Methodenartikel

In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom

DOI:

10.3791/52731

⸱

11 mei 2015

 ,  ,  , 
1Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences, University of Utah

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia-activatie en microgliose zijn de belangrijkste reacties op chronische neurodegeneratie. Hier presenteren we werkwijzen voor in vivo visualisatietechnieken retinale CX3CR1-GFP + cellen door microgliale confocale Ophthalmoscopie, en drempel en morfometrische analyses worden geïdentificeerd en gekwantificeerd hun activering. We monitoren microglia veranderingen tijdens de vroege stadia van leeftijdsgebonden glaucoom.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia, die CNS-resident neuro-cellen zijn, te transformeren van hun morfologie en grootte in reactie op de CNS-letsel, schakelen naar een geactiveerde staat met verschillende functies en genexpressie profielen. De rollen van microgliale activering in gezondheid, verwondingen en ziekten blijven onvolledig begrepen vanwege hun dynamische en complexe regulering in reactie op veranderingen in hun micromilieu. Het is dus essentieel om niet-invasief bewaken en veranderingen in microgliale activering tijd in het intacte organisme te analyseren. In vivo studies van microglia activering zijn vertraagd door technische beperkingen aan het volgen van microglia gedrag zonder dat de CNS milieu. Dit is bijzonder moeilijk geweest tijdens chronische neurodegeneratie, waar de veranderingen op lange termijn moet worden gevolgd. Het netvlies is een CNS orgaan vatbaar is voor non-invasieve beeldvorming levende, een krachtig systeem te visualiseren en de dynamiek van microglia activatie karakteriseren tijdens chronische aandoeningen.

in vivo beeldvorming van retinale microglia, via confocale oftalmoscopie (cSLO) en CX3CR1 GFP / + reporter muizen te microglia met cellulaire resolutie te visualiseren. Ook beschrijven we methoden om de maandelijkse veranderingen in cel activatie en dichtheid in grote cel subsets (200-300 cellen per netvlies) te kwantificeren. Wij bevestigen het gebruik van Somal gebied als een nuttige metrische live volgen van microgliale activering in het netvlies door het toepassen van geautomatiseerde-drempel op basis van morfometrische analyse van in vivo afbeeldingen. Wij gebruiken deze live image registratie en verwerking strategieën om de dynamische veranderingen in microgliale activering en microgliose volgen tijdens de vroege stadia van retinale neurodegeneratie in een muizenmodel van chronische glaucoom. Deze benadering is handig voor de bijdragen van microglia neuronale en axonale afname van chronische CNS aandoeningen die de retina en optische zenuw invloed te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia vormen neuroimmune cellen die uitsluitend bevinden in het centrale zenuwstelsel (CNS) sinds de vroege embryonale ontwikkeling en de volwassen leeftijd. Voorzien van een complex repertoire receptoren, microgliale activiteit en regionale heterogeniteit worden geregeld door de bidirectionele interactie met aangrenzende neuronen, glia, bloed-hersenbarrière en infiltrerende cellen neuroinflammatory 1,2. Basale microglia functies bijdragen aan fysiologische onderhoud en reparatie, omdat ze proeven op hun grondgebied voor verstoringen in de homeostase 3,4. Tijdens CNS verwonding of ziekte, microglia zijn de first responders om neuronale signalen die vervolgens leiden tot de overgang naar een reactieve fenotype, aangeduid als "geactiveerde microglia 2,5-7. Microglia-activatie gaat om een ingewikkelde cyclus van gen en eiwit expressie, die gekoppeld zijn aan de cel soma en proces resizen en remodeling 6-9. Microglia activatie, alsook cellen Redistributieclustering kan vergezeld de plaatselijke totale stijging van het aantal cellen (genoemd microgliosis). Dit kan het gevolg zijn van celproliferatie en zelfvernieuwing, al dan niet rekrutering van bloed monocyten 3,4,7,10-14. In een breed scala van leeftijdsafhankelijke, chronische CNS ziekten, aanhoudende microgliose en microglia-activatie parallel progressie van de ziekte 15-19. Hoe microglia invloed neurodegeneratie blijft onduidelijk, vooral omdat ze allebei neurobeschermend en schadelijke rollen die diverse bijdragen aan de ziekte ontstaan ​​en de progressie kan hebben afgespeeld. Live-imaging studies gericht op het begrijpen chronische ziekte CNS hebben microglia gedrag in de beschadigde CNS diermodellen en mensen gecontroleerd en aangetoond dat microglia wijzigingen zijn detecteerbaar begin in de vroege stadia van de ziekte 15-17,19,20. Het is dus essentieel om benaderingen te sporen en te controleren microgliale activering in vivo ontwikkelen.

