Methodenartikel

Isolatie van neurale stamcellen / stamcellen uit de periventriculaire regio van de volwassen rat en Human Spinal Cord

12.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52732

⸱

14 mei 2015

 , 
1Division of Genetics and Development, Toronto Western Research Institute and Krembil Neuroscience Center, 2Department of Surgery, Division of Neurosurgery, Toronto Western Hospital and University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

Het volwassen zoogdierspinaalmerg bevat neurale stam-/voorlopercellen (NSPC's) die kunnen worden geïsoleerd en uitgebreid in cultuur. Dit protocol beschrijft het oogsten, isoleren, kweken en passeren van NSPC's die zijn gegenereerd uit de periventriculaire regio van het volwassen ruggenmerg van de rat en van menselijke orgaantransplantatiedonoren.

Samenvatting

Volwassen ratten en menselijk ruggenmerg neurale stam / progenitorcellen (NSPCs) gekweekt in growth factor-verrijkt medium maakt de proliferatie van multipotente, zelfvernieuwende en expandeerbare neurale stamcellen. In serum condities, zullen deze multipotente NSPCs differentiëren genereren neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Het geoogste weefsel enzymatisch gedissocieerd in een papaïne-EDTA-oplossing en vervolgens mechanisch gedissocieerd en gescheiden door een discontinue dichtheidsgradiënt met een enkele celsuspensie wordt uitgeplaat die in Neurobasal medium aangevuld met epidermale groeifactor (EGF), basic fibroblast growth factor waardoor (bFGF ) en heparine. Volwassen rat ruggenmerg NSPCs worden gekweekt als vrij zwevende neurospheres en menselijke ruggenmerg NSPCs volwassen worden gekweekt als adherente culturen. Onder deze omstandigheden, volwassen ruggenmerg NSPCs vermenigvuldigen, express markers van voorloper cellen, en kan continu worden uitgebreid op passage. Deze cellen kunnen be bestudeerd in vitro in reactie op verschillende stimuli, en exogene factoren worden gebruikt om lineage restrictie bevorderen neurale stamcel differentiatie te onderzoeken. Multipotente NSPCs of hun nageslacht kan ook worden getransplanteerd in verschillende diermodellen om regeneratief herstel te beoordelen.

Inleiding

NSPCs zijn multipotent cellen toegewijd aan de neurale lijn die kan zichzelf vernieuwen en gemakkelijk uit te breiden in vitro. We verwijzen naar deze cellen als een gemengde populatie van neurale stamcellen / voorlopercellen, omdat ze geven eigenschappen van zelf-vernieuwing van multipotente stamcellen en meer beperkt voorouders. NSPCs worden gevonden in zowel de foetale en volwassen hersenen en het ruggenmerg 1,2. In de volwassen, NSPCs zijn doorgaans rustige en te verblijven binnen specifieke niches waaronder de subventriculaire zone langs de laterale ventrikels 2-4, en de periventriculaire regio rond het centrale kanaal van het ruggenmerg 5,6.

Gewoonlijk NSPCs gekweekt als vrij zwevende neurosferen of als hechtende monolagen in serumvrij medium aangevuld met EGF en bFGF, mitogenen die selecteren op de stam / voorlopercellen celpopulaties. De neurosphere assay oorspronkelijk ontwikkeld door Reynolds en Weiss 2, wordt het meest gebruikt om de cultuur en deuitbreiding van neurale stamcellen. NSPCs tonen multipotent wanneer ze uitgeplaat in growth factor-vrij medium dat serum, differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten. Multipotente, kan zelfvernieuwende NSPCs worden geïsoleerd en gekweekt uit het volwassen knaagdieren ruggenmerg wanneer de gekweekte weefsel omvat regio's van het centrale kanaal 6,7. Een potentieel voordeel bij het gebruik NSPCs gegenereerd uit het ruggenmerg volwassen tegenover genererende cellen uit andere gebieden is dat deze weefselspecifieke cellen meest op lijken cellen in het ruggenmerg die verloren gaan of beschadigd door verwonding of ziekte.

