Eenvoudige tests voor het meten van ethanolgevoeligheid en snelle tolerantie bij Drosophila vergemakkelijken het gebruik van dit modelorganisme voor het onderzoeken van deze belangrijke ethanol-gerelateerde gedragingen. Hier wordt een relatief eenvoudige, schaalbare test beschreven voor het meten van ethanolgevoeligheid en snelle tolerantie bij vliegen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een goedkope, Scalable Behavioral Test voor het meten Ethanol Sedatie Gevoeligheid en Rapid Tolerantie in
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Alcoholgebruik stoornis (AUD) is een ernstig gezondheidsprobleem uitdaging. Ondanks een grote erfelijke component AUD, zijn weinig genen eenduidig betrokken bij hun etiologie. De fruitvlieg Drosophila melanogaster, is een krachtig model voor het verkennen van moleculair genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan alcohol gerelateerde gedrag en daarom bezit is van een grote belofte voor het identificeren en begrijpen van de functie van genen die AUD beïnvloeden. Het gebruik van het Drosophila model voor deze soorten onderzoeken afhankelijk van de beschikbaarheid van testen die gedragsreacties ethanol betrouwbaar te meten. Dit rapport beschrijft een test geschikt is voor de beoordeling van ethanol gevoeligheid en snelle tolerantie in vliegen. Ethanol gevoeligheid gemeten in deze assay wordt beïnvloed door het volume en de concentratie van ethanol gebruikt, verschillende eerder beschreven genetische manipulaties, en ook hoe lang het vliegen worden ondergebracht zonder voedsel ogenblik van de proef. Daarentegen ethanol sensitivity gemeten in deze test wordt niet beïnvloed door de kracht van vlieg behandeling, geslacht van de vliegen en suppletie kweekmedium met antibiotica of levende gist. Drie verschillende methoden voor het kwantificeren ethanol gevoeligheid beschreven uiteindelijk toe leidt kenmerken ononderscheidbaar ethanol gevoeligheid resultaten. De schaalbare karakter van deze test, in combinatie met de algehele eenvoud aan de set-up en de relatief lage kosten, maken het geschikt voor kleine en grote schaal genetische analyse van ethanol gevoeligheid en snelle tolerantie in Drosophila.
Inleiding
Alcoholgebruik stoornis (AUD) is een enorm gezondheidsprobleem wereldwijd (beoordeeld in 1). Hoewel de mechanismen die de ontwikkeling van AUD complex, deze aandoeningen hebben een belangrijke genetische component (bijvoorbeeld 2). De grote erfelijkheid van AUD en de geconserveerde gedragsreacties naar ethanol in heel veel soorten (beoordeeld in 3,4) sterke interesse in het gebruik van genetisch model organismen om de betrokkenheid van specifieke genen in-ethanol gerelateerd gedrag in de richting van een beter inzicht in de moleculaire basis van onderzoeken hebben gegenereerd AUD. De fruitvlieg Drosophila melanogaster, heeft ontpopt als een toonaangevende modelorganisme voor het verkennen van moleculair-genetische mechanismen van-ethanol gerelateerd gedrag (beoordeeld in 3,4). Studies in vliegt hebt gemarkeerd rollen voor verschillende signaalwegen in gedragsreacties om ethanol (beoordeeld in 5). Intrigerend sommige genen en pathways die gedragsmatige respons beïnvloedenes ethanol in vliegen zijn ook betrokken knaagdieren ethanol gerelateerd gedrag en / of menselijke AUD (bijvoorbeeld 6-14). Het behoud van mechanismen achter-ethanol gerelateerd gedrag alle species, in combinatie met de reeks genetische gereedschap in het Drosophila modelsysteem onderstrepen het nut van de fruitvlieg model voor onderzoek naar de genetica van gedragsreacties ethanol.
Gevoeligheid 15,16 en tolerantie (besproken in 17) tot ethanol bij de mens is verbonden met de ontwikkeling van AUD. Beide gedragsreacties ethanol kan worden gemodelleerd in vliegen via diverse laboratorium testen (besproken in 3,4). Alle van de vlieg assays die tot op heden zijn gebaseerd op ofwel tijdsafhankelijke-ethanol geïnduceerde sedatie / coördinatiestoornissen of tijdsafhankelijke herstel van ethanol sedatie.
