Next Generation Sequencing voor de detectie van beroep Mutaties in vaste en vloeibare Tumoren

Summary

Dit manuscript beschrijft klinische protocollen voor twee next-generation sequencing panelen. Het ene paneel onderzoekt hematologische maligniteiten, terwijl het andere paneel zich richt op genen die vaak gemutaeerd zijn in solide tumoren. Moleculaire classificatie van drivermutaties in humane maligniteiten biedt waardevolle prognostische en voorspellende informatie.

Abstract

Naarmate ons begrip van de drivermutaties die nodig zijn voor het initiëren en de progressie van kanker verbetert, verkrijgen we cruciale informatie over hoe specifieke moleculaire profielen van een tumor kunnen voorspellen hoe goed ze reageren op therapeutische middelen of kennis geven over de prognose. In onze instelling werd een tumorgenotyperingsprogramma opgezet als onderdeel van de routinematige klinische zorg, waarbij zowel hematologische als solide tumoren werden gescreend op een breed spectrum van mutaties met behulp van twee next-generation sequencing (NGS) panelen: een aangepast, 33-gen hematologisch maligniteiten paneel voor gebruik met perifeer bloed en beenmerg, en een commercieel geproduceerd solide tumorpaneel voor gebruik met formaline-gefixeerd paraffine-ingebed weefsel dat 47 genen target die vaak muteren bij kanker. Onze workflow omvat een patholoog-review van de biopsie om ervoor te zorgen dat er voldoende tumor is voor de test, gevolgd door een aangepaste DNA-extractie die op het specimen wordt uitgevoerd. Kwaliteitscontrole van het specimen omvat stappen voor kwantiteit, kwaliteit en integriteit en pas nadat het geëxtraheerde DNA deze metrics heeft doorstaan, wordt er een ampliconbibliotheek gegenereerd en gesequenced. De resulterende gegevens worden geanalyseerd via een in-house bioinformaticapijplijn en de varianten worden beoordeeld en geïnterpreteerd op pathogeniteit. Hier bieden we een momentopname van het nut van elk paneel met behulp van twee klinische gevallen om inzicht te geven in hoe een goed ontworpen NGS-workflow kan bijdragen aan het optimaliseren van klinische uitkomsten.

Introduction

Next-generation sequencing (NGS) van de klinische oncologie specimens heeft op grotere schaal beschikbaar in de afgelopen jaren uitgegroeid tot de toenemende wetenschappelijke literatuur wijst op het belang van het identificeren van richtbare genetische veranderingen en predictieve / prognostische moleculaire merkers. Multi-gen panel analyses en exoom sequencing studies in zowel epitheliale ^1,2 en ³ hematologische maligniteiten hebben het concept van de tumor heterogeniteit en klonale evolutie gestold als de ziekte vordert en recidieven. Bovendien, anders dan concurrerende technologieën, zoals polymerasekettingreactie (PCR) of Sanger sequentiebepaling, kan NGS detecteren meest genomische veranderingen in alle klinisch relevante kankergenen in een enkele test ^4.

Het Center for Personalized Diagnostics in eerste instantie gelanceerd met twee klinische NGS panelen, een aangepaste Hematologisch Panel (Heem-NGS Panel) en een off-the-shelf Cancer Panel voor FFPE specimens (Solid-NGS Panel) (zie Figuur 1). Deze panelen dekken klinisch relevant of hoge rente regio's van de geselecteerde genen; niet alle genen of exons zijn volledig gedekt. Amplicons gegenereerd door probe hybridisatie gevolgd door verlenging en ligatie. De beoogde gebieden worden verder geamplificeerd met behulp van PCR met een universele dual-geïndexeerde primers, waardoor tot 96 monsters worden samengevoegd voor sequentiebepaling.

Figuur 1:. Lijst van genen Gehuld in de Panels voorbereiding Library wordt uitgevoerd met behulp van de aangepaste Hematological Panel (Heem-NGS panel) van 33 genen of de off-the-shelf Amplicon Cancer Panel (Solid-NGS) van 47 genen. Niet alle van de genen of exons zijn bedekt met volle, zoals sommige amplicons kunnen alleen betrekking hebben op bepaalde hotspots. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. </ A>

De inhoud van het heem-NGS panel is afkomstig uit verschillende bronnen, maar draait om 16 genen gemuteerd in acute myeloïde leukemie (AML) die eerder beschreven als blijk van een hoge mate van klinische bruikbaarheid ^5. De Solid-NGS paneel wordt commercieel geproduceerd met de beoogde regio gebaseerd op gezamenlijk gemuteerde genen bij kanker zoals vermeld in de catalogus van somatische mutaties in Cancer (COSMIC) gegevensbank ^6.

Een aantal belangrijke stappen te karakteriseren de algehele workflow voor klinische NGS. Nadat de arts bestelt de test, een patholoog bepaalt de toereikendheid van het specimen volgende analyse voor tumor percentage en sample volume. In onze instelling, hebben wij ten minste 10% tumor danken aan de sequencing foutenpercentage ( "ruis") van de techniek en de doelmatigheid van de gerichte benadering. Als het weefsel voldoende te testen, wordt genomisch DNA geëxtraheerd. Dit DNA wordt vervolgens onderworpen aan een combinatie kwaliteitscontrole (QC) stappen. Als het DNA geeft QC wordt een amplicon bibliotheek gegenereerd en gesequentieerd. De resulterende gegevens worden geanalyseerd door een in-house bioinformatica pijpleiding. Naar aanleiding van bioinformatica analyse worden varianten handmatig beoordeeld en geïnterpreteerd voor pathogeniciteit vóór opname in een klinisch rapport. Hieronder beschrijven we twee zaken die ging door dit strenge workflow en uiteindelijk geleid tot veranderingen in klinische behandeling.

Case 1 - Acute myeloïde leukemie

Een beenmergpunctie van patiënt A was diagnostisch voor AML, zonder rijping. Cytogenetische studies werden op het beenmerg monster en toonde een normale vrouwelijke karyotype. Er waren 95% circulerende ontploffing aanwezig, dus een perifeer bloedmonster werd gestuurd voor gepersonaliseerde diagnostische tests op het heem-NGS Panel.

Acute myeloïde leukemie (AML) is een hematologische maligniteit van de myeloïde witte bloedcellen. de detectievan genmutaties bij AML steeds belangrijk voor prognose en behandeling geworden met recidiverende genmutaties die belangrijk blijken de pathogenese en prognose ^7. Mutaties in NPM1 en CEBPA zijn geassocieerd met een gunstig prognostisch risico, terwijl interne tandem duplicatie (ITD) in FLT3 zijn geassocieerd met een minder gunstig verloop ^8. Een groeiende hoeveelheid bewijs ondersteunt een pathogene rol van deze en andere mutaties in AML ^9.