Niet-invasieve detectie van de regionale veranderingen in de hersenen microglia activering werd opgericht als een belangrijke in vivo indicator van neurodegeneratieve progressie van de ziekte, met behulp van moleculaire beeldvorming of bioluminescentie en positron emissie tomografie of magnetische resonantie beeldvorming 18,21,22. Deze zeer kwantitatieve en non-invasieve moleculaire en nucleaire beeldvorming opsporen gliosis regionale oplossing. Als alternatief, twee-foton confocale beeldvorming in CX3CR1 GFP / + muizen kon de observatie van de hersenen microglia met cellulaire resolutie 3,4,9,20,23-28. Deze benadering beperkt langdurige en herhaalde observatie van chronische microgliale veranderingen, daar het gevaar bestaat van hun gedrag verstoren door ten minste minimaal invasieve brain imaging procedures 29. Als alternatief, het netvlies biedt optimale omstandigheden voor directe, in vivo visualisatie en herhaalde controle van microglia in hun intact CNS niche gedurende veroudering, na acuut letsel, eneventueel tijdens chronische neurodegeneratieve aandoeningen. Zo hebben recente onderzoeken de haalbaarheid van een hoge-resolutie beeldvorming van het netvlies microglia die GFP bewezen door het aanpassen van de confocale laser scanning oftalmoscopie (cSLO) naar het live-CX3CR1 GFP / + muizen. Deze is gebruikt om wekelijks veranderingen in GFP + celaantallen in individuele muizen gedurende maximaal 10 weken volgen na acuut geïnduceerd letsel of oculaire hypertensie 30-36.

We hebben deze benadering uitgebreid tot langdurige imaging voeren gedurende enkele maanden, en kwantitatief veranderingen in microglia activatie basis van soma size middels morfometrische analyse volgen. Somal grootte werd gedefinieerd als nuttige metriek van microglia activatie in levende imaging studies met behulp van twee-foton confocale microscopie in corticale schijfjes te functioneren in vivo beeldvorming van CX3CR1-GFP + microglia 9. Deze en andere studies toonden ook het verband tussen Somal shape and Iba1 niveaus van eiwitexpressie, which verhoogt ook activatie 9,37. Aldus kan geactiveerde microglia worden geïdentificeerd levende muizen, en hun aantal en verdeling in de tijd gevolgd bij CNS gezondheid en ziekte.

Dit protocol beschrijft werkwijzen voor cSLO levende beeldacquisitie en analyse microgliale cel aantallen, distributie en morfologische activatie tijdens retinale ganglioncellen (RGC) degeneratie (figuur 1) bewaken. Aldus is deze studie gebruikt: 1) een muismodel van erfelijke glaucoom (DBA / 2J) die leeftijdsafhankelijke oogzenuw en netvlies neurodegeneratie en ondergaat toont opmerkelijke variatie in ziekteprogressie tussen 5 en 10 maanden 38,39, 2) maandelijkse cSLO in vivo imaging voor langdurige visualisatie van GFP + cellen in de retina en optische zenuw ongemyelineerde heterozygote CX3CR1 GFP / + DBA / 2J muizen 3-5 maanden, 3) levende beeldanalyse door het segmenteren en drempelwaarden naar cel somata en meten isoleren leeftijd deir gebied. Deze strategieën zijn toegepast om de kinetiek van retinale microgliale activatie toestanden beoordelen tijdens de vroege stadia van chronisch glaucoom.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo beeldvorming wordt uitgevoerd in pathogeenvrije faciliteiten met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Utah goedgekeurd.
Opmerking: Deze imaging protocol wordt gebruikt voor reporter muizen die retinale microglia en infiltrerende monocyten / macrofagen tot expressie groen-fluorescerend eiwit (GFP) onder de controle van de fractalkine receptor locus (CX3CR1).

