Morris Water Maze Test: Optimalisatie voor Mouse Strain en testomgeving

Summary

Dit manuscript beschrijft een Morris water maze (MWM) protocol dat is aangepast voor gebruik met een veelgebruikte muismodel van de ziekte van Alzheimer. De MWM wordt veel gebruikt in transgene muismodellen. Implementatie van een procedure die gevoelig is voor de achtergrondstam van het muismodel is essentieel voor het detecteren van verschillen tussen groepen.

Abstract

Het Morris water maze (MWM) is een veelgebruikt taak om hippocampaal-afhankelijk ruimtelijk leren en geheugen te beoordelen bij transgene muismodellen van ziekten, inclusief neurocognitieve stoornissen zoals de ziekte van Alzheimer. Echter, de achtergrondstam van het gebruikte muismodel kan een substantieel effect hebben op het waargenomen gedragsfenotype, waarbij sommige stammen een superieure leercapaciteit vertonen in vergelijking met andere. Om ervoor te zorgen dat verschillen tussen transgeen-negatieve en transgeen-positieve muizen kunnen worden gedetecteerd, is identificatie van een trainingsprocedure die gevoelig is voor de achtergrondstam essentieel. Het niet aanpassen van het MWM-protocol aan de achtergrondstam van het muismodel kan leiden tot onder- of overtraining, waardoor groepsverschillen in probe-trials worden gemaskeerd. Hier wordt een MWM-protocol beschreven dat is aangepast voor gebruik met de F1 FVB/N x 129S6 achtergrond. Dit is een veelgebruikt achtergrondras om de leeftijdsafhankelijke effecten van mutant P301L tau (rTg(TauP301L)4510 muizen) op de geheugenproblemen geassocieerd met de ziekte van Alzheimer te bestuderen. Ook wordt een strategie beschreven om opnieuw te optimaliseren, zoals gedicteerd door de specifieke testomgeving die wordt gebruikt.

Introduction

Transgene muismodellen zijn geweest bij het evalueren van de pathofysiologie van de ziekte van Alzheimer (AD), alsmede de mogelijke therapeutische interventies geweest. Cognitieve taken, zoals de Morris water maze (MWM), worden vaak in deze modellen om de moleculaire correlaten van geheugengebreken identificeren en werkzaamheid preklinische geneesmiddelen te beoordelen. Het is echter essentieel dat het dynamisch bereik van de cognitieve taak breed genoeg om subtiele behandelingseffecten te detecteren. Met muismodellen van AD, cognitieve tekorten zijn doorgaans leeftijdsafhankelijk, en muizen weer progressieve daling in de prestaties (bv ^1). Toepassing van een gevoelige cognitieve taak kan detecteren van subtiele verschillen mogelijk vroeger in het leven van het dier, waardoor de kosten van het verouderen dieren verminderen. Bijvoorbeeld, vermindering van het aantal training proeven in de hippocampus-afhankelijke Barnes doolhof 15-5 verhoogde de moeilijkheid van de taak, waardoor het detection van tekorten in de 3xTg model op een jongere leeftijd dan eerder gemeld ^2. Eerdere detectie van gebreken biedt niet alleen veel tijd en kostenbesparing, verhoogt ook de kans dat de onderliggende moleculaire veranderingen cognitieve defecten kunnen worden geïdentificeerd.

Eén factor die de gevoeligheid van cognitieve taken is de genetische achtergrond stam van het muismodel. Bijvoorbeeld, BALB / c-muizen vertonen superieure prestaties bij leren en geheugen taken vergeleken met andere stammen, zoals C57BL / 6 ^3. De F1 FVB / N x 129S6 achtergrond wordt gebruikt voor twee van de meest gebruikte modellen van AD, de Tg2576 en RTG (TauP301L) 4510 modellen. Deze stam vertoont een superieure leervermogen in de MWM ten opzichte van andere stammen, waaronder B6 / SJL muizen ^4. Door deze superieure leervermogen, kan het gebruik van één sonde na uitgebreide training groepsverschillen van de te veel training maskeren. Bovendien, de sensitivity van probe studies, kunnen leeftijd afhankelijk zijn. We hebben eerder aangetoond dat eerder probe trials, met een beperkte verborgen platform training, gevoeliger zijn verschillen bij jonge Tg2576 vergeleken met jonge transgene nestgenoot-negatieve controles dan zijn probe trials ingevoegd uitgebreidere training ^5. In tegenstelling, probe trials na uitgebreide training zijn gevoeliger bij oudere (20-25 maand) Tg2576 muizen in vergelijking met ouder littermates dan zijn eerdere sonde proeven ^5. Door her probe trials gedurende training wordt de kans dat een gevoelige proef wordt geïdentificeerd verhoogd, vooral als longitudinale testen uitgevoerd en de gevoeligheid van een bepaalde probe trial leeftijdsafhankelijke. Figuur 1 toont de superieure prestaties van F1 FVB / N x 129S6 muizen onder het protocol geoptimaliseerd voor deze stam in vergelijking met muizen van de B6 / SJL achtergrond opgeleid in het kader van een protocol met meer uitgebreide training.