Case 2 - Lung Darmkanker

Een biopsie van een linker supraclaviculaire massa van patiënt B toonde pulmonale adenocarcinoom. Biopsiemateriaal van het formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) lymfklier massa liet genomische testen (Solid-NGS Panel) als rollen / krullen met meer dan 50% tumor te bepalen of een mutatie aanwezig voor gerichte therapeutische interventie.

Lung Cancer is de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte in de Verenigde Staten en is verdeeld in twee hoofdtypen, niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) en kleincellige longkanker (SCLC). NSCLC kan verder worden gedefinieerd als adenocarcinoom of plaveiselcelcarcinoom, gebaseerd op de histologie van de laesie. Longadenocarcinoom is het meest voorkomende subtype van longkanker, gezien in zowel rokers en niet-rokers, en is de meest voorkomende vorm van longkanker voor niet-rokers ^10. Moleculaire studies van longadenocarcinomen geïdentificeerde mutatie in meerdere oncogenen ^11. De meest voorkomende bestuurder mutaties geïdentificeerd in rokers zijn mutaties in KRAS en BRAF. De meest voorkomende mutaties in niet-rokers zijn mutaties in EGFR en herschikkingen waarbij de genen ALK, RET en ROS1. Longtumoren zijn beschreven met een in-raam insertie in exon 20 van het gen ERBB2 (HER2 / neu). De meest voorkomende abnormaliteit in HER2 / neu is een amplificatie van deze locus in borstkanker waarvoor gerichte therapie beschikbaar (trastuzumab: een gehumaniseerd monoklonaal antilichaam tegen HER2 / neu). Het HER2 / neu exon 20 insertie die wordt waargenomen bij 2-4% van long adenocarcimomas ¹² is gedeeltelijk antwoord op combinatietherapie met HER2 / neu en mTOR remmers getoond (neratinib en temsirolimus respectievelijk) ^13.

Protocol

Dit protocol omvat de voornaamste stappen van twee gevalideerde laboratorium ontwikkelde tests voor de genomische profilering van vaste en vloeibare tumoren, respectievelijk. Het testen uitgevoerd in het laboratorium wordt gedaan in overeenstemming met de eisen van de Clinical Laboratory Improvement amendementen (CLIA) van 1988.

1. DNA-extractie van perifeer bloed of beenmerg

1. Bepalen hoeveel bloed of beenmerg te nemen op basis van Tabel 1.

Monster / WBC	Bedrag dat moet worden behandeld als 1 ml bloed
Beenmerg	250 gl
Blood WBC 12.000 - 50.000	1 ml
Blood WBC 50.000 - 100.000	500 gl
Blood WBC 100.000 - 200.000	200 gl
Blood WBC> 200.000	100 gl
* For Blood WBC <12.000, neem 2 ml bloed

Tabel 1:. Bloed / Bone Marrow Volume naar schema gebruiken omdat de witte bloedcellen zal variëren van monster tot monster, is het moeilijk om een bepaald volume bloed gebruikt moet worden. Daarom moet de hoeveelheid bloed te gebruiken voor de assay worden bepaald door te kijken naar de witte bloedcellen (WBC) voor het starten van de test. Hoewel minder bloed wordt gebruikt, moet nog worden behandeld als een 1 ml aangezien de hoeveelheid bloed die wordt verminderd door het aantal aanwezige cellen groter dan normaal.

2. Volg protocol de handel verkrijgbare kit voor het isoleren van genomisch DNA.

2. DNA-extractie van formaline gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) Tissue

1. Gebaseerd opde tumor regio de patholoog omcirkeld op de H & E glijbaan, line-up van de ongekleurde dia's met de gids H & E glijbaan en schetsen een vergelijkbaar gebied voor de extractie. Voor macro-dissectie, proces slechts één exemplaar / set slides patiënt op een moment.
2. Verhit de dia's op een 45 ° C verwarmen blok enigszins smelt de paraffine. Voorzichtig schrapen het weefsel binnen de lijnen die zijn aangegeven op de glijbaan, met behulp van een nieuw scalpel voor elk monster te extraheren. Plaats de wax geschraapt in de juiste label 1,5 ml buis. Wees voorzichtig, want de geschraapt wax is zeer elektrostatische en kunnen uit de buis te springen.
3. Voeg 320 ul van deparaffinisatie oplossing voor elke 5:55 5 urn secties (25 - 30 urn totaal). Als bijvoorbeeld een buis met 3 delen van een 10 um rol / curl zal worden verwerkt, vervolgens 320 pl, maar als 5 secties dezelfde dikte verkregen vervolgens 640 pl.
4. Vortex krachtig gedurende ten minste 10 seconden en uitvoeren aquick draaien in een microcentrifuge om het weefsel / was vanaf de zijkanten en de kap en in de oplossing te verwijderen. Incubeer bij 56 ° C gedurende 3 min, en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 5 -. 10 min.
5. Na de incubatie RT, voeg 180 pl ATL buffer voor elke 320 gl deparaffinisatie oplossing toegevoegd. Gehakt het weefsel tienmaal met een steriele mini-stamper met een nieuwe stamper voor elk specimen. Zorg dat er geen weefsel vast aan de stamper, aangezien het zeer kleverig zijn. Vortex de suspensie krachtig gedurende 3 sec, centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 1 minuut.
6. Voeg 10 ul van proteïnase K aan de onderste heldere fase. Meng voorzichtig door pipetteren en uitschakelt, zodat het weefsel wordt opnieuw gesuspendeerd. Doe NIET vortex. Incubeer bij 56 ° C geïncubeerd onder schudden bij 400-500 rpm.
7. De volgende ochtend, controleer dan of het weefsel volledig is opgelost (dit is gebeurd als de onderste oplossing helder). Waarbij het onderste oplossing niet helder, dan vortex krachtig gedurende 3 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid for 1 min. Voeg een extra 5-10 pl Proteinase K en incuberen bij 56 ° C gedurende nog eens 30-60 min.
8. Incubeer bij 90 ° C gedurende 1 uur om te keren de formaldehyde verknoping. Sta monsters afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten en vervolgens kort centrifugeer elke buis om de vloeistof te consolideren.
9. Breng de onderste duidelijke fase in een gemerkte 1,5 ml buis. Als er meerdere buizen van dezelfde patiënt monster (zoals het geval is wanneer meerdere rollen worden gebruikt), recombineren de onderste fase in een buis op dit punt. Opmerking: kleine hoeveelheden van de deparaffinisatie Solution niet interfereren met de zuiveringsprocedure overdragen, maar er is een risico als een grote hoeveelheid wordt overgedragen.
10. Voeg 2 pl RNase A oplossing. Vortex zachtjes of omkeren 25 keer en snelle draai in een microcentrifuge. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
11. Voeg 200 ul Protein Precipitation Solution. Als doet een of twee rollen, gebruikt 200 ul. Als het doen van drie rolls in een keer, gebruik dan 400 ul. Vortex krachtig bij hoge snelheid gedurende 30 seconden gelijkmatig mengen de lysis buffers. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten en de monsters kunnen blijven op ijs gedurende maximaal een uur.
12. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 5 minuten. Het neergeslagen eiwit zou een strakke, witte pellet te vormen. Giet het supernatant in een gelabelde 1,5 ml buis en incubeer de monsters op ijs gedurende ten minste 3 min. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 3 min.
13. Voeg 200 pl 2-propanol (isopropanol) per 180 gl buffer ATL eerder tot een gemerkte 1,5 ml buizen toegevoegd (het kan nodig zijn een 2 ml tube). Als bijvoorbeeld doen drie rollen voeg 600 pl isopropanol. Voeg 1 ul van glycogeen voor elke 180 ul Buffer ATL eerder tot de isopropanol toegevoegd en draai de buis een paar keer om te mengen.
14. Voeg voorzichtig de bovenstaande vloeistof uit de Protein Neerslag stap naar de Isopropanol mengsel. Meng de buis door het omkeren voorzichtig minstens 50 keer.
15. Centrifugeer bij maximale speed voor 3 min. Het DNA wordt zichtbaar als kleine witte pellet op de bodem van de buis.
16. Gieten of te zuigen uit de bovenstaande in het juiste afval buis. Houd een aparte 1,5 ml afval buis voor elk model in het geval dat de pellet komt verdreven dus het zal niet verloren gaan of gemengd met het afval van andere exemplaren. Giet de buis op een papieren handdoek en zorgen voor de meerderheid van de isopropanol verwijderd.
17. Voeg 300 ul vers bereide 70% ethanol. Keren de buis voorzichtig een paar keer om de pellet te wassen. Probeer de pellet te garanderen komt losgeraakte om een ​​meer grondige reiniging te verzekeren.
18. Centrifuge bij maximale snelheid gedurende 5 minuten. en dan verwijder voorzichtig de ethanol. De pellet kan los zijn, dus gieten of aspireren langzaam en kijk naar de pellet. Het overtollige ethanol uit de binnenzijde van de buis, zonder het pellet. Laat de monsters aan de lucht drogen voor 5-15 min, voorzichtig om niet te droog het monster.
19. Voeg tussen 25 - 100 pl DNA Hydration Solution each monster op basis van de grootte van de DNA pellet en de starttijd hoeveelheid weefsel. Vortex de buizen krachtig en kort draaien in een microcentrifuge. Incubeer gedurende 1 uur bij 65 ° C om het DNA volledig te hydrateren.