Eerder werk toonde aan dat neurosferen van het menselijk ruggemerg volwassen niet kon worden gepropageerd langdurige of gepasseerd om voldoende aantallen cellen te genereren 8,9. Echter, met wijzigingen in kweekomstandigheden, we meldde de uitbreiding en transplantatie van volwassen menselijke ruggenmerg afgeleid NSPCs, waaruit blijkt dat de zelf-vernieuwingen multipotent NSPCs kunnen worden geïsoleerd uit de menselijke ruggenmerg van orgaantransplantatie donors 10 volwassene. Vooral het verwijderen van de meeste witte stof tijdens dissectie en kweken van deze cellen op een hechtende substraat growth factor-verrijkt medium geselecteerd vanwege prolifererende menselijke spinal cord NSPCs volwassene. In dit protocol beschrijven we het oogsten van het ruggenmerg van volwassen rat en van mens orgaantransplantatie donors, dissectie van de periventriculaire weefsel, en het isoleren, kweken en uitbreiden van NSPCs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke procedures zijn goedgekeurd door de Animal Care Comite van de University Health Network, Toronto ON Canada, in overeenstemming met de in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren opgesteld door de Canadese Raad van Animal Care vastgesteld beleid. Voor het oogsten van de menselijke ruggenmerg weefsel, werd goedkeuring verkregen van de University Health Network Research Ethics Board en van de Trillium-Gift of Life Foundation die orgaandonatie toezicht houdt in Ontario, Canada.

1. Bereiding van Dissection Buffers en cultuurmedia

  1. Voor de isolatie van rat ruggemerg, bereiden 100 ml dissectie buffer (1x PBS + 0,6% glucose + 2% penicilline-streptomycine) en koel. Voor menselijke ruggenmerg bereiden 100 ml dissectie buffer (1x HBSS + 0,6% glucose + 2% penicilline-streptomycine) en in de koelkast.
  2. Bereid 100 ml serumvrij medium (SFM) en verwarm bij 37 ° C. Om SFM te bereiden, voeg 2 mM L-glutamine, 100 ug / ml penicilline-streptomycine, 2% B27 en 10% hormoonmengsel tot Neurobasal-A medium. Om hormoonmengsel bereiden, maak een 1: 1 DMEM / F12 medium dat 0,6% glucose, 3 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, 25 ug / ml insuline, 100 ug / ml apo-transferrine, 10 uM putrescine, 30 nM selenium, en 20 nM progesteron.
  3. Bereid de EFH groei- factor verrijkte plating media (SFM voeg 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF, en 2 ug / ml heparine) en verwarm bij 37 ° C. Zorg ervoor dat de menselijke EFH bevat humaan recombinant groeifactoren (zie tabel van Materials).

2. Oogst en Dissectie van volwassen rat periventriculaire ruggenmergweefsel

  1. Steriliseren ontleden instrumenten in ethanol en spoel in een steriele zoutoplossing, of autoclaaf instrumenten op voorhand. Geef ratten (6-8 weken oud) een letale injectie van natriumpentobarbital (1 cc bij 65 mg / ml) of overdosis verdovingsmiddel (ie, 4% isofluorane) volgens iemands orgaan goedgekeurd dierlijke protocol. DOuse de achterkant van de rat met 70% ethanol en verwijder de huid op het dorsale oppervlak met grote dissectie schaar.
  2. Houd de schaar loodrecht op het dorsale oppervlak dwars snijden de wervelkolom boven de achterpoten. Kleinere schaar om longitudinaal snijden de dorsale spier ligt over de wervelkolom in een rostraal richting om de doornuitsteeksels bloot te leggen.
  3. Vanaf het blootgestelde caudale einde plaatst rongeurs of een kleine stompe been cutting instrument extradurally in het laterale aspect van het spinale kanaal in de ruimte tussen het ruggenmerg en de wervelkolom. Maak kleine sneden in de plaat (benige bogen links en rechts van de doornuitsteeksels aan weerszijden van de wervels) en voorzichtig afpellen de lamina naar het ruggenmerg (Figuur 1A-D) blootstellen. Zorg ervoor dat de hoek van de schoepen is ondiep en evenwijdig aan het koord, zodat de onderliggende ruggenmerg niet beschadigd.
  4. Doorgaan laminectomie in de rostrale richting expoe de thoracale en cervicale ruggenmerg.
  5. Voorzichtig accijnzen het ruggenmerg van de wervelkolom met stompe weefsel pincet en gebruik microscissors zorgvuldig te verbreken de wortels aan het snoer los. Plaats de uitgesneden ruggenmerg in een petrischaal met 4 ° C steriele rat dissectie buffer (beschreven in 1.1). Spoel het weefsel in vers bereide 4 ° C ontleden buffer en met een schaar snijden het ruggenmerg dwars in 1 cm segmenten (figuur 1E).
  6. Voor elk segment van weefsel, gebruik maken van een hand om het weefsel met fijne tang te houden. Met de andere hand gebruikt microscissors de bovenliggende hersenvliezen, witte stof, en de meeste van de grijze stof voorzichtig verwijderd met behulp van een dissectie scope. Alternatief Gebruik fijn pincet (Dumont # 4) om de meeste van de grijze en witte stof afgepeld, waardoor alleen de periventriculaire gebied van het ruggenmerg die ependyma en een kleine hoeveelheid omgevingslicht grijze stof (figuur 1F-H) omvat.
  7. Pool de ontleed periventriculaire weefsel in een 10 cm steriele petrischaal met koude rat dissectie buffer.