1. In vivo beeldvorming van het netvlies GFP + Microglia door Confocale Laser Scanning Ophthalmoscopie (cSLO)

  1. Zet het water gecontroleerd verwarmingssysteem, ingesteld om de muis temperatuur tussen 35-37 ºC te stabiliseren tijdens de procedure, en sluit twee verwarming pads.
    1. Start de confocale laser scanning oftalmoscoop (cSLO) systeem (Figuur 2A). Open het cSLO programma, voer de informatie die de individuele muis zal identificeren en stel een hoornvlies kromming van 2 mm (Patiëntgegevens menu).
  2. Bereid je voor op imaGing. Veilig te passen een schone 55º wide-field objectief op zijn socket. Bereid de oftalmoscoop imaging platform door het veiligstellen van een verwarmingselement bedekt met schoon papier. Gebruik clips om de pad en papier plat en houd ze uit het blokkeren van de beweging van het objectief.
  3. Verdoven de muis door intraperitoneale injectie van 1,3% 2,2,2-tribroomethanol en 0,8% tert-amyl alcohol (250 mg / kg lichaamsgewicht; 0,5 ml / 25 g lichaamsgewicht) met een 30½ G naald bevestigd aan een 1 ml wegwerpbare syringe. Keer terug muis aan zijn kooi, hield meer dan een verwarmingselement.
    LET OP: De levering van de narcose door injectie versus inademing maakt gemakkelijker positionering van de muis voor de beeldvorming en onbelemmerde toegang tot de ogen, vrij van de neus kegels en slangen.
  4. Zodra het dier stopt met bewegen en niet reageert op de staart knijpen, opwekken pupilverwijding met Tropicamide en fenylefrine (0,5% elk), door het plaatsen van het dier vatbaar en die beide ogen met de druppels van 7 min.
  5. Na 5 min, pkant de muis gevoelig in het midden van de oftalmoscoop platform en fit contactlenzen boven de ogen, aanbrengen minimale druk.
    OPMERKING: Contactlenzen zijn klein en fragiel, maar kan voorzichtig met de vingers worden behandeld, hoewel tang plaats 40 kan worden gebruikt. Het gebruik van contactlenzen is optioneel, maar aanbevolen als het minimaliseert droge ogen en blijft transparantie van het hoornvlies tijdens de beeldvorming.
  6. Na 7 min, oriënteren de muis met het rechteroog tegenover de objectieflens en de baan evenwijdig aan de objectieflens, waardoor het dier ongebreidelde nabij de rand van het platform (Figuur 2B). Om afbeeldingen van vergelijkbare verzadiging en oriëntatie verzamelen steeds bezorgd om de afstand tussen oog objectieflens, en de uitlijning van het oog om het lichtpad gedurende beeldvorming sessies. Clip lange snorharen interfereren met observatie van het oog.
    OPMERKING: Voor de volgende 8-10 min, zal de muis niet bewegen of knipperen, en zal de adem met zachte bewegingmenten, die worden gevolgd door de cSLO Eye Tracking ART (automatische real time) modus, die de scankop positie gebaseerd op fundus monumenten met een hoog contrast aanpast. Voorbij die tijd, beginnen muizen hijgen en te knipperen, waardoor beeldvorming onpraktisch.
  7. Wanneer beeldvorming wordt uitgevoerd zonder contactlenzen toepassing PBS daalt tot beide ogen elke 2-3 min om uitdroging te voorkomen.
  8. Verzamel een fundus beeld van het retinale vaatstelsel en de optische schijf, gericht op de binnenste retina.
    1. Selecteer de infrarood-mode (IR) en de instellingen aan te passen aan 820 nm excitatie, 100% laservermogen, 40-60% gevoeligheid (Figuur 2C).
    2. Werken in high-speed modus (12,6 frame / sec), zoek het oog met behulp van de joystick naar de oftalmoscoop rijden. Bij lage vergroting, inspecteren het hoornvlies en lens voor letsel of ondoorzichtigheid, en sluiten van de studie ogen met gebreken of letsel dat zal invloed hebben op de beeldvorming van de retina (figuur 3A).
    3. Zoek de optische schijf gebied (het oppervlak vande oogzenuw hoofd, ONH) door dichter bij het oog brengen van de doelstelling, dan centreren het beeld op en vergrendel deze positie door schroeven van de joystick. Deze afstemming van het oog om de oftalmoscoop is de sleutel tot het verkrijgen zelfs concentreren en emissie over het beeld.