In een vorig artikel uit onze groep op de genetica van ethanol gevoeligheid en rAPID tolerantie in Drosophila, een gedrags-test op basis van ethanol-damp geïnduceerde sedatie van vliegen werd gebruikt 18. Testen in deze test is geïnitieerd door het overdragen van live adult vliegt zonder verdoving om voedsel flesjes leeg, het vangen van de vliegen in de injectieflacons met een celluloseacetaat stekker, het toevoegen van ethanol naar de top (dat wil zeggen, niet-fly kant) van de cellulose-acetaat stekker, en het afdichten van de flacon met vliegen, celluloseacetaat plug en ethanol met een siliconen stopper (zie schema in figuur S3, referentie 18). Meerdere flacons die verschillende groepen vliegen werden beoordeeld in parallel, waardoor doorvoer van deze assay. Flesjes kregen een anonieme code en onderzoekers waren blind voor de behandeling groep om onbedoelde bias in de beoordeling van de sedatie te voorkomen. In een standaard experiment, vliegen in flesjes werden voorzichtig aangetikt 6 min intervallen en, na 30 seconden herstel, het aantal verdoofd vliegen in elk flesje werd geteld en Converted om procent actief vliegen. Vliegen geabsorbeerd ethanol damp uit het celluloseacetaat sluit een tijdsafhankelijke wijze, waardoor toenemende verhoging van interne ethanol 18 en sedatie (zie verwijzing 18 en figuur 1A en 1B in dit verslag). Sedatie in deze test werd operationeel gedefinieerd als vliegen (i) staan in de afwezigheid van wandelen of (ii) liggend op hun rug, met of zonder klapperen met hun vleugels. Hier wordt deze ethanol sedatie assay beschreven, verder operationele optimalisering te gebruiken relevant verstrekt, en de test wordt gebruikt om de bijdrage van voedingssupplement opties aan fly sedatie gevoeligheid pakken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Day Before Assay
- Verzamel ongedierte in vers voedsel flesjes in groepen van 11 (van hetzelfde geslacht) onder kort (1-5 min) CO 2.
- Laat vliegen om te herstellen O / N in voeding flesjes op een milieuvriendelijke gecontroleerde ruimte (meestal 25 ° C, 60% relatieve vochtigheid, 12 uur licht / donker-cyclus).
- Bereid ethanoloplossing (en) door verdunnen zuivere (100%) in ethanol gezuiverd (≥18 MQ) water tot eindconcentratie (s) voor de geplande experiment. Laat de oplossing (en) terugkeren naar kamertemperatuur O / N.
Opmerking: Verdunning ethanol is exotherm.
2. Dag van Assay
- Voor elke injectieflacon vliegen te testen, bereid (i) een schone, lege voedsel vial; wil zeggen een controle flesje, (ii) een nieuwe celluloseacetaat plug, (iii) een siliconen stop en (iv) 1 ml ethanol oplossing (zie tabel 3).
- Bereid testkamer door aanpassing temperatuur tot 20-25 ° C en relatieve vochtigheid van 55-65%.
- Hebben een andere werknemertoewijzen van een unieke code voor elke groep flesjes en noteer de code voor later. Plaats gecodeerd flesjes met vliegen in de testkamer te acclimatiseren voor een paar minuten.
- Label lege testen flesjes om codes op vlieg flesjes passen van 2,3.
- De bouw van een hard copy testen logboek door in een spreadsheet vergelijkbaar met tabel 1 het invoeren van de codes in kolommen (één kolom / flacon).
- Met behulp van de testen log als een gids, regelen gecodeerd voedsel flesjes met vliegen en lege testen flesjes in bijpassende arrays in de testkamer.
Opmerking: Een redelijk maximum aantal flesjes om te testen is 24 (dwz, 6 sets van 4 flesjes per stuk). - Transfer vliegt van voedsel flacons in geëvenaard / label leeg testen flesjes en steek onmiddellijk celluloseacetaat stekkers in het testen van flesjes tot celluloseacetaat stekkers zijn 2 cm onder de flacon toppen.
- Hierna behandelen elke rij van vier flesjes als een set bij gespreide 1 min intervallen.
- Voor de tijd 0 beoordeling, pakt elk flesje individueel wet duim en wijsvinger, tik zachtjes op de tafel drie keer om vliegen te kloppen op de bodem van de flacon, wacht 30 seconden en dan tellen het aantal vliegen die immobiel / dood zijn. Noteer het aantal immobiele / dode vliegen voor elk flesje op tijdstip 0 min in de hardcopy testen log.