3. Oogst en Dissectie van volwassen menselijke periventriculaire ruggenmergweefsel

Opmerking: Menselijk ruggemerg weefsel wordt verzameld uit volwassen orgaantransplantatie donoren (donoren varieerden in leeftijd 2-60 jaar) na elkaar ingewanden verwijderd orgaantransplantatie. De Trillium-Gift of Life Programma verkrijgt toestemming voor het verwijderen van weefsel voor onderzoeksdoeleinden van de familie van de patiënt en waarschuwt ons oogsten team in een tijdig, zodat we in staat zijn om de touwen te oogsten binnen 2 uur van de aorta cross-klemmen zijn geweest. Mannelijke en vrouwelijke volwassen donoren met een negatieve serologie en er geen infecties worden geaccepteerd.

  1. Harvest weefsel in een steriele mode in de operatiekamer via een anterieure benadering met dezelfde voorste blootstelling al ontleed voor orgel verwijdering door het orgel transplant oogsten team.
  2. Expose de anterieure wervelkolom door de terugtrekking met grote rib spreaders en grote peddel retractors van de overige weefsels en organen, inclusief de grote bloedvaten.
  3. Gebruik een sternale zaag gemonteerd lange mes doorsnijden de tussenwervelschijven in de rostrale en caudale uiteinden van de gewenste lengte van de wervelkolom moet worden weggesneden. Angle de zaag ongeveer 45 ° mediaal een driehoekige trog van het laterale deel van de wervels te stoppen net voor het wervelkanaal te snijden.
  4. Verwijder en bloc de mediale aspecten van de wervels van de gewenste segmenten met behulp van gebogen Osteotomen en hamer zorg om te voorkomen dat het doorsnijden van de dura. Til voorzichtig de dura bedekt ruggenmerg met getande tang en scherp incise de rostrale en caudale uiteinden van het snoer. Gebruik lange schaar en tang om bilateraal doorsnijden van de individuele wortels.
  5. Plaats de uitgesneden segment van het ruggenmerg bij 4 °; C steriele buffer (1x HBSS + 0,6% glucose + 2% penicilline-streptomycine) in een grote reageerbuis voor het transport naar de weefselkweek kamer.

  6. Opmerking: In het algemeen, een 3-6 cm segment van het ruggenmerg van de thoracale en / of midden-tot-laag thoracaal los zijn in de operatiekamer onder steriele omstandigheden zo snel mogelijk na het staken van de circulatie en in koude steriele buffer . De tijd tussen het stoppen van de circulatie en verwijdering van het ruggenmerg varieert met de tijd die nodig is om de beoogde organen voor donatie oogsten en varieerde van 45 min tot 2 uur. Als het hart en de longen werden ook verwijderd, kan de dissectie ver rostraal worden om een ​​gedeelte van de onderste cervicale snoer oogsten ook.
  7. Ontleden menselijke ruggenmergweefsel zo snel mogelijk na het oogsten, in het algemeen binnen 3 uur. Verwijder de dura en andere meninges met een pincet. Spoel het ruggenmerg weefsel in vers bereide 4 ° C dissectie buffer engesneden dwarsrichting in 1 cm segmenten.
  8. Met behulp van een dissectie scope, uitsnijden van de bovenliggende hersenvliezen, witte stof, en de meeste van de grijze materie met behulp tissue tang, fijne pincet en microscissors voor elk weefselsegment. Verzamel de periventriculaire ontleed weefsel, waarbij de ependyma en een kleine hoeveelheid omgevingslicht grijze materie, in een 10 cm steriele petrischaal met koude menselijke dissectie buffer omvat.

