Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Viraal-gemedieerde Labeling en Transplantatie van Medial ganglion Eminence (MGE) Cellen voor

11.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52740

⸱

23 april 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, University of California San Francisco, 2Department of Neurological Surgery, University of California San Francisco

In dit artikel

Samenvatting

GABAergische corticale interneuron voorouders te verspreiden, te ontwikkelen en synaptically integreren in een gastheer cortex na transplantatie. Deze cellen kunnen gemakkelijk worden getransduceerd voor transplantatie in vivo studies van genetisch gemodificeerde GABAerge precursoren. Hier tonen we virale etikettering technieken om specifieke interneuron subgroepen met behulp van bestaande Cre lijnen en Cre-afhankelijke verslaggevers richten.

Samenvatting

GABAergische corticale interneuronen, afgeleid van de embryonale mediale en caudale ganglion grootheden (MGE en CGE), zijn functioneel en morfologisch divers. Vooruitgang hebben geboekt in het begrijpen van de rol van afzonderlijke corticale interneuronen subgroepen, maar er zijn nog vele mechanismen worden uitgewerkt die kunnen bijdragen aan de ontwikkeling en rijping van verschillende GABAerge cellen. Bovendien kan veranderd GABAerge signalering bijdragen aan fenotypen van autisme, schizofrenie en epilepsie. Specifieke Cre-driver lijnen zijn begonnen met het verkavelen van de functies van unieke interneuron subgroepen. Ondanks de vooruitgang in muismodellen, is het vaak moeilijk om efficiënt studeren GABAerge interneuronen corticale progenitorcellen met moleculaire benaderingen in vivo. Een belangrijke techniek die gebruikt wordt om de cel autonome programmering van deze cellen te bestuderen is transplantatie van MGE cellen in gastheer cortex. De getransplanteerde cellen migreren uitgebreid, differentiëren, eennd functioneel integreren. Bovendien kunnen MGE cellen efficiënt worden getransduceerd met lentivirus onmiddellijk voorafgaand aan transplantatie, waardoor een veelheid aan moleculaire benaderingen. Hier hebben we detail een protocol om efficiënt transduceren MGE cellen voor transplantatie voor in vivo analyse, met behulp van beschikbare Cre-driver lijnen en Cre-afhankelijke expressie vectoren. Deze benadering is voordelig omdat het een combinatie nauwkeurige genetische manipulatie het vermogen van deze cellen te verspreiden na transplantatie, waardoor grotere celtype bepaalde resolutie in vivo.

Inleiding

GABAerge corticale interneuronen omvatten ~ 20-30% van neuronen in het zoogdier neocortex, terwijl het overige overeen met prikkelende, glutamaat OG neuronen. Interneuronen zijn zeer divers in elektrofysiologische eigenschappen, axon en dendriet morfologie en synaptische targeting 1, en ​​onevenwichtigheden in prikkelende / remmende toon worden verondersteld om een aantal fenotypes van neurologische / neuropsychiatrische aandoeningen zoals autisme, schizofrenie en epilepsie 2 ten grondslag liggen. Het algemene doel van de hierin beschreven protocol is een middel om GABAerge interneuronen corticale progenitorcellen efficiënt genetisch modificeren vóór transplantatie in vivo analyse te verschaffen.

Corticale GABAergische interneuronen zijn geboren in de mediale en caudale ganglion grootheden (MGE en CGE, respectievelijk) 3,4 evenals de preoptic gebied 5. Corticale interneuron voorouders ondergaan lange afstand tangentiële migratie gevolgddoor radiale migratie naar hun uiteindelijke doelen te bereiken. Bij aankomst op de plaats van bestemming, moeten deze corticale interneuronen correct te integreren in het bestaande netwerk van neuronen, en elke unieke interneuron subgroep zal bijdragen aan corticale circuits op specifieke manieren. Vier belangrijke subgroepen kunnen worden onderscheiden door moleculaire markers: MGE-afgeleide somatostatine (SST) + en parvalbumine (PV) + subgroepen, en CGE-afgeleide vasoactieve intestinale peptide (VIP) + en Reelin +; SST - subgroepen 6. Verschillende corticale interneuronen subgroepen geboren op verschillende momenten tijdens de embryonale ontwikkeling in de MGE en CGE 7, 8. Deze en andere corticale GABAerge interneuronen merkers zijn gebruikt om specifieke Cre-driver lijnen voor veel van deze subgroepen 9-11 genereren.

