Ischemische-reperfusie (IR) schade is geassocieerd met een hoge mate van morbiditeit en mortaliteit. Het doel van het in vitro model van zuurstof-glucose deprivatie en reoxygenatie (OGD-R) dat hier wordt beschreven, is om de effecten van ischemie reperfusie schade op een verscheidenheid aan cellen te beoordelen, met name op endotheelcellen van de bloed-hersenbarrière (BBB).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Zuurstof-Glucose beroving en reoxygenatie als een
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ischemie-reperfusie (IR) letsel is bekend dat het een belangrijke bijdrage leveren aan de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met ischemische beroerte. Ischemische cerebrovasculaire accidenten zijn goed voor 80% van alle beroertes. Een veelvoorkomende oorzaak van IR schade is de snelle instroming van fluïda na een acute / chronische occlusie van bloed, voedingsstoffen, zuurstof aan het weefsel triggering de vorming van vrije radicalen.
Ischemische beroerte wordt gevolgd door de bloed-hersenbarrière (BBB) dysfunctie en vasogeen hersenoedeem. Structureel tight junctions (TJS) tussen de endotheelcellen spelen een belangrijke rol bij het handhaven van de integriteit van de bloed-hersenbarrière (BBB). IR letsel is een vroege secondaire verwonding leidt tot een niet-specifieke, inflammatoire reactie. Oxidatieve en metabole stress na ontsteking veroorzaakt secundaire hersenschade waaronder BBB permeabiliteit en verstoring van de tight junction (TJ) integriteit.
Ons protocol presenteert een in vitro </ Em> voorbeeld van zuurstof-glucose deprivatie en reoxygenatie (OGD-R) op de hersenen van de rat endotheelcellen TJ integriteit en de vorming van stress vezels. Tegenwoordig worden meerdere in vivo experimentele modellen worden gebruikt om de effecten van IR letsel te onderzoeken; maar ze hebben verschillende beperkingen, zoals de technische problemen bij het uitvoeren van operaties, gen afhankelijke moleculaire invloeden en moeilijkheden bij het bestuderen mechanistische relaties. Toch kan in vitro modellen helpen overwinnen veel van deze beperkingen. Het gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om de verschillende moleculaire mechanismen en mechanistische relaties bestuderen potentiële therapeutische strategieën. Echter, de resultaten van in vitro studies verschillen van de standaard in vivo studies en moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd.
Inleiding
Ischemie-reperfusie (IR) schade blijkt de frequente oorzaak van verschillende verzwakkende complicaties en sterfte geassocieerd met beroerte, myocardiaal infarct, trauma, perifere vaatziekte en hersentrauma 1,2 zijn. IR letsel in hersenvaten is een vroege secundaire verwonding leidt tot ontsteking en oedeem 3. Eén van de ernstige complicaties die optreedt als gevolg van oxidatieve en metabole stress na ontsteking verlies van homeostatische balans wat leidt tot vorming van vrije radicalen, veranderingen in de bloed-hersenbarrière (BBB) tight junctions (TJS) en microvasculaire permeabiliteit 4,5.
Momenteel....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Het zaaien van endotheelcellen
- Verkrijgen van primaire kweken van RBMEC's uit volwassen Sprague Dawley ratten (of in de handel te verkrijgen hen).
- Ontwikkel RBMECs in 100 cm fibronectine (50 ug / ml) beklede petrischaaltjes met ratten hersenen endotheelcel medium. Verander het medium elke twee dagen tot confluentie bereikt.
- Bij het bereiken van 80-90% confluentie voorzichtig wassen van de cellen in 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door zwenken. De cellen worden vervolgens losgemaakt door ze bloot te stellen aan 1 ml van 0,25% trypsine warme ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) -oplossing, geëquilibreerd tot 37 ° C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Cellen gekweekt op fibronectine voorbeklede Nunc II kamer dia's werden OGD-R onderworpen door het plaatsen in een Biospherix ProOx model 110 kamer. Na het onderwerpen van cellen aan OGD-R, werden ze bewerkt voor ZO-1 junctionele kleuring middels immunofluorescentie techniek zoals getoond in figuur 2 en cytoskelet samenstel aangeven F-actine vorming stress-vezels gebruikt rhodamine label phalloidin vlek zoals in figuur 3. Controle cellen die waren niet onderworpen aan OGD-R toonde vo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
OGD-R als een in vitro model voor ischemie-reperfusie schade is goed vastgesteld voor het bestuderen neuronen 10,11. Er zijn ook studies die het effect van OGD op de hersenen endotheelcellen en veranderingen in permeabiliteit en TJ integriteit 9. Echter, onze studie toont het effect van OGD en reoxygenatie, hetgeen nader weergave van ischemische reperfusieschade bij in vivo omstandigheden die na herseninfarct optreden.
Hypoxische-ischemische aandoening.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We erkennen Scott en White Ziekenhuis Research Grants Program voor financiële steun en de Texas A & M Health Science Center College of Medicine Geïntegreerde Imaging Laboratorium voor het gebruik van de confocale laser microscoop. Wij erkennen Mr Glen Cryer voor hulp bij manuscript uitgeven.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Proox model 110 | Biospherix | Model 110 | |
| DMEM, geen glucose | Gibco, Life technologies | 11966-025 | |
| Rhodamine Phalloidin | Life technologies | R415 | |
| ZO-1 Konijn Polyklonaal Antilichaam | Life technologies | 617300 | |
| Nunc Lab Tek II-CC 8 well steriele, glas schuifjes | Thermo scientific | 177402 | |
| FITC-gelabeld anti-konijn secundair antilichaam | Santa cruz | sc-2090 | |
| DPBS 1X | Thermo scientific | SH 30028.03 | Elk ander beschikbaar PBS kan worden gebruikt |
Referenties
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. Cell biology of ischemia/reperfusion injury. Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).
- Yang, X....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