De MWM isalgemeen gedacht om betrouwbare maatregelen die reproduceerbaar in zowel tijd en laboratoria ⁶ zijn voorzien. Zo werd het primaire protocol oorspronkelijk door ons laboratorium Minnesota ^1,7 succes uitgevoerd met ondergeschikte modificaties van West Virginia University ^8. Ook gelijkwaardige impairment werden waargenomen in RTG (TauP301L) 4510 muizen ten opzichte van nestgenoten controleren of gehuisvest onder pathogeenvrije of conventionele omstandigheden ^9. Echter, de testomgeving de gevoeligheid van de MWM taak beïnvloeden. Factoren zoals verlichting, ventilatieopeningen, temperatuurgradiënten en geluiden dragen allemaal bij aan omgevingsfactoren ⁴ die uiteindelijk de prestaties kunnen beïnvloeden. Wanneer onze Minnesota laboratorium vivarium werden verplaatst naar een nieuw gebouw, tot een vermindering van 38% wild-type prestatie werd waargenomen, het dynamisch bereik van de taak en het vermogen om transgene deficits detecteren aanzienlijk verminderen. Deze verandering in performance opgetreden ondanks het ontwerpen van de testkamer van dezelfde grootte en configuratie zijn, en dezelfde toegepaste visuele signalen. A "re-optimalisatie" van het oorspronkelijke protocol was nodig om het dynamisch bereik van de MWM taak in de nieuwe testomgeving verhogen.

Hier het oorspronkelijke protocol ontworpen voor gebruik met de F1 FVB / N x 129S6 achtergrond ⁵ wordt beschreven. Omdat sommige studies suggereren stress geassocieerd met slechte prestaties MWM ¹⁰ en pre-behandeling kan deze stress geïnduceerde tekorten verlichten uitvoering ¹¹ werd een pre-behandeling protocol ontworpen om de muizen om de invoering en verwijdering van de pool vóór MWM test wennen . Na de pre-handling, muizen zichtbaar platform training, waarin een verhoogd platform is gemarkeerd met een vlag te ondergaan. Zichtbare platform training wordt gebruikt om muizen te identificeren met performance problemen met betrekking tot sensomotorische afwijkingen. Met behulp van uitsluitingscriteria in de prot beschrevenocol sectie, performance-incompetente muizen worden verwijderd uit de daaropvolgende onderzoeken van verborgen platform training en probe trials. Stoornissen in verborgen platform training en probe trials worden geïnterpreteerd als cognitieve tekorten omdat sensomotorische prestaties wordt meegenomen uit de data. Na voltooiing van zichtbare platform training, muizen beginnen verborgen platform training waarbij het platform is ondergedompeld in water en blijft in dezelfde positie ten opzichte van externe stimuli. Proeven waarbij het platform wordt verwijderd (probe trials) worden gestrooid door verborgen platform training om de invloed van additionele training evalueren. Omdat probe trials voorkomen aan het begin van elke dag, zodat er extra verborgen platform training, probe trials meet het vermogen van het dier om de locatie van het platform na een 20 uur vertraging herinneren, als een maat voor referentie geheugen ^12. Tenslotte wijzen waarop deze oorspronkelijke protocol werd opnieuw geoptimaliseerd wanneer veranderingen in de testomgevingverstoord controle prestaties worden beschreven.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de normen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) en door West Virginia University's IACUC goedgekeurd.

