrasone trillingen de cellen in lysisbuffer en bepaal de eiwitconcentratie.
- Bereken de hoeveelheid eiwit per cel door de eiwitopbrengst te delen door het aantal cellendat gegenereerd dat bedrag. Laad het lysaat in elk putje van afzonderlijke polyacrylamide gels die zowel a) equivalente hoeveelheden proteïne en b) -eiwit hoeveelheden die gelijk aantal cellen vertegenwoordigt. Ten minste 25 ug eiwit moet in elk geladen put.
Opmerking: Dit zal vergelijkingen tussen groeien en slapende cellen, die significant verschillend in grootte en eiwitgehalte (figuur 1) zijn mogelijk.
- Flowcytometrie
- Verzamel cellen van 100 mm platen door behandeling met trypsine, zoals bij 3,1 en geanalyseerd door middel van standaard fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) protocol gebruikmakend van primaire of secundaire immunofluorescente kleuring voor intracellulaire of extracellulaire antigenen, zoals beschreven in 2.4.
Opmerking: Het losmaken cellen uit weefsel kweekplaten door trypsinisatie beïnvloedt de concentratie van membraaneiwitten zoals bepaald door antilichaam labeling.
- Verzamel cellen van 100 mm platen door behandeling met trypsine, zoals bij 3,1 en geanalyseerd door middel van standaard fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) protocol gebruikmakend van primaire of secundaire immunofluorescente kleuring voor intracellulaire of extracellulaire antigenen, zoals beschreven in 2.4.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Experimenten werden uitgevoerd om de test herhalen. Het tijdsverloop van het experiment wordt getoond in figuur 2A. Cellen worden geïncubeerd bij klonale dichtheid op dag -1, wordt FGF-2 in vers medium wordt toegevoegd op dag 0 en cellen worden gekweekt tot en met dag 6 als zij worden gekleurd en de kolonies worden geteld. Eventuele storingen aan het systeem toegediend op dag 3 in 100 gl volumes bij 10x eindconcentratie gewenst. Figuur 2B toont de typische uiterlijk teelt en slape...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ons model bestaat uit een aantal belangrijke onderdelen van latentie in het beenmerg. Het bestaat uit oestrogeen gevoelige cellen, waarbij de slapende soort dat in het merg langere tijd 10 tot overblijven, het bestaat uit fibronectine, een essentieel structureel element van het merg, FGF-2, een groeifactor overvloedig gesynthetiseerd door het beenmerg stroma en zwaar afgezet in de extracellulaire matrix van het beenmerg 31,32 en incubatie van cellen bij Monogene dichtheid waar hun interacties prima...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Ondersteund door het Ministerie van Defensie Grants DAMD17-01-C-0343 en DAMD17-03-1-0524, de New Jersey State Commissie over Cancer Research 02-1140-CCR-E0 en de Ruth Estrin Goldberg Memorial for Cancer Research (RW)
Dankbetuigingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| MCF-7 cellen | ATCC | HTB-22 | |
| T47D cellen | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectine 24 Well Clear Flat Bottom TC-Behandelde Multiwell Plate | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectine 60 mm Cultuurschalen | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectine 100 mm Cultuurschalen | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Glas Dekglas met een uniforme toepassing van humaan fibronectine | Corning | 354088 | |
| 6 Well weefselkweekplaat | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Gemodificeerd Eagle Medium Hoog Glucose 10X Poeder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Hitte-inactiveerd, foetaal bovien serum | Serum Source International | FB02-500HI | |
| 0,25% Trypsine/2,21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Penicilline-Streptomycine Oplossing, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamine, 100x, Vloeibaar | Corning | 25-005-CI | |
| Recombinant Humaan FGF basic | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
| Akt Remmer (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenische PI3K remmer |
| C3 transferase | Cytoskeleton | CTO3 | Remt RhoA, RhoB en RhoC, maar niet gerelateerde GTPases zoals Cdc42 of Rac1 |
| Y-27632 dihydrochloride | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Phallacidine (groen) | Molecular Probes | B607 | Fluorochroom voor fibrillaire actinekleuring |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (rood) | Molecular Probes | R415 | Fluorochroom voor fibrillaire actinekleuring |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Muis IgG Antilichaam, ReadyProbes Reagens | Molecular Probes | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant met DAPI | Molecular Probes | P-36931 |
Referenties
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al. Relative microvessel area of the primary tumour, and not lymph node status, predicts the presence of bone marrow micrometastases detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction in patients with clinically non-metastatic breast cancer. Breast Cancer Res. 7 (2), R210-R219 (1186).
- Wapnir, I. L., Barnard, N., Wartenberg, D., Greco, R. S. The inverse relationship between microvessel counts and tumor volume in breast cancer. Breast J. 7 (3), 184-188 (2001).
- Wyckoff, J. B., et al. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 60 (9), 2504-2511 (2000).
- Phadke, P. A., et al. Kinetics of metastatic breast cancer cell trafficking in bone. Clin Cancer Res. 12 (5), 1431-1440 (2006).
- Braun, S., et al. Lack of an effect of adjuvant chemotherapy on the elimination of single dormant tumor cells in bone marrow of high risk breast cancer patients. J Clin Onc. 18 (1), 80-86 (2000).
- Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin α5β1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer Res. 64 (13), 4514-4522 (2004).
- Najmi, S., Korah, R., Chandra, R., Abdellatif, M., Wieder, R. Flavopiridol blocks integrin-mediated survival in dormant breast cancer cells. Clin Cancer Res. 11 (5), 2038-2046 (2005).