- Start timer tellen voortdurend op tijdstip 0 en onmiddellijk beginnen met het toevoegen van 1 ml ethanol aan celluloseacetaat pluggen in de flesjes voor de eerste rij / set van 4 flesjes. Voeg 1 ml ethanol aan het celluloseacetaat pluggen in de flesjes bij 5 sec intervallen in de volgorde waarin ze worden getest. Ethanol Aan het celluloseacetaat pluggen in een cirkelvormige beweging, zodat de ethanol gelijkmatig geabsorbeerd gehele celluloseacetaat pluggen. Wanneer ethanol is toegevoegd aan alle 4 testen flesjes in de set, plaatst u een siliconen plug in elk flesje om het te verzegelen.
- Soms 1, 2, 3, 4 en 5 min, voeg 1 ml ethanol aan de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde sets van 4 flesjes resp. Doorgaan invoegen van siliconen stoppers nahet toevoegen van ethanol aan elke set van 4 flesjes.
- Op het moment 6 min, test de eerste set van 4 flesjes door grijpen iedere flacon met duim en wijsvinger, tikken zachtjes op de tafel drie keer om vliegen te kloppen op de bodem van de flacon, wacht 30 seconden en dan tellen en registreren van het totale aantal vliegen die worden verdoofd. Score vliegt als verdoofd als ze (i) op de bodem van de flacon staan, maar niet lopen of (ii) liggen op hun rug, met of zonder klapperen met hun vleugels.
- Behandel elk flesje in de set op 5 sec intervallen met behulp van het schema in tabel 2.
- Soms 7, 8, 9, 10 en 11 min, test de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde sets flacons, respectievelijk, zoals voor de eerste set.
- Op tijdstip 12 min, test de eerste set van 4 flesjes opnieuw zoals beschreven in 2.12 en verder testen van de tweede, derde, vierde, vijfde en zesde sets flacons 13, 14, 15, 16 en 17 min, respectievelijk.
- Verder testen vliegen zoals beschreven in 2.12 tot alle vliegen zijn sedated.
- Voer het totale aantal vliegen in elk flesje in de hard copy testen log. Censureren immobiel / dode vliegen op tijdstip 0 van het totale aantal vliegen.
- Bereken het percentage actieve vliegt bij elke meting tijdpunt en plot gegevens% actief vliegen (y-as) versus tijd (x-as). Kwantificeren ethanol sedatie door interpolatie Sedatie Time 50 waarden (ST50, tijd tot 50% sedatie) vanaf derdegraads polynoom of sigmoïdale curve fits of geraamd gebied onder de curve.
- Gegevens verzamelen van gedecodeerd flacons en statistische analyses uit te voeren (bijvoorbeeld, one-way ANOVA met Bonferroni meervoudige vergelijkingstest) in voorkomend geval voor de experimentele opzet.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De ruwe gegevens van het ethanol sedatie assay het aantal vliegen die gesedeerd als functie van ethanoldamp belichtingstijd. Ruwe gegevens worden omgezet naar het percentage actieve vliegen als functie van de tijd (primaire gegevens Figuren 1A, B, D - F). Gevoeligheid voor ethanol sedatie van de primaire gegevens kunnen worden gekwantificeerd zoals sedatie Time 50 (ST50), de tijd die nodig is voor 50% van vliegen tot verdoofd of aea onder de curve (AUC) worden via interpolatie van curve...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Ongecompliceerde testen die reproduceerbaar kwantificeren zinvolle fenotypes zijn van grote waarde voor de analyse van het gedrag. De hier beschreven werkzaamheden hebben betrekking op een aantal praktische aspecten van een test voor het meten van ethanol sedatie gevoeligheid en snelle tolerantie in Drosophila. Hoewel het niet een focus van dit werk, zijn gedragsanalyses bevorderd door het handhaven van het milieu en de genetische achtergrond constante voor proefpersonen in een studie. Bovendien moet vergelijki...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze onderzoeken werden ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse aan M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). De auteurs danken Jill Bettinger voor nuttige discussies en Jacqueline DeLoyht voor technische assistentie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| food vials | VWR | 89092-772 | smal |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | smal |
| silicone stopper | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| ethanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
Referenties
- Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
- Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
- Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
- Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
- Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
- Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
- Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
- Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
- Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
- Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
- Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
- Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
- Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
- Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
- Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
- Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
- Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
- Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
- Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
- Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
- Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
- Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
- Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541(2011).
- Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
- Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
- Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