    4. Visualiseren inwendige vlakken van de retina, en het ONH, met de grote bloedvaten op het glasachtige oppervlak van het netvlies als referentie brandpuntsvlak (59 en 60 D), of dieper (55 D) in ogen tonen uitgegraven optic discs. De optimale nadruk moet oplossen circulerende bloedcellen binnen grote bloedvaten, met hun lumen en muren duidelijk onderscheiden.
    5. Optimaliseer image verzadiging door het aanpassen van de knop op het touch screen bedieningspaneel, totdat een witte halo van uniforme verlichting overspant in het grootste deel van het gebied 55º fundus rond de optische schijf (met behulp van een lichte overbelichting). Vervolgens laat de verzadiging contrast optimaliseren totdat bloedcellen bewegen langs de grote bloedvaten duidelijk worden opgelost. Als brandpunt donkergebieden blijven bestaan, niet te wijten aan het netvlies schade, opnieuw uitlijnen het oog van de camera tot een uniform helder beeld wordt verkregen. Deze aanpassing is fundamenteel voor reproduceerbare sets van de beelden vast te leggen in de positie en de kwaliteit.
    6. Verzamel een hoge-resolutie infraroodbeeld van de centrale retina (1,4-1,7 mm in diameter, afhankelijk van leeftijd), gemiddeld 30 frames direct (4,7 frames / sec, genormaliseerd), om signaal-ruisverhouding te verbeteren (figuur 2D ).
  9. Onmiddellijk een fluorescentiebeeld van GFP + microglia en / of infiltrerende monocyten gelokaliseerd in het binnenste vlakken van de retina en ONH verkrijgen.
    OPMERKING: Optimalisatie van de IR fundus beeld van de retina bepaalt de resolutie van het fluorescentiebeeld van GFP + cellen alsmede de omvang van binnenste retina overspannen. Als de inwendige vlakken van de retina, die kan worden gedetecteerd door slechte resolutie van het vaatstelsel gericht, resulteert in gedimd GFP + cellen views (figuur 3B). Het niet IR satu passenrantsoen correct en uniform beïnvloedt de fluorescentie afbeelding (FA), de invoering van artefactuele variaties in GFP + cellen intensiteit en omvang (figuur 3C).
    1. Swich naar imaging-modus (FA) fluorescentie in het touch screen panel, met blauw, 488 nm laser excitatie (460-490 nm barrière filter set), en overname-instellingen (100% laservermogen en 100-125% gevoeligheid), die worden gehandhaafd constante voor alle muizen (Figuur 2E).
    2. Verzamel een enkele tweedimensionale fluorescentie beeld van het netvlies xy-punt, en het beeld van een fundus onmiddellijk vast te leggen op dezelfde positie (100x scan gemiddelde; 55º scan hoek voor beide beelden; figuur 2F).
    3. Afbeelding van een multipoint vastleggen door het selecteren van "composiet" in het configuratiescherm (figuur 2G) en de oftalmoscoop rechts te verplaatsen en links, panning het netvlies over de neus-temporele as (figuur 2H).
      NB: Na het één xy-point scannen (100x skan gemiddeld), de software automatisch gemiddelden nieuwe scans van hetzelfde en nieuwe gebieden (omcirkeld met een groene cirkel tijdens optimale scan, of rood als de scan is onhaalbaar), en steken alle xy-posities in real time. De resulterende samengestelde beeld omvat 1,5-1,7 mm op de horizontale as x 3-4 mm in de verticale as (55 ° x 120-124º scanhoek).
  10. Compleet beeldvorming van elke muis binnen 15 minuten na het induceren van anesthesie, voordat knipperen en beweging opnieuw gestart.
  11. Contactlenzen verwijderen, hydrateren ogen met PBS en de terugkeer van het dier aan zijn opgewarmd kooi, het controleren van het gedrag tot volledig herstel van de beweeglijkheid.
  12. Longitudinale studies met intermitterende cSLO-beeldvorming sessies hetzelfde individu muis, herhaal beeldvorming niet minder dan 3 dagen na elkaar op de cumulatieve toxiciteit van anesthesie, alsmede hoornvliesirritatie voorkomen.