De transplantatie van MGE progenitorcellen ontstaan ​​als potentiaalvrij celtherapie stoornissen die kunnen worden veroorzaakt door onbalans behandelenin excitatie / inhibitie 12-24. Deze therapeutische voordelen kunnen deels te wijten aan het unieke vermogen van MGE voorlopers (te verspreiden, differentiëren en integreren in een gastheer hersenen), of potentieel omdat veel peri-somatische remmende PV + cellen afkomstig zijn van de MGE. MGE cellen kunnen ook snel en efficiënt getransduceerd met lentivirussen vóór transplantatie 15, waardoor cellen die genetisch gemodificeerd in vitro worden bestudeerd in vivo. De reden voor de ontwikkeling van deze aanpak was om wegversperringen in het bestuderen GABAergic corticale interneuron ontwikkeling en rijping te overwinnen. Vooral MGE transplantatie liet onderzoekers de ontwikkeling van mutante cellen in vivo onderzoeken bij de mutante muis anders zou gestorven in een vroeg tijdstip. Bovendien, door het introduceren genen van belang voor transplantatie, de effecten van specifieke genen op een mutant fenotype worden vastgesteld bij een efficient manier.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol te MGE transduceren met lentivirussen voorafgaand aan de transplantatie. Daarnaast tonen we hoe deze techniek kan worden aangepast om een ​​gen van belang in specifieke interneuron subgroepen expressie uit een heterogene groep van corticale interneuronen voorlopers, met een combinatie van Cre-afhankelijke expressie lentivirussen en beschikbare Cre-driver muizenlijnen. Bovendien, dit protocol introduceert technieken en een platform voor onderzoekers genetisch GABAerge corticale interneuronen voorlopers in vivo studies wijzigen op een unieke manier. Een voordeel van deze techniek boven andere huidige benaderingen is dat de getransplanteerde cellen MGE weg van de injectieplaats uiteenvalt. Ook, in tegenstelling focale virale injecties, na MGE cellen verspreiden hun morfologie is gemakkelijker te beoordelen. Deze benadering kan worden gebruikt om het effect van het introduceren van genen van interesse in wildtype of mutante cellen introduceren van een celtype specifieke studiereporter morfologie beoordelen of potentieel het effect van ziekte allelen in vivo.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Ethische verklaring: De volgende procedures zijn door onze instelling en dier protocol goedgekeurd. Zorg ervoor dat u toestemming voor alle procedures waarin survival operaties voor het begin van experimenten te krijgen en controleren van alle protocollen zijn up-to-date.