1. Pre-handling

1. Set Up the Pool
   1. Prop de pre-behandeling pool zodat wordt verhoogd tot een comfortabele hoogte.
   2. Plaats 2 liter water (21 ° C) in de pre-behandeling van zwembad tot een niveau van ongeveer 1 cm.
      Opmerking: Weet kleuring niet toe.
2. Procedure
   1. Breng de muizen uit het terrarium naar de testkamer.
   2. Controleer het onderwerp identificatie (onderwerp nummer, staart tattoo, oor clip, enz.).
   3. Staart van het merk van de muis met een permanent marker om muizen te onderscheiden binnen de kooi die hebben ondergaan pre-behandeling testen van degenen die nog moeten worden getest. Markeer alle muizen in een kooi met dezelfde kleur.
   4. Plaats een muis in de overdracht beker voor approximately 5 sec. Dan, voorzichtig giet de muis uit de beker in de pre-handling zwembad.
   5. Met behulp van een timer, zodat de muis in de pool blijven 20 sec.
   6. Na 20 seconden, plaats voorzichtig het scoop (zonder vissen is) voor de muis. In het kort kan de muis om de primeur te verkennen, en indien nodig, aan te moedigen de muis op de primeur te krijgen door zachtjes te schuiven de primeur onder de muis terwijl langzaam tillen. Zorg ervoor dat u de muizen met de primeur schrikken.
   7. Zodra de muis is in de scoop, vervoeren terug naar het bedrijf kooi.
   8. Herhaal deze procedure voor elke muis in de kooi eenmaal per dag gedurende 10 dagen. Op regelmatige tijdstippen (bijvoorbeeld na elk dier), halen fecale boli en beddengoed van het zwembad met behulp van een net.
   9. Spoel de overbrenging bekerglas met water regelmatig (bijvoorbeeld na afloop van een kooi van muizen).
   10. Zodra deze stappen zijn voltooid, spoel de overdracht beker meerdere malen met water, dumpen water uithet zwembad, en spoel het zwembad ongeveer twee keer met water.