3. Genomic DNA Quality Control

Opmerking: Er zijn drie onafhankelijke stappen DNA kwaliteitscontrole (QC). Zie tabel 2 voor nadere toelichting op de reden waarom elke QC wordt uitgevoerd.

Instrument	Resultaat	aanwijzing	Ideaal Range
DropSense96	A260 / A230	Identificatie van chemische verontreinigingen (bijvoorbeeld ethanol)	1,50-2,2
DropSense96	A260 / A280	Identificatie van eiwitverontreinigingen	1,60-2,2
DropSense96	Concentratie	DNA kwantificering	> 1 ng / gl
tapestation	DNA Smear	Bepaling van de DNA-integriteit (bijvoorbeeld afbraak / fragmentatie van geëxtraheerde DNA)	50%> 1000 bp
qubit 2.0	Concentratie	Nauwkeuriger DNA kwantificering	> 1 ng / gl

Tabel 2:. DNA QC Verwachte resultaten Al deze waarden in aanmerking worden genomen voordat u waardoor een monster om naar de bibliotheek voorbereidingsfase.

1. Volgende protocol van de fabrikant, run 2 pi van het geëxtraheerde DNA op een fluorometer om de werking concentratie (ng / pl) van het monster te verkrijgen.
2. Run 1-2 pi van elk monster op een UV / VIS spectrofotometer om de kwaliteit van het monster (A260 / A230 en A260 / A280 rat checkios) volgens de instructies van de fabrikant.
3. Voor FFPE monsters: de instructies van de fabrikant, run 1 pi van elk monster op een microfluïde gelelektroforese systeem voor afbraak / fragmentatie van het DNA te bepalen. Zie figuur 2 voor voorbeelden.

Figuur 2:. Genomic DNA QC Gel Voorbeeld De groene lijn over het onderste bands is om de onderste markering aan te geven. De toegevoegde in de rode lijn is met ongeveer 1000 bp te geven. Lane A2 vertegenwoordigt volledig intact DNA, zoals men zou verwachten van verse tis sue (bijvoorbeeld perifeer bloed of beenmerg). Lanes B1, C1, D1, B2, C2, E2 zijn voorbeelden van goed intact FFPE DNA. Het DNA in laan F2 weergegeven intact, maar bij een te lage concentratie zijn. Het DNA in laan G2 is aangetast of gefragmenteerd en zal niet werken in de test. Lanes E1, F1, G1, H1, D2,H2 vertegenwoordigen DNA dat in de 'grijze zone', wat betekent dat de test goed zou kunnen werken valt, maar sommige van de DNA kan ook worden beschadigd of verknoopt en dus zal het niet goed presteren in de test. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.