1. Lentivirus Voorbereiding (optionele stap)

  1. Split drie 10 cm platen van HEK293T cellen voor elk lentivirus te maken, in aanwezigheid van 10 ml DMEM / 10% FBS, en groeien tot ~ 60-70% confluentie. Groeien cellen in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
  2. Transfecteren de volgende DNA-plasmiden (10 pg totaal) in elke plaat met elke transfectie reagens: 6.4 ug CAG-Flex-GFP lentivirale vector (vector DNA sequentie verschaft in Tabel 1), 1,2 ug pMD2.G (codeert voor VSV-G), 1.2 ug pRSV-Rev, en 1,2 ug pMDLg / pRRE. De drie lentivirale verpakking vectoren zijn commercieel verkrijgbaar (Tabel
    Opmerking: Deze bijzondere aanpak maakt gebruik van 3e generatie lentiviral vectoren maar 2e generatie vectoren en bijbehorende plasmiden zullen ook werken.
  3. Bereid een afvalcontainer met een 10% bleekwater oplossing binnen een BSL2 gecertificeerde kap om eventuele oplossingen of apparaten die contact of bevatten lentivirus inactiveren. Volgende, volledig te verwijderen van de media 4-6 uur na transfectie in de bleekwater oplossing, vervangen met hetzelfde volume van nieuwe media, en laat de cellen om te groeien.
  4. Na 4 dagen, verzamel medium in 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 15 min om alle celresten te pelleteren. Vervolgens, filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,45 urn membraan. Elke laag eiwit bindende filter, zoals PVDF, werkt goed. Let op: plaats zowel vaste als vloeibare virale afval in de bleekwater oplossing.
  5. Load 30 ml gefiltreerde bovenstaande in ultracentrifugebuizen en in een ultracentrifuge. Centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 2,5 uur bij 4 ° C. Open de centrifuge buizen in een BSL2 motorkap en verwijder supernatant tot 10% bleekmiddel. Voeg ~ 100 pl PBS om het pellet, die titers van 1x10 ^ 7-8 infectieuze eenheden / ml oplevert. Aliquot de volgende dag en bewaar bij -80 ºC. Lentivirus aliquots zijn stabiel bij -80 ° C gedurende ten minste zes maanden.
  6. Belangrijke overweging: Veel instellingen hebben nu virale kernen. Verwerven geconcentreerde virus met een minimum titer van 1x10 7 infectieuze eenheden / ml, voor een optimaal resultaat.

2. donormuizen voor MGE Dissection

  1. Ten eerste, het opzetten van een getimede paring tussen een Cre-uiting lijn van rente en ofwel een wild-type (WT) muis of een muis die een verslaggever na Cre-gemedieerde recombinatie zal uiten.
    Opmerking: Veel Cre-driver lijnen zijn transgene en worden onderhouden en getogen in de hemizygoot staat. Aldus zal slechts de helft van de embryo de Cre transgen bevatten. DNA kan snel worden bereid uit de embryo kort PCR om het Cre allel te detecteren. De Cre + embryo kan vervolgens worden geoogst zodat alleen de MGE weefsel van het gewenste genotype wordt gebruikt. Alternatitief kan een Cre-afhankelijke reporter worden gebruikt om de embryo's voor MGE dissectie en transplantatie selecteren.
  2. Berekenen welke dag zal overeenkomen met E13.5. Als dieren vóór werden gekoppeld de avond, de dag van de plug is 0,5. Bestel timed-zwangere muizen of een WT vrouw met P1 pups om tijd met postnatale (P) 1 muizen op de dag dat de donor weefsel zal E13.5 zijn. Als alternatief, het opzetten van deze paringen in het huis van een week voorafgaand aan de donordieren koppelen.
    Opmerking: De eerstgenoemde strategie genereren zowel E13.5 en P1 embryo / pups dezelfde dag vaak niet betrouwbaar te doen.

3. Voorbereiding van de Media, apparatuur en toebehoren.

  1. Bereid de reagentia en instrumenten voor MGE celpreparaat (tabel 2).
    1. Bereid een zuiver oppervlak en schoon forceps, scharen en hetzij een microchirurgische mes of fijne pincet (nauwkeurige weefseldissectie) op het oppervlak.
    2. Bereid Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), fof dissectie en middelgrote Dulbeco's gemodificeerd Eagle's (DMEM) met 10% foetaal runderserum surem (FBS) voor transductie.
    3. Preincubate 20-30 ml DMEM / 10% FBS in een 37 ° C weefselkweek incubator gedurende 1 uur. Het deksel moet worden losgemaakt om voor gasuitwisseling en pH evenwicht van de media.
      Opmerking: De media preïncubatie kunnen worden bereid net voor aanvang van de dissectie.