- Braun, S., et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N England J Med. 353 (8), 793-802 (2005).
- Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Part 1), 4429-4434 (2007).
- Kim, R. S., et al. Dormancy signatures and metastasis in estrogen receptor positive and negative breast cancer. PLoS One. 7 (4), e35569(2012).
- Hanin, L. Seeing the invisible: how mathematical models uncover tumor dormancy, reconstruct the natural history of cancer, and assess the effects of treatment. Adv in Exp Med & Biol. 734, 261-282 (2013).
- Wilkie, K. P. A review of mathematical models of cancer-immune interactions in the context of tumor dormancy. Adv in Exp Med & Biol. 734, 201-234 (2013).
- Barkan, D., Green, J. E. An in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth. J Vis Exp. (54), e2914(2011).
- Barrios, J., Wieder, R. Dual FGF-2 and intergrin α5β1 signaling mediate GRAF-induced RhoA inactivation in a model of breast cancer dormancy. Cancer Microenvironment. 2 (1), 33-47 (2009).
- Ganapathy, V., et al. Luminal breast cancer metastasis is dependent on estrogen signaling. Clin & Exp Metastasis. 29 (5), 493-509 (2012).
- Barkan, D., et al. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68 (15), 6241-6250 (2008).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nat Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Marshall, J. C., et al. Effect of inhibition of the lysophosphatidic acid receptor 1 on metastasis and metastatic dormancy in breast cancer. J Nat Cancer Inst. 104 (17), 1306-1319 (2012).
- Almog, N. Genes and regulatory pathways involved in persistence of dormant micro-tumors. Adv in Exp Med & Biol. 734, 3-17 (2013).
- Wang, H., et al. Basic FGF causes growth arrest in MCF-7 human breast cancer cells while inducing both mitogenic and inhibitory G1 events. Cancer Res. 57 (9), 1750-1757 (1997).
- Fenig, E., et al. Role of transforming growth factor beta in the growth inhibition of human breast cancer cells by basic fibroblast growth factor. Breast Cancer Res Treat. 70 (1), 27-37 (2001).
- Fenig, E., et al. Basic fibroblast growth factor confers growth inhibition and Mitogen-activated Protein Kinase activation in human breast cancer cells. Clinical Cancer Research. 3 (1), 135-142 (1997).
- Coleman-Krnacik, S., Rosen, J. M. Differential temporal and spatial gene expression of fibroblast growth factor family members during mouse mammary gland development. Molecular Endocrinology. 8 (2), 218-229 (1994).
- Plath, A., et al. Expression and localization of members of the fibroblast growth factor family in the bovine mammary gland. J Dairy Science. 81 (10), 2604-2613 (1998).
- Lavandero, S., Chappuzeau, A., Sapag-Hagar, M., Oka, T. In vivo and in vitro evidence of basic fibroblast growth factor action in mouse mammary gland development. FEBS letters. 439 (3), 351-356 (1998).
- Sinowatz, F., Schams, D., Plath, A., Kolle, S. Expression and localization of growth factors during mammary gland development. Adv in Exp Med & Biol. 480, 19-27 (2000).
- Korah, R., Sysounthone, V., Scheff, E., Wieder, R. Intracellular FGF-2 promotes differentiation in T47-D breast cancer cells. Biochem Biophys Res Comm. 277 (1), 255-260 (2000).
- Korah, R., Das, K., Lindy, M. E., Hameed, M., Wieder, R. Co-ordinate loss of FGF-2 and laminin 5 expression during neoplastic progression of mammary duct epithelium. Human Pathology. 38 (1), 154-160 (2007).
- Wieder, R., et al. Overexpression of basic fibroblast growth factor in MCF-7 human breast cancer cells: lack of correlation between inhibition of cell growth and MAP kinase activation. J. Cellular Physiology. 177, 411-425 (1998).
- Brunner, G., Gabrilove, J., Rifkin, D. B., Wilson, E. L. Phospholipase C release of basic fibroblast growth factor from human bone marrow cultures as a biologically active complex with a phosphatidylinositol-anchored heparan sulfate proteoglycan. J Cell Biol. 114 (6), 1275-1283 (1991).
- Wilson, E. L., Rifkin, D. B., Kelly, F., Hannocks, M. J., Gabrilove, J. L. Basic fibroblast growth factor stimulates myelopoiesis in long-term human bone marrow cultures. Blood. 77 (5), 954-960 (1991).
- Gupta, P., McCarthy, J. B., Verfaillie, C. M. Stromal fibroblast heparan sulfate is required for cytokine-mediated ex vivo maintenance of human long-term culture-initiating cells. Blood. 87 (8), 3229-3236 (1996).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. Farnesyl transferase inhibitor treatment of breast cancer cells leads to altered RhoA and RhoC GTPase activity and induces a dormant phenotype. Int J Cancer. 129 (1), 61-69 (2011).
- Korah, R., Sysounthone, V., Golowa, Y., Wieder, R. Basic fibroblast growth factor confers a more differentiated phenotype in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Cancer Res. 60 (3), 733-740 (2000).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Tivari, S., Lu, H., Dasgupta, T., Wieder, R. Reactivation of dormant estrogen-dependent breast cancer micrometastases by bone marrow stromal injury in an in vitro model of dormancy. Proceedings of the 105th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research. , AACR. San Diego, CA. Philadelphia (PA). (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