2. Zichtbaar Platform Training

1. Setup de muis Prestatie Tracking Software bv Viewer (zie tabel van Materials).
   1. Kalibreren van de video aan de afmetingen van het doolhof te passen onder het 'Configuratie' - "Filters en objecten" tab.
   2. Stel filters zodat de software een muis van de achtergrond kan differentiëren.
      1. Pas de "gevoeligheid" onder de "Achtergrond filter" gebied, zodat de tracking software identificeert het dier.
      2. Klik op de "accepteren" optie nadat de tracking software identificeert het dier. Kies de optie "bewerken" naar gebieden blackout buiten het doolhof gebied.
      3. Selecteer de juiste "dier filter" en "min. grootte dier ".
2. Het creëren van de Run Sheets
   1. Maak een run sheet notering elke muis, elke potentiële locatie, en een ruimte voor notities met informatie over afwijkend gedrag.
   2. Vooruit op locaties voor de zichtbare platform test die hetzelfde voor elke groep muizen. Aldus kan de eerste proef, pre-vaststellen dat het platform aan de zijde tegenover waar de muis is geplaatst in het labyrint, rechts nabij de wand wordt geplaatst. Voor de tweede proef, vooraf vastgesteld dat het platform op een andere locatie wordt geplaatst langs de achterwand van elke muis en dat blijft voor elk van de 6 proeven.
3. Set Up de kamer
   1. Hang gordijnen rond de kamer zodat eventuele ruimtelijke signalen worden verduisterd.
4. Stel de Tub.
   1. Plaats het bad, zodat het overeenkomt met de configuratie in de tracking software door te zorgen voor het doolhof overeen komt met de configuratie setup op de "Configuration" - tab "Zone Definition". Opmerking: Het hELPS om ervoor te zorgen het bad is op de juiste plaats voor het vullen met water als het bad is niet gemakkelijk verplaatst keer gevuld.
   2. Vul het bad met water uit de kraan, en met behulp van een thermometer, zorgen voor de temperatuur van het water is ongeveer 21 ° C. Zorg ervoor dat het water blijft binnen één graad van deze temperatuur gedurende het testen, zoals kouder water prestaties vooral van invloed kan zijn bij het ​​gebruik van verouderde muizen ^8.
      Opmerking: Weet kleuring niet toe.
   3. Met de vooraf bepaalde plaatsen, plaats het platform, die een gemonteerde vlag die een hoogte van 13 cm bereikt en is 4,5 cm x 4,5 cm met een bold "S" -vormige teken in reliëf op het, in de eerste plaats van de kuip heeft zodat het ongeveer 1 inch boven het oppervlak van het water.
5. Procedure
   1. Neem de eerste muis uit de kooi, controleren het onderwerp identificatie, markeert de staart met behulp van een permanent marker van de juiste kleur, en plaats in de beker.
   2. Plaats voorzichtig het mouse in het bad, start de timer, en ervoor zorgen dat de tracking software is het bijhouden van het dier. Laat de muis tot 2 minuten om het platform te lokaliseren. Zodra de muis lokaliseert het platform, zodat de muis 20 sec op het platform.
   3. Wanneer het dier vindt het platform en gaat springen of vallen, schep de muis en plaats de muis op het platform. Als de muis blijft springen of vallen van het platform, houdt de muis op het platform, zodat de muis leert dat achterblijft op het platform leidt tot ontsnappen uit het bad.
      Opmerking: De muis dient op het platform voor een gezamenlijke periode van 20 seconden blijven; Dus als de muis springt na 5 seconden, de resterende tijd van het platform 15 sec en niet opnieuw tot 20 sec.
   4. Wanneer de dieren niet het platform in de 2 minuten periode vinden schep de muis en plaats het op het platform 20 sec.
   5. Na 20 sec op het platform, verwijdert u de muis van het platform als gedaan in de pre-behandeling van training en plaats de muis in the verwarmde kooi vol met papieren handdoeken en opgewarmd tot ~ 31 ° C met een verwarmingselement en warmte lamp voor 30 sec. Periodieke beoordeling van de lichaamstemperatuur met een rectale thermometer te waarborgen dat bepaalde stammen van muizen of muizen die op een bepaalde leeftijd niet verschillend gevoelig voor onderkoeling geïnduceerd door blootstelling aan water.
   6. Na 2 minuten naar het bedrijf kooi met de verwarming lamp, de overdracht van de muis om de deelneming kooi met alleen een verwarming pad, maar geen warmte lamp, om te herstellen tussen de trials. Uiteindelijk, plaatst alle muizen uit één kooi in hetzelfde bedrijf kooi tijdens het testen.
   7. Reinig het doolhof van puin met een net na elke muis een proef heeft afgerond, tot olfactorische signalen verstoren.
6. Herhaal deze stappen voor elke muis in de groep. Na elke muis de eerste proef is afgerond, verplaatst het platform naar de tweede vooraf bepaalde locatie.
   Opmerking: Het platform op dezelfde locatie voor elke muis blijft tijdens een proces en zalverplaatst naar de andere voorafbepaalde locaties voor de daaropvolgende trials. Dit wordt gedaan om muizen 1) leren is een platform te ontsnappen, 2) zwemmen direct naar zichtbare platform, dus intacte visueel competentie demonstreren, en 3) geen motorische.
7. Voer deze procedures 6 trials voor de eerste 3 testdagen. Aldus voeren toegankelijk training op testdagen 1, 2 en 3, waarbij ongeveer 10 minuten tussen elke proef (figuur 2).
8. Tijdens toegankelijk platform training, gebruikt het dier tracking software te meten latentie om het platform te bereiken, volgen de padlengte van het dier, en zwemmen snelheid. Verkrijgen van deze metingen uit het tabblad onder "Experimental lijst" en export rechtstreeks "Water doolhof" naar een Excel-spreadsheet.
   Opmerking: het gebruik van een hand timer kan ook nuttig zijn om de nauwkeurigheid van de tracking software waarborgen.