4. MGE Cell Voorbereiding

  1. Offeren de zwangere muis volgens een goedgekeurde dier protocol en verwijder de embryo's in een 10 cm petrischaaltje met ijskoude HBSS.
  2. Verwijder de hersenen van elk embryo met behulp van een dissectie scope (doe een tegelijk, waardoor de rest van het embryo in de ijskoude HBSS) en ga dan verder uit te snijden de MGE weefsel.
    Opmerking: hieronder Gedetailleerde, en in figuur 1, zijn de belangrijkste stappen zien hoe de MGE verwijderen. Bovendien, figuur 2 een film met de volledige ontledingprocedure.
    1. Plaats de hersenen met ventrale zijde naar boven (de figuren 1A, A '). Let op: het is ook goed om de dorsale zijde naar boven. Snijd de hersenen in de helft langs de saggitale vliegtuig naar twee stukken te genereren. Een voorbeeld hemisected hersenen wordt getoond (Figuur 1B, B '), merkt dat dorsale (de bovenliggende cortex) en ventrale aspecten van de hersenen dekking en rondom het ganglion eminence (GE) weefsel.
    2. Vervolgens, met een dominante hand de beide zeer fijne tang of stabknife (tabel 2), terwijl immobiliseren de halve bol met een tang gehouden door een niet-dominante hand. (Mediale aspect Het halfrond moet naar boven wijzen). Vouw de dorsale en ventrale weefsel met een pincet en een steek mes om de onderliggende GE weefsel (figuur 1C en schematisch in figuur 1C) onthullen.
      Opmerking: Het verwijderen van sommige media van de dissectie petrischaal kan het gemakkelijker maken om het weefsel terwijl pe stabiliserenrforming de MGE dissectie.
    3. Maak rechte sneden met de stabknife of fijne tang om de CGE, LGE en septale weefsels te scheiden (zie voorbeeld bezuinigingen aangegeven door rode stippellijnen, Figuren 1D en D '). Deze besparingen kunnen worden gemaakt in een willekeurige volgorde.
      Opmerking: Stel je de MGE als een 'doos', dat is gesneden uit het omliggende weefsel. Dit helpt reproduceerbaar te maken vergelijkbaar bezuinigingen voor elke dissectie, waardoor de variabiliteit in weefsel dissecties verminderen.
    4. Tot slot zet de MGE op zijn kant en trim van de bodem (wat was het laterale aspect van de hersenen). Dit verwijdert de mantel zone van de MGE (gooi in de figuren 1E en 1E ') van de rest van de MGE. De resterende aspect van MGE bevat voornamelijk ventriculaire zone subventriculaire zone gedeelten van de MGE, waarvan bijna alle MGE voorlopercellen bevat. Doorgaan met dit weefsel.
  3. Belangrijk overweging: De toevoeging van siliconengel onderaan een petrischaal can dienen als een uitstekende dissectie oppervlak beschermt de gevoelige uiteinden van forceps en verschaft een zacht aan pinnen weefsel met een pincet.

4.3 Aanvullende strategieën voor MGE Dissection.

  1. Snijd de huid van het embryo met behulp van een tang, zoals een schaar om snel de hersenen te verwijderen. Aangezien het embryo ligt op zijn kant, houdt het weefsel aan de basis van de kop met de tang gebruikt om het weefsel te verankeren. Eerste, snijd voorste ventrale naar de hersenen en achterste ventrale naar de hersenen, en sluit vervolgens de twee sneden langs de zijkant van het embryo. Dan grijp de flap van de huid en trek deze over de bovenkant van de hersenen. De hersenen kan dan snel worden ontleed van het restmateriaal.
  2. Als alternatief, verankeren het achterste deel van het hele brein achter de cortex. Ondertussen, pakt elk halfrond op de meest dorsale caudale aspect van de cortex en scheur de cortex weg van de verankerde weefsel in een anterieure richting. Op deze manier kan zowel cortices kan worden verwijderd en de bilaterale ganglion grootheden worden onthuld, nog aan de rest van het weefsel behouden de mediale-laterale anatomie.
  3. Schakelaar om de stab-mes om precies te zagen rond de MGE op elk halfrond te maken. Gebruik ofwel een aparte schone set tang om de MGE of een pipet met een grote tip (dwz., P1000) te verzamelen.
    Opmerking: Bewaar het verzamelde weefsel weg van alle andere ontleed materiaal, zoals sommige media is onvermijdelijk overgedragen wanneer de MGE wordt verzameld.
  4. Verzamel de MGE en plaats het weefsel in een 1,5 ml verzamelbuis DMEM / 10% FBS, (een volume van 500 gl voldoende is om de MGEs verzamelen). Herhaal dit voor het andere halfrond en plaats in dezelfde collectie buis. Houd monsters op ijs tot alle weefsel wordt verzameld.