2. Levende Image Processing and Analysis

  1. Sequential beelduitlijning:
    1. Richtende fundus beelden voor een tijdreeks van hetzelfde oog met behulp van het vaatstelsel en de optische schijf als oriëntatiepunten. Open alle afbeeldingen in een commerciële dia-show-programma, door het slepen van elk beeld over de voorgaande totdat hun optische schijven af te stemmen op het XY vlak (de bovenste afbeelding verschijnt semi-transparant terwijl wordt gesleept) en draai de bovenste afbeelding tot zijn grote bloedvaten overlappen met het vaatstelsel op de afbeelding hieronder (focus op schepen verst van de optische disc). Noteer de draaihoek voor elk beeld en bewaar deze tijdreeksen voor toekomstig gebruik, het bijhouden van de muis en oog identiteit.
    2. Lijn de corresponderende reeksen van één xy-point fluorescentiebeelden door toepassing van de geregistreerde hoek met de xy rotatie op elk tijdstip te corrigeren met een rasterafbeelding bewerkingsprogramma. Daarnaast passen resolutie tot 300 dpi (zonder herschalen) en achtergrond (in de RGB-modus, selecteer Levels en proeven van het lumen van een bloedvat zo zwart). Sla deze beeldenals TIF-bestanden, het toevoegen van "afgestemd" om hun namen.
  2. Microgliale cel segmentatie:
    1. Om GFP + cellen van het "in lijn" TIF-bestand die overeenkomt met het vroegste tijdstip / leeftijd te identificeren in de centrale retina, open in FluoRender. Zoomen op de afbeelding om het scherm te passen, hier de Render uitzicht (composiet, orthogonale, geïnterpoleerd) en de eigenschappen (0,58 gamma, 255 verzadigingspunt, 255 luminantie, 195 alpha en 1,00 arcering), het selecteren van zowel de RG kanalen als zichtbare (verberg B-kanaal door erop te dubbelklikken in de werkruimte beeld; Figuur 4A).
    2. Om individuele cellen, drempel het rode kanaal (moet worden gemarkeerd op de Workspace kader), door het verhogen van de lage drempel tot de meerderheid van de cellen worden gemaskeerd (wit) met minimale overlap en celprocessen (cyaan), terwijl de hoge drempel constante (255). De lage drempelwaarde varieert tussen 100 en 170, afhankelijk van de fluorescentie-intensiteit (Figuur 4B </ Strong>).
    3. Sla deze visie met de rode kanaal alleen zichtbaar (Capture commando) als nieuwe TIF-bestand, het toevoegen van "cellsegm" naar de oorspronkelijke naam (Figuur 4C). Met behulp van een generisch raster grafische editor software, omkeren zijn grijstinten en passen resolutie tot 300 dpi, zoals hierboven, en opnieuw opslaan als RGB (figuur 4D).
      OPMERKING: Verwijder de mappen (projecten) automatisch door FluoRender, en sla de toegepaste drempel voor toekomstig gebruik.
  3. Microgliale soma segmentatie en morfometrie:
    1. Om GFP + cellen somata identificeren stippellijn kwantificering gebruik beeldanalyse software geautomatiseerde intensiteitmetingen en drempelwaarde mogelijkheden en drempelwaarde gebaseerde object tellen en meten. Open het "cellsegm" TIF-bestand en selecteer de herschalen methode (spline) en het rode kanaal (klik rode tab in RGB). Verbeter de visualisatie door de selectie "view channel in kleur" (klik met de rechtermuisknop op de rode RGTab B), en "vullen kleuren" te selecteren (Image / Beeld Aanpassen) aan de grijstinten te keren en bekijk de cellen in grijs / zwart op een witte achtergrond (figuur 4E).
    2. IJk het beeld om 1,4-1,7 mm, afhankelijk van de leeftijd, door het tekenen van een horizontale lijn over het hele beeld (Calibration, Quick Calibration).
    3. Segment individuele cel somata door toepassing intensiteit drempelwaarde (figuur 4B). Voor deze, het werk op de rode RGB-kanaal en open het Threshold Intensity functie (Object Graaf; selecteren "count-update" commando) om tweedimensionale parameters voor elk thresholded regio van belang (ROI) bijhouden vertegenwoordigen individuele somata.
    4. Definieer de intensiteitsdrempel in het histogram, door het selecteren van de laagste 50-60% van de 255 niveaus en verfijnen van de uiteindelijke drempelwaarde door visuele evaluatie van de overlap tussen de drempel kleurenmasker (blauw) en de cel soma perimeter (grijs) in individuele cellen (FIGUUR 4E).
    5. Schat de juistheid van de cel soma maskers om de Somal dimensies vertegenwoordigen door het meten van het gebied voor en na de segmentatie in 10 cellen en accepteer de geselecteerde drempel bereik als de metingen verschillen minder dan 10% (gebruik de Binary Toolbar en Geannoteerde Metingen).
    6. Handmatig identificeren Somal ROI die meerdere cellen omvatten en scheiden deze elementen (elimineren of afzonderlijke ROI met behulp van de Binary Toolbar controls, of Object Catalog), terwijl het schakelen aan / uit de binaire direct visualiseren de cellen (Figuur 4F).