4. Amplicon Bibliotheek Voorbereiding

1. Hybridisatie van Oligo Pool en Extension-Ligatie van Bound Oligo
   1. In de pre-PCR kamer, voeg het nodige volume Low EDTA TE, 5 ui van het panel Oligo Tube (bv Solid-NGS Panel of Heme-NGS Panel) en 100-250 ng genomisch DNA aan elke overeenkomstige putje in een semi-skirted 96 goed plaat bestempeld als de hybridisatie (HYB) plaat.
   2. Voeg 40 ul van Oligo hybridisatie voor Sequencing Reagent 1 (OHS1) aan elk monster in de HYB plaat. Voorzichtig pipet op en neer ten minste 5-6 keer te mengen. tips verandering na elke kolom te vermijdenkruisbesmetting.
   3. Sluit de HYB plaat met zelfklevende aluminiumfolie en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 30 sec.
   4. Incubeer de HYB plaat in de voorverwarmde hybridisatie incubator bij 95 ° C gedurende 1 min. Stel de temperatuur van de hybridisatie-incubator tot 40 ° C. Verder incuberen zolang duurt de incubator afnemen van 95 ° C tot 40 ° C (~ 90 min). Opmerking: Deze geleidelijke koeling is belangrijk voor juiste hybridisatie.
   5. Tijdens de laatste 15 - 20 min van de hybridisatie incubatie, pre-wassen de Filter Plate Unit (FPU). Bereid alleen de putjes te worden gebruikt in de huidige assay, dat wil zeggen, alleen vers / ongebruikt putjes van een eerder geopende filterplaat, maar nooit hergebruik bronnen die zijn gebruikt. Opmerking: Dit moet duidelijk zijn op basis van de Kit nummer op het filter plaat, de markeringen op het filter plaat, en de kit gebruikt in de plaat.
      1. Een multi-kanaal pipet wordt 45 pl Stringency 1 (SW1) aan elk putje.
         LET OP: Bevat formamide. Behandel en gecentrifugeerd FPU bij 2250 g gedurende 3 min bij 20 ° C. Controleer elke goed voor de resterende vloeistof (> 15 ul / putje).
      2. Als restvloeistof aanwezig, draait de FPU 180 ° en herhaal de centrifugetrap opnieuw gedurende nog 3 minuten. Als de restvloeistof draait met de tweede, ga dan naar de volgende stap, zo niet dan kan er een defect in de filterplaat en het stroomplaatonderdeel zal moeten worden vervangen.
   6. Zodra de hybridisatie-incubator is afgekoeld tot 40 ° C, gecentrifugeerd plaat bij 1000 g gedurende tenminste 30 sec bij 20 ° C om condensatie te verzamelen. Breng de gehele volume van elk monster tegen HYB plaat op het midden van de overeenkomstige voorgewassen putjes van de FPU. Wijzig tips na elke kolom om kruisbesmetting te voorkomen. Bedek de FPU en centrifugeer bij 2250 xg gedurende 3 min bij 20 ° C.
   7. Voeg 45 ul van SW1 en centrifugeer bij 2250 xg gedurende 3 min bij 20 ° C. Herhalen voor een totaal van twee wassen. Draai de FPU 180 ° en centrifugeer opnieuw bij 2250 xg gedurende 3 minuten om alle SW1 te verwijderen.
   8. Huichelen de FPU. Gooi de doorstroom (met formamide) in de juiste afvalbak. Monteer de FPU met een ander MIDI-Waste Collection Plate. Voeg 45 ul van Universal Buffer 1 (UB1) aan elke monsterholte en centrifugeer bij 2250 xg gedurende 3 min bij 20 ° C. LET OP: Bevat formamide.
   9. Voeg 45 ul van Extension ligatiemengsel 3 (ELM3) aan elk monster goed op de FPU plaat en pipet op en neer 3 keer om te mengen. Opmerking: Extension-ligatiereactie gebeurt op filterplaat membraan.
   10. Sluit de FPU plaat met zelfklevende aluminiumfolie en incubeer de volledige FPU montage in een voorverwarmde 37 ° C incubator gedurende 45 min.
2. Indexeren en PCR-amplificatie
   1. Aliquot de indexen gebruikt om de corresponderende putjes in de geïndexeerde Amplification Platen (IAP) door het organiseren van de primers in de Index Plate Fixture, gerangschikt op de volgende wijze: i5 primer buizen (witte caps, heldere oplossing) verticaal, in lijn met rijen A tot en met H, i7 primer buizen (oranje caps, gele oplossing) horizontaal , uitgelijnd met kolommen 1 tot 12. met behulp van een p10 multichannel pipet wordt 4 pl i7 primers (gele oplossing) aan elke rij van de IAP en voeg 4 pi i5 primers (heldere oplossing) voor elke kolom van het IAP.
   2. Op ijs of een koelblok, de voorbereiding van de PCR Master Mix door het toevoegen van 0,5 ul van DNA-polymerase 1 (TDP1) tot 25 pi PCR Master Mix 2 (PMM2) per monster. Omkeren snel vortex, en in het kort centrifuge de PCR Master Mix te mengen.
   3. Voeg 22 ul van de PCR Master Mix aan elk putje van de IAP en pipet op en neer 3 keer te mengen. Verander tips tussen de putten. Houd de IAP bij 4 ° C.
   4. Na de 45 min Extension-ligatiereactie (stap 4.1.10), verwijder de FPU uit de incubator en verwijder voorzichtig de aluminum folie afdichting. Bedek met het deksel en centrifugeer bij 2250 xg gedurende 3 min bij 20 ° C.
   5. Voeg 25 ul van 50 mM NaOH aan elk monster goed op FPU. Pipet op en neer minstens 6 keer; zorgen de pipetpunten in contact met het membraan. tips verandering na elke kolom. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
   6. Doorvoermonsters geëlueerd uit de FPU de IAP als volgt:
      1. Met een p100 meerkanaals pipet ingesteld op 20 ui, pipet NaOH op FPU plaat op en neer ten minste 6 maal. Kantel de FPU plaat om volledige aspiratie van de plaat te garanderen.
      2. Breng 20 pl van de FPU de overeenkomstige kolom van de IAP. Voorzichtig pipet op en neer ten minste 6 keer grondig combineren het DNA met de PCR Master Mix. Verzegel de IAP met kleeffolie en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 min bij 20 ° C.
   7. Breng de PCR-plaat in de Post-PCR Kamer en laadt de plaat op een thermocycler. Voer de PCR program bestaande uit een warmte denatureren bij 95 ° C gedurende 3 min; gevolgd door 25 cycli van 95 ° C gedurende 30 sec, 62 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 60 seconden; gevolgd door een laatste verlenging van 72 ° C gedurende 5 minuten; eindigend met een greep bij 10 ° C. Zo niet doorgaan naar de volgende stap na voltooiing van PCR, kan de plaat op de thermische cycler nacht blijven, of het kan worden bewaard bij 2-8 ° C tot twee dagen.
3. PCR Purification en Bead-Based Normalisatie
   1. Verwijder de zuivering magnetische korrels, Elution Buffer (EBT), gel-elektroforese reagentia van 4 ° C koelkast en plaats bij kamertemperatuur ten minste 20 minuten voor de volgende fase.
   2. Zodra de PCR is voltooid, centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 min bij 20 ° C om condensatie te verzamelen. Overdracht 1 pi van elke PCR reactie te strippen buizen / putjes bevattende 4 pi water om de monsters te verdunnen 1/5. Pipet op en neer om te mengen.