5. Lentiviral etikettering en Transplantatie

  1. Beweeg de buizen van MGE weefsel in een BSL2 gecertificeerd motorkap en verwijder de media.
    Opmerking: DeMGE weefsel groot genoeg zichtbaar voor het oog en zal naar de bodem van de buis waardoor de koude media gemakkelijk en voorzichtig verwijderd.
  2. Voeg -500 ul DMEM / 10% FBS medium dat werd geïncubeerd in een 37 ° C weefselkweek incubator. Voeg vervolgens polybreen transductie aan elk buisje een eindconcentratie van 8 ug / ml vergemakkelijken. Vermaal de MGE weefsel om een ​​enkele celsuspensie te maken met behulp van een P1000 pipetpunt. Voeg tenslotte ~ 15-20 ul geconcentreerd lentivirus aan elke buis.
  3. Belangrijk beoordeling: A trituratie 10-12 keer voldoende te breken MGE weefsel van een embryo, maar verwrijvingen kan nodig zijn als meerdere MGEs elkaar worden samengevoegd. Probeer verschillende aanwrijven voorwaarden om het beste bepalen wat werkt.
  4. Stevig te sluiten elke buis, omkeren om te mengen, dan plaats alle buizen in een 37 ° C incubator. Incubeer de cellen in lentivirus gedurende ten minste 30 minuten en tot 1 uur. Langere tijden hebben geleid tot degevouwen levensvatbaarheid van de cellen. Keer de buizen elke 10 minuten, totdat de tijd om is.
  5. Na incubatie met lentivirus, verwijdert de buizen uit de incubator en centrifugeer bij ~ 700 xg gedurende 3 minuten om de cellen te pelleteren. In de BSL2 kap, verwijder het supernatant af en gooi die in 10% bleekwater. Voeg vervolgens 1 ml DMEM / 10% FBS en vermaal de pellet 2-3 keer te wassen, opnieuw gecentrifugeerd bij dezelfde snelheid om de cellen te pelleteren daarna. Herhaal deze wash-stap 2-3 keer om overtollig virus te verwijderen.
    Opmerking: Voer centrifugatiestappen bij 4 ° C, maar verminderde levensvatbaarheid werd niet waargenomen wanneer korte spins worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
  6. Na de laatste wasbeurt, verwijder zoveel media mogelijk en zet elke buis op ijs. Door resterende media aan de zijkanten van de buis, ~ 2-3 gl media eindigen voor de celpellet door de tijd transplantatie procedure begonnen.

6. Transplantation and Validation

  1. Verwerven gastheer P1 pups en voorbereiden van de proceduregebied door spuiten naar beneden met 70% ethanol. Om de steriliteit te behouden tijdens de procedure is het raadzaam om deze procedures uit te voeren in een speciale procedure schone kamer. Daarnaast gebruiken ofwel geautoclaveerd chirurgische instrumenten te steriliseren oppervlakken die de pups in contact met 70% ethanol. Een voorbeeld van representatieve apparatuur nodig transplantaties en een representatieve procedure stippellijn voeren wordt getoond in figuur 3.

Opmerking: deze procedure is een injectie van kleine volumes, en niet een chirurgische procedure die een insnijding, open wonden of hechtingen vereist, wordt het nog steeds aanbevolen dat een nieuwe micropipet wordt gebruikt voor elke muis worden geïnjecteerd. De micropipetten zijn warmte gesteriliseerd wanneer getrokken en afgeschuind op een oppervlak dat werd bespoten met 70% ethanol wordt opgeslagen in een verzegelde container.