3. Morris Water Maze Verborgen Platform Training

1. Set de kamer
   1. Hang gordijnen in de kamer om spatial cues verduisteren in het laboratorium.
   2. Plaats signalen strategisch op de gordijnen. Zorg ervoor dat de signalen zijn groot en bevatten contrasterende kleuren (ex .: zwart-wit) voor een betere zichtbaarheid. Hang signalen op een afstand en hoogte wanneer ze zichtbaar muizen vanuit de kuip. Opmerking: De signalen zijn statisch en niet bewegen tijdens het testen.
2. Setup de muis Prestatie Tracking Software
   1. Kalibreren van de video aan de afmetingen van het doolhof te passen onder het 'Configuratie' - "Filters en objecten" tab.
   2. Stel de filters waardoor de software de muizen van de achtergrond kan differentiëren.
      1. Gebruik dezelfde procedures zoals beschreven in het zichtbare platform test (stappen 2.1.2.1-2.1.2.3) het opzetten van de filters voor de Morris water maze verborgen platform training.
   3. Maak vier gelijke kwadranten in het doolhof
      1. Klik opde "Ellipse" optie onder het tabblad "Zone Definition" eerste, en het creëren van een cirkel die overeenkomt met het doolhof op het scherm. Opmerking: In dit tabblad wordt het eigenlijke labyrint opgezet weergegeven, zodat het mogelijk de optie om de computer opstart met de feitelijke doolhof apparatuur aanpassen.
      2. Klik op de "rechthoek" optie en maak vier gelijke vierkanten. Plaats deze vierkanten op het scherm om vier gelijke kwadranten te creëren binnen de nieuw gecreëerde cirkel.
   4. Maak de perrons in het doolhof.
      1. Selecteer de "Ellipse" optie, en maak een cirkel de grootte van het platform dat zal worden gebruikt. Opmerking: Het plaatsen van het platform in de doolhof vooraf kan voordelig zijn om een ​​ellips te maken de exacte grootte van het platform.
      2. Plaats de nieuwe platformlocatie in het midden van het doelwit kwadrant. (Het is aan te raden om dit object "target" te noemen om de juiste platforms te onderscheiden van de rest). Kritische stap: in het vak gewoon BELow "Grid", selecteer de "stop" optie onder "trigger" voor het doelplatform. Hierdoor zal het programma stopt, als de muis het platform bereikt.
      3. Maak drie andere identieke platform gebieden, en plaats ze in de exacte locaties in de andere kwadranten. Selecteer niet "stop" in de optie "trigger".
3. Het creëren van de Run Sheets
   1. Maak een run sheet notering elke muis, elke proef, een ruimte de tijd om het platform op te schrijven, en een ruimte om afwijkend gedrag (tabel 1) mee.
   2. Vooraf bepalen van de release punt van elke muis in een pseudo-willekeurige manier. Met pseudo-willekeurige keuze zodanig dat de afstand tot het platform gelijk is iedere dag, elk van de 4 plaatsen gelijkelijk gebruikt, en de hoek vanaf de start tot platform (bijv., Van links of rechts) is evenwicht binnen en tussen dagen.
      Let op: de locatie van het platform op de vluchtsheet naar de locatie van het platform dient niet verplaatst vanuit de oorspronkelijke positie. Zorg ervoor dat het platform in het midden van een van de vier zones die zijn gemaakt op de tracking software.
      Opmerking: Als longitudinale tests wordt uitgevoerd op verschillende leeftijden, bewegen het platform naar een nieuwe locatie op elke leeftijd.
4. Set Up the Maze
   1. Pas ofwel het water doolhof of de camera zodanig dat er een match is tussen het doolhof en de configuratie setup op de "Configuration" - "Zone Definition" tab.
   2. Label de vier kwadranten van het onzichtbare doolhof (N, S, E, W). Controleer dat deze overeenkomen met de configuratie van de software voor het bijhouden muizen waarborgen worden losgemaakt van de juiste uitgangspunten.
      Kritische stap: Zet deze labels buiten het doolhof en uit het zicht van een zwemmende dier aangezien signalen binnen het doolhof vormen een niet-ruimtelijk niet- hippocampus afhankelijke taak.
   3. Vul het doolhof met kraan water (ongeveer 21 ° C), zodat het platform ongeveer 5 mm onder het oppervlak van het water.
   4. Plaats het platform in de vooraf bepaalde locatie.
      Opmerking: De plaats van het platform voor alle muizen getest voor alle dagen en proeven gelijk blijven.
   5. Gebruik niet-giftige witte tempera verf aan het water ondoorzichtig te maken. Doe dit ervoor zorgen dat de bovenkant van het platform onzichtbaar ooghoogte van de dieren tijdens het zwemmen.
5. Procedure
   1. Neem de muis uit de kooi, markeert de staart met behulp van een permanent marker van de juiste kleur en plaats in de beker.
   2. Giet de muis in het labyrint, zodat binnengaat tegen de muur. Opmerking: Elke muis zal op dezelfde startlocatie worden geplaatst voor een unieke proef.
   3. Bij de eerste versie van de muis, begint de timer en staan ​​in een gebied waar de tester niet gemakkelijk zichtbaar door de muizen. Zorg ervoor dat dier tracking software goed is het bijhouden van het dier.
   4. Zodra het dier het platform bereikt, laat het op het platform blijven 15 sec.
      Opmerking: Dit laat het dier te oriënteren om de ruimtelijke ligging in de ruimte.
   5. Na 15 sec op het platform, verwijder het dier uit het doolhof en terug te keren met de muis naar de verwarmde kooi.
   6. Als de muis vindt het platform en gaat springen of vallen vóór 15 sec, schep de muis en plaats het terug op het platform voor de rest van de 15 seconden, zodat de muis leert het platform met escape koppelen.
   7. Als de muis het platform binnen 60 sec niet lokaliseren, voorzichtig schep de muis en plaats het op het platform. Laat het op het platform te blijven voor 15 sec, verwijder dan het dier met de scoop en breng het terug naar de verwarmde kooi.
   8. Reinig het doolhof van puin met een net om olfactorische signalen verstoren.
   9. Herhaal deze procedure voor de resterende muizen in de groep. Dus, voor het testen van dagen 4 tot en met 9, voeren vier proeven van verborgen platform treining per dag met ongeveer 20 minuten tussen elke proef.
   10. Verander de startlocatie pseduorandomly voor elke proef. Zo werden, tijdens proef 1, laat alle muizen van dezelfde startlocatie, en herhaal de procedure vanaf een andere uitgangspositie voor de daarop volgende proeven. Elke dag, variëren de release punten voor dieren zorgen niet het ontwikkelen van een niet-ruimtelijk, non-hippocampus afhankelijk motorische strategie. Als bijvoorbeeld muizen vrijkomen uit N, S, E en W van dag één, ze niet de volgende dag release in dezelfde volgorde.
   11. Tijdens verborgen platform training, gebruikt het dier tracking software om latency te meten aan het platform, de weglengte van het dier, en het percentage van de tijd te bereiken of te distantiëren van het dier doorbrengt in elk doolhof kwadrant. Verkrijgen van deze metingen uit het tabblad "Water doolhof" onder "Experiment lijst" en kan direct worden geëxporteerd naar een Excel-spreadsheet.
       Opmerking: het gebruik van een hand timer waarborgt de nauwkeurigheid van de trackingsoftware.