   3. Voeg 2 ul van dePCRed verdunde monsters 2 pl microfluïde-gelbuffer. Sluit de strips / plaat. Schudden bij 1800 rpm gedurende ten minste 30 seconden en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 30 sec. Na protocol van de fabrikant, voert het mengsel op een microfluïde gel te beoordelen of de bibliotheek bereiding leverde een aanvaardbare bibliotheek (zie figuur 3).
   4. Vortex de magnetische zuivering kralen tot ze goed opgehangen en de kleur verschijnt homogeen. Voeg 45 ul van de korrels aan elk monster.
   5. Seal de plaat met doorzichtige tape film en schud de plaat bij 1800 rpm gedurende 2 minuten. Incubeer bij kamertemperatuur zonder schudden gedurende 10 min.
   6. Plaats de plaat op een magnetische standaard. Zodra de bovenstaande heeft ontruimd, verwijder voorzichtig en gooi de supernatant. Als er kralen onbedoeld worden opgezogen in de tips, afzien van de kralen terug naar het bord en laat de plaat rusten op de magneet voor 2 min en te bevestigen dat het bovenstaande is verdwenen.
   7. Met de plaat op tHij magnetische stand, 200 ul van vers bereide 80% ethanol toe te voegen aan elk monster ook. Beweeg de plaat heen en weer een paar keer. Incubeer de plaat op de magnetische standaard voor 30 sec. Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig. Herhalen voor een totaal van twee wassen.
   8. Verwijder de overtollige ethanol door kort centrifugeren van de plaat bij 1000 xg om te rijden elke ethanol op de buis zijkanten, het plaatsen van de plaat terug op de magnetische stand, en met behulp van een p10 multi-channel pipet ingesteld op 10 ui aan de ethanol te verwijderen. Laat de parels aan de lucht drogen gedurende 5-8 min.
   9. Met een p100 meerkanaals pipet wordt 30 ul van EBT aan elk putje. Pipet op en neer een paar keer om ervoor te zorgen de kralen komen van de kant van de buis. Seal de plaat met doorzichtige tape film en schud de plaat bij 1800 rpm gedurende 2 minuten.
   10. Incubeer bij kamertemperatuur zonder schudden gedurende 3 min. Als er monsters waarbij de korrels niet volledig geresuspendeerd, voorzichtig pipet op en neer om de kralen resuspenderen.
   11. Plaats de plaat op een magnetische standaard. Met behulp van een p100 multi-channel pipet 20 ul van de bovenstaande vloeistof om een ​​geheel nieuwe plaat genaamd de Bibliotheek Normalisatie Plate (LNP). Breng de resterende ~ 10 ul van de individuele sequencing bibliotheken om een ​​aparte plaat genaamd de resterende opgeruimde Library Plate (RCLP). Berg de plaat samen met de uiteindelijke bibliotheek prep, omdat het als een reserve kan worden gebruikt voor een tweede sequentie run, indien nodig. Als dit niet over te gaan tot de volgende fase, kan de LNP en RCLP worden bewaard bij -15 tot -25 ° C.
   12. Krachtig Vortex en resuspendeer de Bibliotheek Normalisatie Beads 1 (LNB1). Het is cruciaal om volledig resuspendeer de pellet LNB1 kraal aan de bodem van de buis. Bereid de Normalisatie Mix, door het mengen van 8 pi LNB1 met 44 ul van Bibliotheek Normalisatie Additives 1 (LNA1) per monster. Krachtig vortex de Normalisering Mix voor 10 - 20 sec.
       LET OP: LNA1 bevat formamide.
   13. Met tussenpozen een inversiend vortexen van de Normalisatie Mix, voeg 45 ul aan elk monster van de LNP. Seal de plaat met doorzichtige tape film en schud de plaat bij 1800 rpm gedurende 30 min. Deze 30 min incubatie is belangrijk voor juiste bibliotheek normalisering als incubaties van meer of minder dan 30 minuten kan bibliotheek representatie en cluster dichtheid beïnvloeden.
   14. Tijdens de 30 minuten incubatie, de voorbereiding van de reagentia voor sequencing door het ontdooien van het reagens cartridge en Hyb Buffer (HT1) [LET OP: Beide bevatten formamide]. Bovendien krijgen ijs een latere stap en voor een verwarmingsblok geschikt om 1,5 ml centrifugebuizen wordt ingesteld op 96 ° C.
   15. Wanneer de 30 min mengstap voltooid is, plaatst de LNP op een magnetische standaard. Zodra de bovenstaande vloeistof is verdwenen, gebruik maken van een multi-channel pipet om voorzichtig te verwijderen en gooi de supernatant in de juiste afvalbak.
   16. Verwijder de LNP uit de magnetische standaard en was de kralen met Bibliotheek Normalisatie Wash 1 (LNW1) als volgt:
       1. Voeg 45ul van LNW1 aan elk monster ook.
          LET OP: Bevat formamide. Seal de plaat met doorzichtige tape film en schud de plaat bij 1800 rpm gedurende 5 minuten. Herhalen voor een totaal van twee wassen. Zorg ervoor dat alle LNW1 na de tweede wasbeurt te verwijderen.
   17. Verwijder de LNP uit de magnetische standaard en een multi-kanaal pipet wordt 30 pl 0,1 N NaOH (minder dan een week oud) aan elk putje om het monster te elueren. Seal de plaat met doorzichtige tape film en schud de plaat bij 1800 rpm gedurende 5 minuten.
   18. Gedurende de 5 min elueren, voeg 30 gl Library Normalisatie opslagbuffer 1 (LNS1) aan elk putje voor gebruik in een nieuwe plaat genaamd de opslag Plate (SGP).
   19. Plaats de LNP op de magnetische standaard. Zodra de bovenstaande heeft ontruimd, de overdracht van de 30 pi elutie de LNS1 in het SGP. Verander tips tussen de monsters om kruisbesmetting te voorkomen.
   20. Verzegel de plaat met kleeffolie en centrifugeer bij 1000 xg gedurende tenminste 30 sec.
   21. Voeg 51, l van elk monster waarvan de sequentie een label Samengevoegde Amplicon Library (PAL) 1,5 ml buis. Vortex de PAL te mengen en kort spin down in een microcentrifuge.
   22. Afhankelijk van sequencing chemie wordt gebruikt (V2 of V3) toevoegen 4-10 ul van het PAL 590-596 pl HT1. In het algemeen, voeg 5,8 pl PAL 595 gl HT1 V2 chemie en 8,5 pl PAL 592 gl HT1 voor V3 chemie. Label deze buis als de verdunde Amplicon Library (DAL) buis.
   23. Vortex de DAL en kort spin down in een microcentrifuge. Incubeer de DAL bij 96 ° C gedurende 2 minuten. Inverteer de DAL buis 3 maal en zet de DAL op ijs gedurende ten minste 5 minuten, wanneer het de sequencer voor sequentiebepaling. Na 5 min wordt het DAL gereed om te worden geladen.
   24. Als afgewerkt met de SGP, sluit de plaat met zelfklevende aluminiumfolie film en labelen met de datum en plaat ID. Bewaar de afgedichte SGP en PAL bij -15 tot -25 ° C.