4. Isolatie en kweken van volwassen rat en Human Spinal Cord NSPCs

  1. Voer de volgende stappen aseptisch in een laminaire stroming kap.
    1. Hak de ontleed rat of menselijke periventriculaire weefsel in 1 mm 3 stuks met microscissors.
    2. Enzymatisch dissociëren gehakt weefsel met proteolytische enzymen met de papaïne dissociatie kit zoals aangegeven in de tabel van materialen / reagentia. NB: reagens componenten zijn 4 flesjes; Vial 1: Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), Vial 2: Papaïne met dagram L-cysteïne en EDTA, Vial 3: Deoxyribonuclease I (DNase), Vial 4: ovomucoïd proteaseremmer bovine serum albumine (BSA).
      Opmerking: Opmerking: Papaïne is een sulfhydryl protease dat brede specificiteit voor eiwitsubstraten heeft. De papaïne hierin wordt afgeleid uit de latex van de Carica papaja vaste degradeert meest eiwitsubstraten uitgebreider dan alvleesklier proteases. Tijdens het dissociatieproces er een celbeschadiging veroorzaakt DNA dat moet worden vrijgegeven in de dissociatie medium dat viscositeit verhogen en pipetteren moeilijk. Aldus DNase is opgenomen in de cel isolatiewerkwijze het DNA verteren zonder schade aan de intacte cellen. Ovomucoids zijn glycoproteïne proteaseremmers gebruikt om de papaïne-activiteit na de dissociatiestap remmen.
  2. Bij het eerste gebruik, reconstrueren de albumine ovomucoïde remmer mengsel (flacon 4) met 32 ​​ml EBSS (flacon 1) en bewaar bij 4 ° C en gebruik voor de daaropvolgende isolaties.Opmerking: Dit levert een oplossing voor een effectieve concentratie van 10 mg ovomucoid remmer en 10 mg per ml albumine.
  3. Voeg 5 ml EBSS (vial 1) een papaïne flacon (vial 2), waarbij een oplossing 20 eenheden papaïne / ml in 1 mM L-cysteïne met 0,5 mM EDTA. Controleer dat de papaïne oplossing wordt helder volledig is opgelost, het flesje enigerlei andere wijze in een 37 ° C waterbad gedurende tien minuten tot de papaïne volledig is opgelost volledige activiteit van het enzym te garanderen.
  4. Voeg 500 pl EBSS (vial 1) een DNase flacon (vial 3) en meng voorzichtig zoals DNase gevoelig is voor denaturatie afschuiving. Voeg 250 ul van DNase oplossing van de injectieflacon met papaïne, wat resulteert in een eindconcentratie van bij benadering 20 eenheden / ml papaïne en 0,005% DNase. Sla het saldo van de DNase flacon om later te gebruiken.
  5. Plaats gehakt ratten of menselijk weefsel in de papaïne oplossing bereid in stap 4.4. Voor het menselijk isolatie weefsel, verdeeld gehakt weefsel even tussen tweepapaïne flacons (ongeveer 0,2 g / flacon).
  6. Incubeer bij 37 ° C onder constant roeren op een rocker platform om het weefsel dissociëren in de geactiveerde papaïne oplossing. Incubeer rat weefsel voor 45 min tot 1 uur, en menselijk weefsel gedurende 1-2 uur afhankelijk van de hoeveelheid van gehakt weefsel, ongeveer 0,2 - 0,4 g respectievelijk.