4. Probe Trials

1. Setup de muis Prestatie Tracking Software
   1. Gebruik dezelfde procedures als in de Morris water maze verborgen platform procedure (stappen 3.2.1-3.2.4.3) met één uitzondering. Kritische stap: Voor sonde proeven, zorgen de "stop" optie voor "trigger" wordt uitgeschakeld tijdens probe trials. Hierdoor wordt voorkomen dat het programma te stoppen wanneer een muis kruist het platform omgeving.
2. Het creëren van de Run Sheets
   1. Maak een run sheet notering elke muis, elk proces, en een ruimte om afwijkend gedrag te noteren. Vooraf bepalen van de release punt tijdens de sonde proeven zodanig dat zij afwisselend tussen de twee partijen tegenover het platform. Aldus vooraf de afgifte punten zodanig dat muizen niet vrijkomen uit de twee zijden die naast het platform.
3. Procedure
   1. Gedrag sonde proeven vergelijkbaar met verborgen platform training, met de uitzonderingentie die niet platform in de doolhof.
   2. Laat een muis uit een vooraf bepaald vrijlating punt. Tijdens de sonde proef, verwijder het platform en de muis heeft 60 sec om te zwemmen in het doolhof.
   3. Tijdens het testen, uit te voeren 4 probe trials. Verander de losplaats van de muizen tussen de probe trials. Zo verandert de release punt van de huidige sonde proef van die van de vorige probe trial.
   4. Tijdens de probe studies gebruikt het dier tracking software om de padlengte van het dier te volgen, het percentage tijd dat het dier doorbrengt in elk kwadrant van het doolhof en het aantal malen dat een dier zwemt op de eerder platformed gebied. Verkrijgen van deze metingen van de "Data-analyse" tab en het tabblad "Water doolhof" onder "Experimental lijst", en de uitvoer direct naar een Excel-spreadsheet.
      Opmerking: het gebruik van een hand timer kan ook nuttig zijn om de nauwkeurigheid van de tracking software waarborgen.
   5. Voer een sonde proef voorafgaand aanverborgen platform training op dagen 6, 7, 8 en 10 (figuur 2). Na deze sonde onderzoeken, uit te voeren 4 proeven van de verborgen platform trainen elke dag. Aldus uitvoeren van een eerste probe, onmiddellijk gevolgd door verborgen platform opleiding alle muizen onder toepassing van dezelfde procedures zoals beschreven in sectie 3. daarentegen geen extra verborgen platform training niet uitvoeren nadat de meetkop proef op dag 10.