    7. Classificeren microgliacellen als ROI met Somal gebieden groter en kleiner dan 50-60 micrometer 2 naar cel somata discrimineren overeenkomt met geactiveerde microglia en gedeactiveerd microglia respectievelijk door het gebruik van Area Beperking.
      Opmerking: Elke cel Somal subset geïdentificeerd met een ander pseudocolored binaire laag, en kan verder worden gekarakteriseerd voor andere morfologische parameters (perimeter, circulariteit, etc.), en gekwantificeerd bij discrete retina sectoren (Figuur 4G). Sla de geanalyseerde afbeelding als een ND2 bestand.
    8. Controleer het proces en de vertakking complexiteit in individuele geactiveerde microglia cellen, door overlappen de Somal masker en de single xy afbeelding -punt (contrast steeg 50%; figuur 4H). Handmatig tellen van de processen die direct uitstrekt vanaf de cel soma of de diameter van de veelhoek omvat het gereedschap (gebruik Binary werkbalk en geannoteerde metingen).
      OPMERKING: Geactiveerde cellen missen processen of dragen weinig (<4) en korte (<2x Somal diameter) die, in tegenstelling tot niet-geactiveerde celprocessen, die een vertakte en uitgebreide arbor omvatten (> 3-10x Somal diameter) rond hun betrekkelijk kleine soma.
    9. Handmatig cellen herkennen somata kleiner dan <20 urn 2 en / of GFP expressie onder de detectielimiet, die derhalve door onopgemerkt intensity drempelen. Gebruik de Taxonomie commando in Annotations handmatig geïdentificeerd elementen tellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onze recente in vivo studies gebruikten deze levende beeldacquisitie en analysemethoden te visualiseren en volgen de kinetiek en patronen van ONH en retinale microgliale veranderingen tijdens vroege stadia van chronisch glaucoom en hun relatie tot eind neurodegeneratie 59. Hier tonen we een cSLO beeldacquisitie protocol microgliale cellen te visualiseren over een groot gebied van de centrale retina individuele jonge heterozygote CX3CR1-GFP DBA / 2J retina (Figuur 5). Op basis van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Live bewaking van microgliale celaantal en morfologische activatie bij een neurodegeneratieve ziekte vereist het gebruik van niet-invasieve beeldvorming methoden dat de gedetailleerde visualisatie van cel functies mogelijk. Na beeldvorming, moet microgliale cellen worden geïsoleerd (gesegmenteerd) voor morfometrische analyse met gebruik van meervoudige drempel stappen Somal grootte en / of complexiteit van het proces als uitlezingen voor microglia activatie beoordelen. In dit protocol beschrijven we methoden voor livebe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken het Scientific Computing and Imaging Institute van de Universiteit van Utah voor het gebruik van FluoRender software (R01GM09815). Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Glaucoma Research Foundation, Melsa M. en Frank Theodore Barr Foundation en het US National Institute of Health, (R01EY020878 en R01EY023621) aan M.L.V., en (R01EY017182 en R01EY017950) aan B.K.A.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DBA/2J en CX3CR1-GFP/+ muizenThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME000671 en 00582Muizen worden in huis gefokt, waarbij elke 3 - 4 generaties nieuwe fokkers worden geïntroduceerd om genetische drift te voorkomen.
30½ G naald en 1 ml tuberculine slip-tip spuitBD, East Rutherford, NJ305106 en 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% en fosfaatbufferzouwtablettenSigma-Aldrich, St. Louis, MOT48402, 152463 en P4417Avertin-oplossing (pH 7.3, steriel gefilterd) moet vers worden gemaakt of maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
Heat therapy T/PumpGaymar Industries, Orchard Park, NYTP-650
WattenstaafjesFisher Scientific, Pittsburgh, PA23-400-100
Tropicamide 1%Bausch & Lomb, Rochester, NYNDC 24208-585-64
PMMA contactlenzen, 1.70 base curve, 3.2 mm totale diameter, 0.40 mm dikke centrumCantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UKG003709Lenzen worden gespoeld met steriel PBS en bewaard in polypropyleendozen.
HRA/Spectralis confocale scanlaser oogspiegel en Eye Explorer softwareHeidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CAVersie 1.7.1.0
PowerPointMicrosoft, Redmond, WAVersie 14.4.3
Adobe PhotoshopAdobe, San Jose, CAVersie CS3
FluoRenderScientific Computing and Imaging Institute, University of UtahVersie 2.13Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements CNikon, Melville, NYVersie 4.30.01