  1. Genereer micropipetten tot een diameter aan de top hebben tussen de 40-80 micrometer. Naar aanleiding van deze afmetingen zal optimale opbrengstresultaten. Hitte steriliseren de micropipetten wanneer getrokken en afgeschuind op een oppervlak en spuit met 70% ethanol voor het opslaan van de micropipetten in een gesloten container.
    Opmerking: Als alternatief, als toegang tot de inrichtingen die nodig zijn om deze naalden te maken (tabel 2) wordt beperkt, op een andere injectie-inrichting. Desalniettemin kunnen niet zo geschikt als de micropipetten gevolg van verschillende diameters.
  2. Opstellen van minerale olie in een spuit van 1 ml, en met een 30 1/2 G naald, vul de glazen pipet met minerale olie. Mount vervolgens de zuiger op de stereotaxische apparaat en bevestig vervolgens de glazen pipet om de stereotaxische apparaat en de belasting op de zuiger. Met behulp van de hydraulische aandrijving, bewegen de zuiger ongeveer halverwege in de glazen pipet, het verwijderen van minerale olie die uit morsen met een schone een schone papieren handdoek.
    1. Als alternatief voor een injectiespuit, onderdompelen achterkant van de pipet in minerale olie en gevuld door capillaire werking. Om te voorkomen dat luchtbellen in het pipette handhaven positieve druk op de spuit totdat volledig uit de glazen pipet.
      Opmerking: Andere apparaten kunnen worden gebruikt om MGE cellen 14 met succes te transplanteren. Elk apparaat dat kan leveren een volume kleiner dan of in de buurt van 100 nl werkt goed voor deze procedure.
  3. Vervolgens gebruikt u een steriele papieren handdoek, of een absorberend materiaal, met de hoek gedraaid tot een fijne punt om delicaat verwijderen overtollige media boven de MGE cel pellet. Deze stap concentreert de celdichtheid zodat kleinere injectievolume worden bereikt. Vervolgens gebruikt u een laag volume (P2 heeft de voorkeur) pipet langzaam het opstellen van de cel pellet en vermaal 1-2 keer vóór het verplaatsen van de celsuspensie op een hydrofoob oppervlak. Het volume moet net onder 1 pl. Beweeg de punt van de naald in de cel schorsing en het gebruik van de hydraulische aandrijving, het opstellen van de celsuspensie in de pipet.
  4. Verdoven een P1 pup via onderkoeling (verpakken in een latex handschoen en op ijs gezet voor ~ 2-4 min).Controleren op effectiviteit van anesthesie met een schadelijke stimulus. Neem de huid tussen de tenen met fijne tang: de pup moet niet meer reageert als geknepen. Plaats vervolgens de pup op een schimmel die onder de injectie apparaat, dan maken de huid strak door terug te trekken van de huid op het hoofd en het beveiligen met standaard lab tape.
    Opmerking: Terwijl onderkoeling is zeer effectief op neonatale muizen en resulteert in lage sterftecijfer, moet procedures snel worden gedaan, als pups zal beginnen te herstellen in minder dan 10 min. Daarnaast, 4 min op ijs is een bovengrens van wat kan worden getolereerd. Probeer alleen onderkoeling veroorzaken keer als er een langere tijd nodig is voor injecties. Echter, als een pup herstelt vroeg, eerst toestaan ​​dat de pup zich volledig te herstellen voordat u opnieuw onderkoeling. Bovendien kunnen alleen onderkoeling één induceren meer tijd om injecties te voeren. Pups zullen herstellen binnen 5-10 min van onderkoeling. Dit kan worden vergemakkelijkt door het plaatsen van de pups met strooisel en moeder of door het plaatsen van de pup op een warme surface om te herstellen.
  5. Met een stereotaxische apparaat, plaatst het uiteinde van de glazen pipet op het oppervlak op het hoofd van het jong, loodrecht op het oppervlak van de weg. Wanneer de pipet in contact met het hoofd, beschouwen dit als '0'. Vervolgens duw de pipet door het oppervlak van de huid en de schedel in de cortex, steek en trek de pipet ~ 2 keer alvorens te stoppen. Voor optimale targeting van cellen in de neocortex, worden injecties uitgevoerd wanneer de micropipet is op een diepte van 0,1 mm. Dit moet echter worden geoptimaliseerd door de gebruiker (zie opmerking hieronder).
    Noot: Hoewel deze diepte betrouwbaar richt diepere neocorticale lagen met de hierboven beschreven inrichtingen, enkele diepten worden getest empirisch bepaald. Bovendien moet een reeks verschillende diepten rostro-caudale en medio-laterale positie worden getest om te bepalen welke diepte optimaal bij elke plaats. Ook moet de initiële punctie snel zijn, zo langzaam penetratie in de neocortex vermindert het vermogen tot cleanly doordringen in de weefsels. Probeer verschillende snelheden bij de eerste start van deze procedure te vinden wat het beste werkt. Bovendien, voor het testen coördinaten, is er geen echt alternatief voor het gebruik van gemerkte cellen, kleurstoffen onbetrouwbaar positie duiden zijn.