5. Analyses

1. Zichtbaar Platform Training
   1. Voer herhaalde metingen ANOVA afzonderlijk voor (a) padlengte, (b) latentie om het platform te vinden, en (c) zwemmen snelheid, met transgene (of een andere grootte, zoals behandeling) als between-subject variabele en dagen of training blokken als de binnen-subject variabele. Opmerking: Voor meer complexe ontwerpen, kan een overleg met een statisticus nuttig zijn. Zie ^8,13 voor informatie over de groep maten voldoende om goed te voeden deze taak met veel gebruikte modellen van Alzheimer7; s ziekte.
   2. Prestaties Incompetentie
      1. Identificeer prestatie-incompetent muizen, met inbegrip van muizen die een visuele of motorische incompetentie te tonen, of dieren die niet de procedurele onderdelen van de test doen verwerven, en verwijder deze muizen uit latere statistische analyses van verborgen platform en sonde prestaties.
         1. Bereken de gemiddelde latency en zwemmen snelheid voor de laatste dag van de zichtbare platform training voor elke muis. Verwijder muizen met behulp 2 standaarddeviaties boven de groep betekenen, omdat dit een indicatie van de motor of visuele handicap kunnen zijn.
         2. Identificeren en verwijderen muizen niet te oriënteren op of volg de ontsnapping scoop, of muizen vertonen afwijkend gedrag, zoals kurk-schroef zwemmen of drijven.
2. Morris Water Maze Verborgen Platform Training
   1. Voer herhaalde metingen ANOVA op (a) padlengte, (b) latentie om het verborgen platform te vinden, (c) zwemmen snelheid, en (d) percentage tijd of percentageafstand in kwadrant met transgene als de tussen-subject variabele en onderzoeken als de variabele binnen-subject.
3. Probe Trials
   1. Swim snelheid
      1. Gedrag herhaalde metingen ANOVA op zwemmen snelheid over probe studies met transgene als de tussen-subject variabele en onderzoeken als de variabele binnen-subject.
   2. Platform kruising index
      1. De probe proefopstelling voor elke muis wordt platform kruising index (PCI) berekend volgens de volgende formule: PCI = aantal malen de muis kruist de doellocatie - gemiddelde kruisingen van de gelijkwaardige posities in de andere 3 kwadranten.
         Opmerking: Dit wordt uitgevoerd om te bepalen of de muis gebruikt een ruimtelijk zoekstrategie, zoals door meer kruisingen via getrainde platformlocatie, of een niet-ruimtelijk strategie thigmotaxic zwemmen, zoals blijkt uit ongeveer gelijke kruisingen alle vier locaties.
      2. Gedragscode herhaaldemaatregelen ANOVA op PCI met transgene als de tussen-subject variabele en onderzoeken als de variabele binnen-subject.
   3. Percentage tijd of afstand procent in kwadrant
      1. Bereken het percentage tijd of afstand elke muis doorbrengt in de vier kwadranten van het doolhof. Gedrag herhaalde metingen ANOVA op het percentage van de tijd, of afstand, met transgene als de tussen-subject variabele en onderzoeken als de variabele binnen-subject. Gebruik het percentage tijd te bepalen of een ruimtelijk zoekstrategie wordt gebruikt; bevindingen van ongeveer 25% tijd in het doel kwadrant geven muizen presteren op toeval niveau en niet met behulp van een ruimtelijk zoekstrategie.
   4. O / N vergeten
      1. Vergelijk de latentie van het platform gebied kruising op de sonde proef om de latentie om het platform te vinden op de laatste proef van de vorige dag. Opmerking: Als de latentie van het platform kruising op de sonde proef is aanmerkelijk langer zijn dan de latentie om de platfor zoekenm tijdens de laatste proef van verborgen platform op de vorige dag, dan O / N vergeten van het platform locatie plaatsvindt.
4. Post hoc analyse
   1. Volg significant RMANOVAs met post-hoc vergelijkingen van transgene bij elke proef.