  7. Tritureer het mengsel met een pipet 10 ml geven overblijvende weefselstukken dissociëren om een ​​troebele celsuspensie verkregen. Breng de celsuspensie (geen enkele stukjes gedissocieerde weefsel niet inbegrepen) in een steriele 15 ml conische buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in medium dat ovomucoid een papaïne inhibitor.
    1. Bereid de ovomucoïde oplossing door het mengen van 2,7 ml EBSS (flacon 1) met 300 ul van de opgeloste albumine-ovomucoïde inhibitor oplossing (flacon 4) in een 15 ml conische buis. Voeg 150 ul van DNase oplossing (flacon 3) opgeslagen in stap 4.4 hierboven.
    2. Verwijder het supernatant vande celpellets en onmiddellijk resuspendeer de celpellet in het verdunde DNase albumine-inhibitor mengsel.
  9. Afzonderlijke intacte cellen van celmembranen door centrifugatie door een discontinue stapsgewijze gradiënt dichtheid.
    1. Bereid de discontinue gradiënt dichtheid door toevoeging van 5 ml van albumine-inhibitor oplossing (flacon 4) in een 15 ml buis en pipetteren 5 ml, voorzichtig en langzaam laag de celsuspensie (bereid zoals hierboven beschreven in stap 4.8) bovenop het albumine-remmeroplossing.
    2. Centrifugeer bij 70 xg gedurende 6 min bij RT.
    3. Opmerking: De interface tussen de twee lagen van het verloop moet duidelijk zichtbaar zijn, hoewel minimaal mengen bij deze grens heeft geen invloed op het resultaat. Membraanfragmenten blijven op het grensvlak en gedissocieerde cellen pellet op de bodem van de buis.
  10. Voor cellen rat, gooi het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml rat EFH medium (voorverwarmd bij 37 ° C).Telling levende celdichtheid met een hemocytometer en plaat van de cellen in een T25 kolf met een dichtheid van 10 cellen / ul in EFH. De typische opbrengst aan cellen van rattenweefsel is ongeveer 2 x 10 6 cellen met ongeveer 80% viability.If klonale cultures gewenst, zaadcellen met een dichtheid van minder dan 10 cellen / ul. Incubeer de kolven bij 37 ° C in 5% CO 2 en laat de kweken groeien ongestoord gedurende 1 week om aggregatie van bollen te voorkomen.
  11. Voor humane cellen, gooi het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml humaan EFH medium (voorverwarmd bij 37 ° C). Filter de celsuspensie door een 40 pm nylon celzeef gevolgd door 30 ml EFH tegen myeline en celmembraan fragmenten te verwijderen. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de celpellet in 1 ml EFH medium.
  12. Telling levende celdichtheid met een hemocytometer en plaat het humane cellen in 6-putjes bij een dichtheid van 10 5 cellen / putje in een totaal volumevan 5 ml EFH / goed. De typische opbrengst aan cellen uit menselijk weefsel is ongeveer 1 x 10 6 cellen met ongeveer 70% levensvatbaarheid. Pre-coat putten met een aanhanger substraat zoals Matrigel (zie opmerking hieronder). Verdun in een verhouding van 40 pl Matrigel: 1 ml SFM.
  13. Opmerking: Als alternatief kunnen andere hechtende substraten zoals poly-D-lysine / laminine, fibronectine of collageen gebruikt.
  14. Incubeer de platen bij 37 ° C in 5% CO 2 en laat de kweken ongestoord groeien 1 week.