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
  2. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  6. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  7. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57 (6), 563-581 (1999).
  8. Jonas, R. A., et al. The spider effect: morphological and orienting classification of microglia in response to stimuli in vivo. PloS One. 7 (2), e30763(2012).
  9. Kozlowski, C., Weimer, R. M. An automated method to quantify microglia morphology and application to monitor activation state longitudinally in vivo. PloS One. 7 (2), 1-9 (2012).
  10. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nat. Neurosci. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  11. Elmore, M. R., et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).
  12. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  13. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  14. Solomon, J. N., et al. Origin and distribution of bone marrow-derived cells in the central nervous system in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 53, 744-753 (2006).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat. Neurosc. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  16. Sapp, E., et al. Early and progressive accumulation of reactive microglia in the Huntington disease brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60 (2), 161-172 (2001).
  17. Maeda, J., et al. In vivo positron emission tomographic imaging of glial responses to amyloid-beta and tau pathologies in mouse models of Alzheimer's disease and related disorders. J. Neurosc. 31 (12), 4720-4730 (2011).
  18. Jacobs, A. H., Tavitian, B. Noninvasive molecular imaging of neuroinflammation. J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1393-1415 (2012).
  19. Ouchi, Y., et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson's disease. Ann. Neurol. 57 (2), 168-175 (2005).
  20. Fuhrmann, M., et al. Microglial Cx3cr1 knockout prevents neuron loss in a mouse model of Alzheimer's disease. Nat. Neurosci. 13 (4), 411-413 (2010).
  21. Trapani, A., Palazzo, C., de Candia, M., Lasorsa, F. M., Trapani, G. Targeting of the translocator protein 18 kDa (TSPO): a valuable approach for nuclear and optical imaging of activated microglia. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1415-1428 (2013).
  22. Venneti, S., Lopresti, B. J., Wiley, C. A. Molecular imaging of microglia/macrophages in the brain. Glia. 61 (1), 10-23 (2013).
  23. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat. Comm. 3 (1227), 1-15 (2012).
  24. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PloS One. 6 (3), e17910(2011).
  25. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp. Neurol. 254 (214), 109-120 (2014).
  26. Nayak, D., Zinselmeyer, B. H., Corps, K. N., McGavern, D. B. In vivo dynamics of innate immune sentinels in the CNS. Intravital. 1 (2), 95-106 (2012).
  27. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8 (11), 1-16 (2010).
  28. Wake, H., Moorhouse, A. J., Jinno, S., Kohsaka, S., Nabekura, J. Resting microglia directly monitor the functional state of synapses in vivo and determine the fate of ischemic terminals. J. Neurosci. 29 (13), 3974-3980 (2009).
  29. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J. Vis. Exp. 19 (43), (2010).
  30. Alt, C., Runnels, J. M., L, T. G. S., P, L. C. In vivo tracking of hematopoietic cells in the retina of chimeric mice with a scanning laser ophthalmoscope. Intravital. 1 (2), 132-140 (2012).
  31. Eter, N., et al. In vivo visualization of dendritic cells, macrophages, and microglial cells responding to laser-induced damage in the fundus of the eye. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (8), 3649-3658 (2008).
  32. Liu, S., et al. Tracking retinal microgliosis in models of retinal ganglion cell damage. Investigative ophthalmology & visual science. 53, 6254-6262 (2012).
  33. Maeda, A., et al. Two-photon microscopy reveals early rod photoreceptor cell damage in light-exposed mutant mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (14), E1428-E1437 (2014).
  34. Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