  6. Zodra de naald in positie is, draait u de hydraulische apparaat aan op de zuiger verder te gaan in de glazen pipet, het duwen van een reeks volume van celsuspensie in de cortex. Injecteren 50-70 nls per site. Herhaal deze procedure in 3-6 verschillende plaatsen en op verschillende rostrale-caudale niveau als het doel is om een ​​brede verdeling van cellen in de neocortex verkrijgen.
    Opmerking: De volumes van 100 nl of groter kan letsels veroorzaken en leiden tot grote pollen van geïnjecteerde cellen die niet aan efficiënt migreren uit de injectieplaats. Zo kleinere injectievolumes (~ 70 nl of minder) zijn optimaal, dan meer sites als de tijd het toelaat.
  7. Wanneer injecties zijn voltooid, verwijdert u de pup vanaf het podium en markeer deze (teen clipping is een betrouwbare manier om de p identificerenups later). Zodra de pup is hersteld en is in staat om te bewegen op zijn eigen (dit gebeurt binnen enkele minuten na het verwijderen ze van het podium), zet het terug met de moeder en nest.
    Opmerking: Aangezien dit een minimaal invasieve procedure zijn er geen post-operatieve procedures zodra de pup vrij kan bewegen en opgewarmd. Toch moet pups worden gecontroleerd niet alleen na de procedure, maar ook de volgende dag te verzekeren dat ze geen tekenen van verslechterende gezondheid.
  8. Voordat u begint met de procedure op de volgende pup, spuit naar beneden het gebied met 70% ethanol tot een steriel werkgebied te handhaven. Laat de geïnjecteerde pups te ontwikkelen en vervolgens het weefsel beoordeeld op de juiste ontwikkelingsfase (s).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Aangezien MGE cellen hebben het unieke vermogen om te migreren en te integreren wanneer getransplanteerd in een gastheer neocortex 16, die een uitstekend model voor genetische manipulatie voor in vivo studies. Hierin tonen we hoe men MGE weefsel isoleren van E13.5 embryo (Figuren 1 en 2), die vervolgens worden getransduceerd met lentivirussen hetzij in vitro of in een snelle wijze voor transplantatie in vivo studies. Etikettering MGE via lentiviruses is uitgevoerd v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gebruik van GABAergische corticale interneuron voorlopers van de embryonale ganglion grootheden (GET) voor cellen gebaseerde therapieën toont belofte voor vele voorwaarden 12 -1 4. Precieze moleculaire technieken zijn nodig om bij te houden en een automatische genen van belang in specifieke interneuron subgroepen. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het labelen embryonale MGE cellen met lentivirussen vóór transplantatie en hoe deze techniek kan worden gebruikt om genen van interesse in specifiek...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies te JLRR uit: Autism Speaks, Nina Ierland, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880 en NIMH R37 MH049428. PRW werd ondersteund door een beurs van de National Science Raad van Taiwan. SFS werd ondersteund door F32 (MH103003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagentia en apparatuur voor MGE celtransplantatie
1 ml spuitREF 309602BD, Becton Dickinson and company
30 1/2 G naald305106BD, Becton Dickinson and company
Precisieboring voor het leveren van 5 µl (komt met plunjer)5-000-1005Drummond scientific company
ParafilmPM-999Polysciences, Inc.
Stereomicroscoop met boomstandaard **MZ6Leica
Digitaal stereotaxisch instrument speciaal voor muizen **51725DStoelting company
Eén-as hydraulische olie fijne micromanipulator **MO-10Narishige
Diamant gecoate roterende bevelerzelfgemaakt
Naaldpipettrekker730Kopf instruments
MineralolieElke drogisterij of apotheek
Elke pipet en tips die 1 µl volume nauwkeurig kunnen meten
** Dit zijn de specifieke modellen die we gebruiken, maar veel andere opstellingen zouden moeten werken
Optionele Reagentia (voor het maken van Lentivirussen)
25 mm, 0.45 µm filter09-719BFisher Scientific
Ultra-heldere centrifugeerbuizen (25 x 89 mm)344058Beckman Coulter®
Lipofectamine 2000 (1.5 ml grootte)11668019Invitrogen
Andere commercieel verkrijgbare benodigdheden
pMDLg/pRRE plasmide dat gag/pol codeert12251Addgene
pRSV-Rev plasmide dat Rev codeert12253Addgene
pMD2.G plasmide dat VSVG codeert12259Addgene
pAAV-Flex-GFP28304Addgene