Figuur 3:. Library Prep QC Gel Voorbeeld De groene lijn over het onderste bands is om de onderste markering en de paarse lijn over de bovenste banden aan te geven is om de hogere markering aan te geven. Alles werkte goed voor rijstroken H1, A2, B2, C2, E2, en G2. De bibliotheek prep niet optimaal te werken, voor rijstroken D2, F2 en H2, maar de resultaten zullen nog worden verkregen ze misschien gewoon niet voldoende dekking hebben. Voor A3, de bibliotheek prep werkte nauwelijks en het meest waarschijnlijk deze DNA-monster was niet voldoende voor de test. De lagere banden boven de onderste markering zijn de niet-gebruikte primers, omdat de hoeveelheid rechtstreeks uit de PCRed goed wordt genomen. De NTC monster moet alleen de ongebruikte primer band, en niets anders. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Sequencing

1. Zorg voor een correcte SampleSheet.csv is gemaakt voor de run. Zie Aanvullende Figuur 1 voor een voorbeeld.
2. Spoel en droog de stroom cel en voeg 600 ul van de DAL aan de ontdooide reagens cartridge.
3. Bereid de sequencer voor sequencing door het volgen van de aanwijzingen op het scherm.

6. Data Analysis

1. Voer de bioinformatica pijplijn. Gebruik maken van de in-house, speciaal ontworpen bioinformatic pijpleiding naar mutaties, inserties, deleties en amplificaties ¹⁸ identificeren.
2. Nadat de pijpleiding is voltooid, controleert u de logbestanden voor fouten / waarschuwing, eventuele significante fouten / waarschuwingen steun in de QC van de pijpleiding verwerking.
3. Analyseer de run statistieken (tabel 3) om het gesequenced bibliotheek te waarborgen is geslaagd voor de lab vastgesteld QC metrics (figuur 4). Handmatig controleren elke variant door het bekijken van de .bam bestanden in een genomische data viewer (bijvoorbeeld de Integrative Genomics Viewer ¹⁶ (IGV)).
   OPMERKING: Alleen de varianten binnen de gevalideerde allel-frequentiebereik en boven de minimale diepte van de dekking na de kwaliteit filtering worden gerapporteerd (met behulp van Human Genome Variation Society (vrachtwagens) nomenclatuur). Voor de definitieve rapportage, werd elke exon variant onderverdeeld in: pathogene, waarschijnlijk ziekte geassocieerd, variant van onbekende betekenis (VUS), waarschijnlijk goedaardig, en goedaardige. Alle varianten boven de rapportage criteria van 5% allel frequentie, met uitzondering van die geacht goedaardige varianten en synoniem voor veranderingen, werden gemeld.

Figuur 4. Overzicht van kwaliteitscontrole stappen voor NGS. Kwaliteitscontrole van iedere stap in het proces is noodzakelijk om de sequencing resultaten zullen zodanig dat voor en na sequencing metrieken als opbrengst te garanderen. Passende specimen behandeling essentieel voor hoogwaardige DNA. Bloed- enbeenmerg in ongepast fixatieven kunnen lage kwaliteit DNA opleveren. Ongepaste fixatie van vaste tumor specimens kunnen afbreken DNA (bijvoorbeeld fixatie B5). DNA kwaliteit moet worden beoordeeld op eiwitten en RNA besmetting door spectrofotometrische middelen, en nauwkeurig beoordeeld op de hoeveelheid en de integriteit van DNA. De sequentiebepaling metrics moet empirisch worden bepaald in de volgorde laboratorium en gevolgd voor elke sequencing reactie en elk monster. Voorafgaand aan de rapportage van de sequencing resultaten voor elk monster moet worden beoordeeld voor de dekking, diepte en adequate uitvoering van positieve en negatieve controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Case 1 - Heem-NGS Panel

De DNA geëxtraheerd uit leukemische perifere bloed was van voldoende kwaliteit en kwantiteit (176 ng / ul) voor het heem-NGS Panel. De totale gemiddelde diepte van de dekking was 4,933x (boven de minimale gemiddelde diepte van de dekking van de 1000x). Extra run statistieken in tabel 3. Van de 8 regio's hieronder 250x dekking, 3 waren als gevolg van verkeerde trimmen van de primers (dat wil zeggen, werd de primersequentie niet goed verwijderd vanwege sequencing fouten), 1 was een bekende artefact van de test, en de andere 4 waren deelgebieden van exons van verschillende genen zonder rapporteerbare varianten. Hoewel onze klinische protocol alleen omvat rapportage varianten onder ten minste 250 leest, leest alle data met ten minste 100 worden ingevoerd in de databank voor herziening.

Dataverwerking from de bioinformatica pijplijn ontdekt drie te rapporteren, ziekte-geassocieerde mutaties; een missense mutatie in FLT3, een missense mutatie in IDH2 en een leesraamverschuiving in NPM1. De exon-varianten met hun allel frequenties worden in tabel 4. Een gemeenschappelijke mutatie in FLT3 is de FLT3 -interne tandem duplicatie (ITD) die niet automatisch wordt opgeroepen door onze pipeline en vereist een visuele inspectie van exon 14. Visuele inspectie van exon 14 van FLT3 toonde geen insertie of duplicatie in de ingediende monster. De FLT3 I836del was op 1% allel frequentie en is niet opgenomen in het definitieve verslag, omdat het gedaald tot onder de gevalideerde minimum allel frequentie van 5%. Deze mutatie is niet op hetzelfde DNA-molecuul als de FLT3 D835Y verandering (dat wil zeggen die in dezelfde amplicon gebied, maar niet in "cis" één van sequentiebepaling leest) en werd alleen waargenomen door handmatige controle van de .bam files bij de controle van de p.D835Y verandering. De lagere allel frequenties van de twee FLT3 mutaties suggereert deze mutaties kunnen heterogeniteit en / of klonale evolutie vertegenwoordigt; echter kan het verschil te wijten aan assayprestaties daarvoor amplicon of een enkele nucleotide polymorfisme (SNP) bij of overlapt primersequentie die de amplificatie van dit allel beïnvloed.

Het heem-NGS Panel resultaten voor Case 1 met AML geïdentificeerde mutaties in FLT3, IDH2 en NPM1, drie veel gemuteerde genen in AML. Mutaties in FLT3 worden waargenomen in ~ 25% van de volwassen patiënten met AML (COSMIC ^database-17) en zijn ofwel interne tandem duplicaties (ITD) of missense mutaties in de tyrosine kinase domein. De FLT3-ITD zijn de meest voorkomende mutatie en zijn geassocieerd met een slechte respons op standaard chemotherapie, terwijl de prognostische betekenis van FLT3 kinase domain puntmutaties, zoals in deze AML patiënt heeft een duidelijk effect op de prognose ^14. Isocitraatdehydrogenase 2 (NADP +), mitochondriale (IDH2) is een gen dat een epigenetisch modifier die vaak wordt gemuteerd in AML codeert. Mutaties in epigenetische modifiers zijn relatief vaak voor bij AML, met mutaties in IDH1 en DNMT3A van andere mutaties in deze klasse van genen die leiden tot gen ontregeling. Mutaties in het gen voor nucleofosmine (NPM1) zijn een van de meest voorkomende verworven mutaties in AML en wordt algemeen beschouwd als een goede prognostische factor (bij afwezigheid van een FLT3 - ITD).

Co-mutaties van NPM1 en de IDH2 zijn beschreven in de literatuur als gunstige prognostische factor ^5, met een 3-jaars overleving van 89%. Dit vertegenwoordigt een aanzienlijke overleving in vergelijking met het totale 3-jaars overleving vanwild type NPM1 en IDH2 van 31%. Bijvoorbeeld, standaard van zorg praktijk omvat mutatie-analyse voor NPM 1 en FLT3-ITD mutaties. In dit scenario zou de detectie van slechts een NPM1 mutatie niet adequaat stratify patiënt risico, zoals de secundaire mutaties gunstig kan zijn (bijvoorbeeld IDH2) of ongunstig (bijv TET2), het verminderen van het vertrouwen voor het verlichten van een beenmergtransplantatie.