6. Voorbeeld van Re-optimalisatie voor een nieuwe testomgeving

1. Pre-handling. Gedrag pre-behandeling in de behuizing kamer. Plaats de kooien zonder deksel op een transportwagen voor de hele sessie.
   Noot: Doelstellingen voor modificatie van de pre-handling procedure moeten geleidelijker introduceren handler manipulaties en blootstelling aan de transportinrichtingen (bekerglas en schep) en meer tijd muizen in hun kooi zonder microisolator deksel en buiten de kooi in een open veld en helderder licht.
   1. Dag 1 en 2
      1. Laat muizen om te acclimatiseren aan de handen zijn in de kooi, gevolgd door zachte aanraken, Gevolgd door te worden opgeheven voor tattoo inspectie en merken van de staart. Beginnend op dag 2 van de pre-behandeling, plaatst extra nestmateriaal in de kooi om extra materiaal voor nestbouw en onderdak terwijl deksels zijn verwijderd ^9.
   2. Dag 3 en 4
      1. Plaats het transport beker, lepel, en de vlag van de zichtbare platform in het vak pre-behandeling en laat muizen om te verkennen voor 2 proeven op 2 min per trial.
      2. Gebruik geen water in dit protocol tijdens de pre-handling. Integendeel, zorgen de box bevat voldoende schone bedden op de vloer bedekken en geparfumeerd met een kleine hoeveelheid vrouwelijke en mannelijke vervuild strooisel als beide seksen worden getest. Het beddengoed te veranderen elke dag.
   3. Dag 5
      1. Plaats muizen in de doos pre-behandeling met licht vervuild afval en de zichtbare platform vlag voor 3 proeven, voor 20 seconden elk. Gebruik de beker en de primeur om de muizen te transporteren naar en uit de doos.
2. Zichtbaar Platform Training
   1. Stel watertemperatuur bij 27 ° C (routinematig gebruikt voor de Minnesota testomgeving).
   2. Zet de muizen om de kooi op het verwerven van de cued platform.
   3. Laat muizen tot 60 seconden de zichtbare platform te verkrijgen.
   4. Voer trainingen bestaande uit 3 proeven per dag gedurende 5 dagen.
3. Verborgen Platform Training
   1. Wijzig visuele aanwijzingen. Behalve voor één groot gordijn naar de handler verduisteren, ofwel elimineren of te maken smaller andere gordijnen rond het zwembad om zo een meer open ruimte hebben. Plaats extra objecten over de kamer (bijvoorbeeld blootgesteld rekken, zwarte stof poster met een wit symbool, een zwart-wit strand bal, grote zwarte trechters, notebooks, en een zwarte knuffeldier), wat resulteert in een evenwichtige, maar meer gevarieerde visuele cue- set dan voorheen.
   2. Begin verborgen platform training 72 uur na voltooiing van de zichtbare platform Training, met een interval van ongeveer 30 minuten tussen de proeven.
   3. Gedrag trainingen bestaande uit 2 proeven voor 8 dagen.
4. Probe Trials
   1. Voer probe trials 72 uur volgende verborgen training proeven 8, 12, en 16.Include een 3-daagse interval tussen proeven 8-9 en 12-13 van de opleiding.
   2. Stel de duur sonde tijd voor 30 sec.

Results

We hebben de Morris water maze gebruikt om de effecten van bèta-amyloïde (Tg2576 muizen) en mutant tau P301L (RTG (TauP301L) 4510 muizen) ruimtelijke voorbeeldgeheugen (bijvoorbeeld ^1,5,7,8). Figuur 3 is de studie de vertegenwoordiger resultaat gerapporteerd in onze studie naar het effect van volwassen-onset P301L tau-expressie op leren en geheugen ^8, met behulp van testen Milieu A. Om motor en visuele mogelijkheden te beoordelen, werden muizen vergeleken heel zichtbaar pl...

Discussion

De MWM taak wordt wijd gebruikt om ruimtelijk leren en geheugen beoordelen. Echter, de robuustheid van deze taak beïnvloed door vele factoren en vereist optimalisatie voor zowel de achtergrond stam en testomgeving. Zoals getoond in figuur 4, dezelfde trainingsprotocol en toegepast visuele aanwijzingen die in twee verschillende testen kamers (equivalente omvang en layout) leverde aanzienlijk verschillend probe prestaties. Omdat veel functies van de testkamer kan bijdragen aan ruimtelijke signalen ^4,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Viewer Tracking software	Biobserve		Deze specifieke software is geen vereiste - er zijn andere trackingsystemen beschikbaar
Pre-handling pool			Afmetingen ongeveer 1 voet breed x 2 voet lang x 1,5 voet diep
Kunststof beker			1 L
Schop
Klein net
Stopwatch
Niet-toxische witte tempera verf			Elke kleur verf kan worden gebruikt; echter, de meeste trackingsoftwareprogramma's vereisen dat de verf contrasteert met de kleur van het dier.
Zichtbare platform			Kleur moet contrasteren met die van het doolhof
Gordijnroede
Gordijnen
Ronde kuip			Meestal wit van kleur; ongeveer 4 voet in diameter
Verborgen platform			Geverfd in dezelfde kleur als het water