5. Passage van volwassen rat en de menselijke ruggenmerg NSPCs

  1. Rat NSPCs zullen kleine neurospheres ongeveer 70 micrometer in diameter binnen 1 week van de initiële zaaien vormen; passage rat NSPCs wekelijks door het verzamelen van de celsuspensie, centrifugeren bij 300 g gedurende 5 min, en mechanisch wrijven de celpellet de neurosferen dissociëren.
  2. Zaad van de gescheiden cellen in T25 kolven met verse rat EFH medium. Als alternatief,Gebruik 50% geconditioneerd medium rat voor passage. De typische opbrengst van NSPCs rat bij passage is ongeveer 5 x 10 6 cellen die exponentieel toeneemt met de passage nummer.
  3. Voor de menselijke culturen, één week na de eerste plating, vervangt de helft van het kweekmedium met verse EFH tweemaal per week om de cellen te hechten aan het substraat. In het algemeen 1-2 weken later nadat de cellen aan het substraat hebben gehecht, vervangt het gehele volume cultuurmedium tweemaal per week met verse EFH.
  4. Subcultuur cellen voordat confluentie tussen 4-8 weken.
    1. Subcultuur cellen door het losmaken van de cellen enzymatisch substraat (zie tabel of Materials) met 2 ml enzym per put gedurende ongeveer 10 minuten bij 37 ° C. Verzamel celsuspensie wordt gecentrifugeerd bij 300 xg gedurende 5 min, en voorzichtig resuspendeer de celpellet in 1 ml vers bereide EFH medium.
    2. Telling levende cellen met een hemocytometer en plaat de cellen in 6-well kweekplaten (pre-coated zoals beschreven in stap 4.12) bij een dichtheid van 10 5 cellen / putje in een totaal volume van 5 ml EFH / putje. De typische opbrengst van de menselijke NSPCs bij passage is ongeveer 2 x 10 6 cellen en in het algemeen zal dit verdubbelen met een passage. Algemeen onderhouden culturen 50% geconditioneerd medium EFH 2-3 maal per week tussen passage.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volwassen rat ruggenmerg cellen gekweekt in suspensie cultuur in EFH medium zullen kleine neurosferen (kolonies van ongedifferentieerde cellen) binnen 1 week van de eerste platen vormen. In primaire kweken, de meeste van de cellen uitgeplaat sterven en growth factor-responsieve stamcellen prolifereren en worden geselecteerd in de EFH medium. Bij passage 3, zal er tal vrij zwevende neurospheres ongeveer 100 urn in diameter (figuur 2A). Neurospheres zijn rond en fase-licht en sterk vergroot worden cilia-a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tijdens de dissectie van de rat ruggenmergweefsel zorg moet worden genomen het ruggenmerg niet te beschadigen tijdens het uitvoeren van de laminectomie. Het is gemakkelijker om de periventriculaire weefsel te isoleren wanneer de ruggenmergsegmenten intact. Het weefsel segmenten moet volledig worden ondergedompeld in de dissectie buffer en de bovenliggende hersenvliezen en witte stof kan worden weggesneden als longitudinale stroken met microscissors. Als alternatief kan fijn weefsel tang worden gebruikt om de witte stof ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de steun bedanken van Spinal Cord Injury Ontario, het Ontario-China Research and Innovation Fund, de Toronto General and Western Hospital Foundation en de Physicians’ Services Incorporated Foundation. De auteurs danken Dr. Tasneem Zahir voor deskundig advies bij de kweek van menselijke spinale koord NSPC, en Drs. Cindi Morshead en Iris Kulbatski voor hun deskundig advies bij de isolatie van rattenspinale koord NSPC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x PBSLife Technologies#10010023Dissectiebuffer
1x HBSSLife Technologies#14175095Dissectiebuffer
D-glucoseSigma# G-6152Bereid 30% glucose stockoplossing voor dissectiebuffer en hormoonmix
Penicillin-StreptomycinLife Technologies#15140-148Dissectiebuffer en kweekmedium
Neurobasal-A Life Technologies#10888-022Kweekmedium
L-glutamine, 200 mMLife Technologies#25030-081Kweekmedium
B27Life Technologies#12587010Kweekmedium
DMEMLife Technologies#11885084Hormoonmix
F12Life Technologies#21700-075Hormoonmix
NaHCO3Sigma# S-5761Bereid 7,5% NaHCO3 stockoplossing voor hormoonmix
HEPESSigma#H9136Bereid 1M HEPES stockoplossing voor hormoonmix
InsulinSigma#I-5500Hormoonmix
Apo-transferrinSigma#T-2252Hormoonmix
PutrescineSigma# P7505Hormoonmix
SeleniumSigma#S-9133Hormoonmix
ProgesteroneSigma#P-6149Hormoonmix
EGF, mouseSigma#E4127Bereid 100 μg/ml stocks in B27 en verdeel in aliquoten; EFH medium
EGF, human recombinantSigma#E9644Bereid 100 μg/ml stocks in B27 en verdeel in aliquoten; EFH medium
bFGF, human recombinantSigma#F0291Bereid 100 μg/ml stocks in B27 en verdeel in aliquoten; EFH medium 
Heparin, 10,000 USigma#H3149Bereid 27,3 mg/ml stocks in hormoonmix en verdeel in aliquoten; EFH medium
Papain dissociation kitWorthington Biochemicals#LK003150Bevat EBSS, papaïne, DNase, ovomucoïde protease-remmer met BSA
Sodium PentobarbitalBimeda – MTC Animal Health IncDIN 00141704
Tissue Forceps: AddisonsFine Science Tools#11006-12 Getande standaard tip; micro-tip ook beschikbaar
Fine Forceps: Dumont #4Fine Science Tools#11241-30
MicroscissorsFine Science Tools#15024-10Ronde handgreep Vannas
RongeursBausch & LombN1430
10 mm Petri dishes Nunc1501
T25 Culture flasksNunc156367
40 μm nylon cell strainerVWRCA21008-949
6 well platesNuncCA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100x)Corning354230Ontdooi volgens de aanwijzingen en bevries aliquoten; gebruik verdund in een verhouding van 40 μl Matrigel: 1 ml SFM

Referenties

  1. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  4. Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  5. Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
  6. Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
  7. Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
  8. Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
  9. Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
  10. Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079(2011).
  11. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
  12. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
  13. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  14. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
  15. Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
  16. Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
  17. Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10(2005).
  18. Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neurale stamcellenisolatie uit het ruggenmergenzymatische dissociatiecentrifugatie met dichtheidsgradi ntvorming van neurosferenimmunofluorescentiemicroscopiegroeifactormediumexpansie van celculturenlijnbeperking

Gerelateerde artikelen