Case 2 - Solid-NGS Panel

DNA geëxtraheerd uit de FFPE weefsels was van voldoende kwaliteit en hoeveelheid van de Solid-NGS paneel, met een concentratie van 252 ng / ul en slechts 4% van het DNA onder 1000 baseparen (bp). Na de data-analyse van de gemiddelde diepte van de dekking was 9167 leest (ruim boven onze minimale diepte cutoff van 1000 gelezen) zonder regio's onder 250 read diepte. Extra QC statistieken zijn shown in Tabel 3.

Gegevens verwerkt via de bioinformatica pipeline twee gedetecteerde ziekte geassocieerde mutaties: een in-frame insertie in exon 20 van ErbB2 (HER2 / neu) en een missense mutatie in TP53. Alle exon varianten met hun allele frequenties worden weergegeven in Tabel 5. De insertie in ERBB2 vertegenwoordigt eigenlijk een tandem gedupliceerde (Her2 / neu) sequentie, zoals blijkt uit de nomenclatuur. Identificatie en bevestiging van de in-frame inbrengen vereist handmatige controle van het sequencing leest door de IGV. De detectie van mutatie frequenties van meer dan 50%, zoals gezien zowel de TP53 en de Her2 / neu mutaties suggereert een verlies van heterozygositeit (LOH) gebeurtenis (zie bespreking).

De Solid-NGS Panel resultaten voor Case 2 met longadenocarcinoom gedetecteerde mutaties in ERBB2 (HER2 / neu) en TP53, twee genen niet vaak getest in het kader van de huidige standaard van zorg voor longkankerpatiënten. HER2 / neu codeert een tyrosine kinase receptor vergelijkbaar met een ander algemeen gemuteerde gen bij longkanker, EGFR . Activeren HER2 / neu exon 20 inserties waargenomen bij 2-4% van de long adenocarcinomen, verantwoordelijk voor het merendeel van de HER2 / neu mutaties waargenomen bij longkanker en worden typisch waargenomen in tumoren zonder mutaties in andere bestuurder genen zoals EGFR en ALK ¹² . Er zijn verschillende lijnen van bewijs potentieel voor diverse behandelingen voor patiënten met activerende HER2 / neu inserties, waaronder gedeeltelijke respons op de combinatietherapie met HER2 / neu en mTOR remmers ¹³ en significante ziektebestrijding met het monoklonale antilichaam Trastuzumab in combinatie met chemotherapie ^15. Het ontdekken van een TP53 verandering is niet uncoMmon bij kanker, maar op dit moment zijn er geen bruikbare therapieën.

	Zaak 1	Case 2
Totaal Starten Leest	2.215.926	2.129.110
Percentage van Reads Mapping	98,42%	98,29%
Percentage van Reads op Target	99.01%	97,29%
Percentage van Reads op Target Na Filter	97,60%	95,45%
Percentage Bruikbare Leest	94,87%	91,79%
Percentage van Bases boven 250x Coverage	98,40%	100%
Percentage van de basen Above 1000x Coverage	95.90%	99,70%
Dekking Onder 250x - Amplicon Number	8	0

Tabel 3:. Sequencing Run QC Metrics Dit is een samenvatting van de belangrijkste statistieken run, met uitzondering van de gemiddelde dekking, die gebruikt worden voor data bekijken om te bepalen of een bibliotheek prep steekproef QC is verstreken. Het hele proces is succesvol als alle percentages boven 90%, maar het is mogelijk, met overdracht van SW1 of UB1 in de FPU wasstap of primer overspraak, lagere "Procent op Target 'in het bereik van 80 - 90%. Als de "Percentage toegewezen" is te laag, zou dat een besmetting van bacteriën of andere DNA aanwijzen aangezien alle monsters moeten afstemmen tot mens. Wanneer een van deze specificaties zijn onder de 80%, wordt het monster gemarkeerd voor verder onderzoek om te bepalen hoe om te proceed en verbetering van het proces.

Tabel 4:.. Case 1 Resultaten gedetecteerd pathogene, ziekte geassocieerd, variant van onbekende betekenis (VUS), en waarschijnlijk goedaardige exon varianten boven de rapportage criteria van 5% allel frequentie worden vermeld Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5:.. Case 2 Resultaten gedetecteerd pathogene, ziekte geassocieerd, variant van onbekende betekenis (VUS), en waarschijnlijk goedaardige exon varianten boven de rapportage criteria van 5% allel frequentie worden vermeld Klik hier om deze tabel te downloaden.

Bijkomende Figuur 1: Een voorbeeld van een amplicon-gebaseerde SampleSheet.csv. Dit blad overdraagt ​​aan de sequencer wat chemie werking (in casu Amplicon), welke workflow (bijvoorbeeld GenerateFastq), welke toepassing en Assay (bijvoorbeeld FastqOnly), hoeveel basen (of gelezen) sequentie (in dit geval 186 bp x 186 bp), en tenslotte welke monsters houden bepaalde indexen (hier dubbele indexering). De onderdelen die zijn gemarkeerd in het geel kan worden aangepast aan wat de onderzoeker wil, maar in dit geval het lab gebruikt deze parameters. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Discussion

Aangezien de twee NGS proeven in dit manuscript beschreven klinisch worden aangeboden, de meest belangrijke praktische overweging is kwaliteitscontrole. In het bijzonder moet in de buurt aandacht worden besteed aan de kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerd DNA. Dit is vooral belangrijk voor FFPE monsters vaak zeer afgebroken met variabele DNA opbrengst. Isopropanol precipitatie methode werd ontwikkeld om DNA opbrengst uit FFPE monsters maximaliseren kolommen gebaseerde methoden bleken soms tot DNA afschuiving met beperkte elutievolumes. Daarom meestal wanneer een monster oplevert te lage concentratie of te afgebroken voor de test is waarschijnlijk veroorzaakt door het weefsel grootte, type of fixatie en niet het extractieproces. Voor bloed / beenmerg monsters, als er een extractie mislukking, is het meestal te wijten aan een monster dat hemodilute (dat wil zeggen, niet met voldoende aantal witte bloedcellen of tumorcellen in die draw) of chemo weggenomen.