Referenties

  1. Huang, Z. J., Di Cristo, G., Ango, F. Development of GABA innervation in the cerebral and cerebellar cortices. Nat. Rev. Neurosci. 8 (9), 673-686 (2007).
  2. Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/inhibition in key neural systems. Genes, brain, and behavior. 2 (5), 255-267 (2003).
  3. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. Interneuron migration from basal forebrain to neocortex: dependence on Dlx genes. Science. 278 (5337), 474-476 (1997).
  4. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 7 (9), 687-696 (2006).
  5. Gelman, D., et al. A Wide Diversity of Cortical GABAergic Interneurons Derives from the Embryonic Preoptic Area. J. Neurosci. 31 (46), 16570-16580 (2011).
  6. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J. Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
  7. Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr. Top. Dev. Bio. 87, 81-118 (2009).
  8. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and Temporal Bias in the Mitotic Origins of Somatostatin. and Parvalbumin-Expressing Interneuron Subgroups and the Chandelier Subtype in the Medial Ganglionic. 22 (4), 820-827 (2012).
  9. Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
  10. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  11. Hippenmeyer, S. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Bio. 3 (5), e159(2005).
  12. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622(2014).
  13. Hunt, R. F., Girskis, K. M., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. GABA progenitors grafted into the adult epileptic brain control seizures and abnormal. Nature Neuroscience. 16 (6), 692-697 (2013).
  14. Braz, J. M., et al. Forebrain GABAergic Neuron Precursors Integrate into Adult Spinal Cord and Reduce Injury-Induced Neuropathic Pain. Neuron. 74, 663-675 (2012).
  15. Vogt, D., et al. Lhx6 Directly Regulates Arx and CXCR7 to Determine Cortical Interneuron Fate and Laminar Position. Neuron. 82 (2), 350-364 (2014).
  16. Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J. Neurosci. 26 (4), 7380-7389 (2006).
  17. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135 (8), 1559-1567 (2008).
  18. Arguello, A., et al. Dapper Antagonist of Catenin-1 Cooperates with Dishevelled-1 during Postsynaptic Development in Mouse Forebrain GABAergic Interneurons. PLoS ONE. 8 (6), e67679(2013).
  19. Lee, A., et al. Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition. Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).
  20. Chen, Y. J. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PLoS ONE. 8 (5), e61956(2013).
  21. Pattabiraman, K. Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex. Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Lentivirale transductieceltransplantatieGABAerge interneuronenstereotactische injectiefluorescentiemicroscopieCre-driverlijnencelisolatievirale labeling
Viraal-gemedieerde Labeling en Transplantatie van Medial ganglion Eminence (MGE) Cellen voor
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.