  35. Seeliger, M. W., et al. In vivo confocal imaging of the retina in animal models using scanning laser ophthalmoscopy. Vision Res. 45 (28), 3512-3519 (2005).
  36. Alt, C., Runnels, J. M., Mortensen, L. J., Zaher, W., Lin, C. P. In vivo imaging of microglia turnover in the mouse retina after ionizing radiation and dexamethasone treatment. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 55 (8), 5314-5319 (2014).
  37. Bosco, A., et al. Reduced retina microglial activation and improved optic nerve integrity with minocycline treatment in the DBA/2J mouse model of glaucoma. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 49 (4), 1437-1446 (2008).
  38. Anderson, M. G., et al. Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 30 (1), 81-85 (2002).
  39. Chang, B., et al. Interacting loci cause severe iris atrophy and glaucoma in DBA/2J mice. Nat. Genet. 21 (4), 405-409 (1999).
  40. Smith, R. S., Korb, D., John, S. W. A goniolens for clinical monitoring of the mouse iridocorneal angle and optic nerve. Mol. Vis. 8, 26-31 (2002).
  41. Buckingham, B. P., et al. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28 (11), 2735-2744 (2008).
  42. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J. Cell Biol. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  43. Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J. Cell Biol. 171 (2), 313-325 (2005).
  44. Soto, I., et al. Retinal ganglion cells downregulate gene expression and lose their axons within the optic nerve head in a mouse glaucoma model. J. Neurosci. 28 (2), 548-561 (2008).
  45. Bosco, A., Steele, M. R., Vetter, M. L. Early microglia activation in a mouse model of chronic glaucoma. J. Comp. Neurol. 519 (4), 599-620 (2011).
  46. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  47. Broux, B., et al. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J. Autoimmun. 38 (1), 10-19 (2012).
  48. Paques, M., et al. In vivo observation of the locomotion of microglial cells in the retina. Glia. 58 (14), 1663-1668 (2010).
  49. Charbel Issa, P., et al. Optimization of in vivo confocal autofluorescence imaging of the ocular fundus in mice and its application to models of human retinal degeneration. Invest. Ophthalmol., & Vis. Sci. 53 (2), 1066-1075 (2012).
  50. Beynon, S. B., Walker, F. R. Microglial activation in the injured and healthy brain: what are we really talking about? Practical and theoretical issues associated with the measurement of changes in microglial morphology. Neuroscience. 225 (2012), 162-171 (2012).
  51. Chan, J. W. Recent advances in optic neuritis related to multiple sclerosis. Acta Ophthalmol. 90 (3), 203-209 (2012).
  52. Frost, S., Martins, R. N., Kanagasingam, Y. Ocular biomarkers for early detection of Alzheimer's disease. J. Alzheimer's Dis. 22 (1), 1-16 (2010).
  53. Guo, L., Duggan, J., Cordeiro, M. F. Alzheimer's disease and retinal neurodegeneration. Curr. Alzheimer Res. 7 (1), 3-14 (2010).
  54. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 83 (9), 917-922 (2012).
  55. Kersten, H. M., Roxburgh, R. H., Danesh-Meyer, H. V. Ophthalmic manifestations of inherited neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurol. 10 (6), 349-362 (2014).
  56. Kesler, A., Vakhapova, V., Korczyn, A. D., Naftaliev, E., Neudorfer, M. Retinal thickness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 113 (7), 523-526 (2011).
  57. Petzold, A., et al. Optical coherence tomography in multiple sclerosis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 9 (9), 921-932 (2010).
  58. Satue, M., et al. Retinal thinning and correlation with functional disability in patients with Parkinson's disease. Br. J. Ophthalmol. 98 (3), 350-355 (2014).
  59. Bosco, A., Romero, C. O., Breen, K. T., Chagovetz, A. A., Steele, M. R., Ambati, B. K., Vetter, M. L. Neurodegeneration severity can be predicted from early microglia alterations monitored in vivo in a mouse model of chronic glaucoma. Dis Model Mech. , (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Retinale microgliaconfocale ophthalmoscopieCX3CR1 GFP muizenkwantificering van het soma oppervlakmuismodel voor glaucoomin vivo beeldvormingfluorescentiebeeldvormingdrempelsegmentatie

Gerelateerde artikelen