. Nt '> Tijdens de validatie dient cutoffs voor aanvaardbaarheid van DNA kwaliteit en kwantiteit worden vastgesteld De aanbevolen ingang van 100-250 ng wordt vaak gebruikt in de test, maar als de DNA kwaliteit goed is, dan lagere input bedragen kunnen slagen. Bovendien, indien de DNA kwaliteit slecht (dat wil zeggen, de hoeveelheid amplificeerbaar DNA is dan 100-250 ng) dan hogere ingang hoeveelheden kan de kwaliteit van de sequencing resultaten te verbeteren (aangezien de hoeveelheid amplificeerbaar DNA aanbevolen ingang bereikt) . Metrics voor DNA-kwaliteit en kwantiteit in een "grijze zone" (zie figuur 2) moet worden toegepast op elk monster voor het bevorderen van het DNA in de bibliotheek voorbereiding. die monsters moet worden uitgevoerd naar het oordeel van het laboratorium directeur of. Momenteel is de beste manier om te voorspellen of het DNA zal niet goed presteren tijdens sequencing is een qPCR-gebaseerde test die het mogelijk maakt voor de kwantificering en de kwaliteitsbeoordeling van de input DNA voeren. Deze benadering richt de bioavailabiliteit van verschillende grootte fragmenten in het monster door de amplificatie van verschillende grootte fragmenten (bijvoorbeeld, 100 bp, 150 bp, 200 bp en 300 bp) en vergelijking opbrengst.

Momenteel bibliotheek bereiding omvat een groot aantal handmatige stappen waarbij een misstep op een van meerdere momenten kan de bibliotheek hetzij beginnen of van slechte kwaliteit zijn. De microfluïdische gel analyse is de enige QC stap naar een bibliotheek prep kwestie te controleren voordat sequencing. Dienovereenkomstig zijn verschillende kritische stappen waarbij extra aandacht de kans op een succesvolle reactie kan verhogen. Het is noodzakelijk om voor de juiste monster en oligonucleotide zwembad worden gebruikt voor elk monster. Zorgen en correct opnemen dat elk monster bevat één van de 96 unieke combinaties van dual-geïndexeerde PCR primerparen verkleint kans op een monster mix. Ook is het belangrijk ervoor te zorgen de filterplaat (FPU) correct afvoert; als het niet op de juiste wijze af te voeren dit de exte kan veroorzakennsion-ligatie stap van de bibliotheek voorbereiding op suboptimaal voeren en leiden tot slechte kwaliteit sequencing data. Na bibliotheek QC, is het essentieel dat de LNB1 korrels volledig geresuspendeerd en de LNB1 / LNA1 oplossing goed gemengd alvorens het aan de monsters de concentratie van dit mengsel wordt gebruikt om de molariteit van de bibliotheek te bepalen. Ten slotte, als de hiel elutiestap leidt tot een suboptimale hoeveelheid bibliotheek geëlueerd uit de korrels zal clustering dichtheid afnemen en hierdoor kan de bibliotheek adequate gemiddelde dekking verkrijgen. Omgekeerd zal een overmaat aan bibliotheek leiden tot slechtere kwaliteit leest. Daarom is het belangrijk dat ten de kraal gebaseerde normalisatiestap optimale bundeling en clustering van de bibliotheken op de sequencer verzekeren.

Naast bibliotheek preparaat, is het essentieel om een ​​bioinformatica pijpleiding die nauwkeurige mutatie oproepen van het ruwe, gedemultiplexte fastq bestanden produceren valideren. Het kiezen van eenaangepaste oplossing kan tijdrovend zijn, omdat er veel open source en in de handel verkrijgbare aligners, variant bellers en NGS software pakketten die men zou moeten ziften door. Aangepaste algoritmes zullen moeten worden ontworpen om essentiële prestaties statistieken te halen, te identificeren unieke terugkerende mutaties die meest open source tools ontging, en bepaal aantal kopieën de status van elk der loci. Tijdens de validatie van een bio pijpleiding, is het belangrijk om de rapporteerbare cutoffs voor varianten die goede prestaties zowel een minimale diepte van de dekking na kwaliteit filtering (bijvoorbeeld ten minste 250 gelezen) en een minimale allelfrequentie bepalen (bijvoorbeeld 4 %). Aangezien dit een gemultiplexte-amplicon gebaseerde test, is het belangrijk te bepalen minimale gemiddelde diepte van dekking (bijvoorbeeld 1000x) dat de bibliotheek moet bereiken kunnen de laagst presterende amplicon naar de minimale diepte van de leest. Bovendien, de gemultiplexte aard van de test wel cAGebruik off doel effecten en deze 'artifacts' zal moeten worden ontdekt en volledig doorgelicht voor de lancering. Een andere belangrijke beperking van de beschreven test is behoefte aan monsters meer dan 10% tumorcellen bevatten om de gevalideerde minimum allelfrequentie bereiken.

De detectie van lage frequentie, 1%, FLT3 inserties aanwijzingen dat handmatige nog wenselijk deze werkwijze. Zelfs met een allel frequentie cut-off 'van 5%, een aantal belangrijke mutaties misschien gemist en dus handmatige controle zal van essentieel belang om deze varianten vast te stellen zijn. Voor FLT3-ITD, is visuele inspectie van exon 14 uitgevoerd voor alle AML-patiënten op een laag niveau of een grote inbrengen / doublures te garanderen blijft niet onopgemerkt. Bovendien HER2 exon 20 inserties die doorgaans naast de primersequentie moet handmatig ingrijpen. Ondanks het feit dat een robuuste pijplijn bioinformatica, kon wel wat varianten gaan over het hoofd gezien dat is gewoon de aard van het hebben van een harde cutoff voor de meeste van de statistieken hierboven vermeld. Beter bioinformatica nodig zou zijn om te helpen verlichten dit probleem, net als een betere bibliotheek voorbereiding en / of sequencing methodologieën, want het is het voordeliger om een ​​goede kwaliteit van de gegevens hebben op nog lagere cutoffs dat minder artefacten en valse positieven bevatten.

De detectie en interpretatie van allel frequenties problemen wegens de moeilijkheid tumor percentagewegen en amplificatie voorspanning van sommige gebieden van het genoom. Bovendien kunnen allel frequenties boven 50% worden gedetecteerd, zoals waargenomen in case 2. Dit wordt geïnterpreteerd als een verlies van heterozygositeit (LOH) gebeurtenis, hetzij als gevolg van verlies van de normale allel, waardoor de schijnbare toename van mutant leest, een versterking van het mutante allel (bijvoorbeeld 2 mutant en één normale kopie) of andere mechanismen. Deze mechanismen kunnen worden toegelicht door gebruik reeks vergelijkende genomische hybridisatie (aCGH ¹⁹⁾ en / of een SNP genotypering array. ^20.

De huidige doelstelling verrijking methodieken rekenen op full-dag procedures van een inefficiënte hybride vangen of multiplex-PCR-technieken die leiden tot de behoefte aan meer sequencing dekking van een enkel monster en meer af doelwit sequencing leest. Extra aanvragen voor NGS moleculaire oncologie naar verwachting in de nabije toekomst zal het makkelijker bibliotheek bereidingswijzen die volledig automatiseerbare kan zijn en in staat zijn om monsters te verwerken met een zeer lage hoeveelheden van de input DNA bevatten (dat wil zeggen, minder dan 1 ng) als monsters met zeer afgebroken DNA. Om deze uitdagingen aan te pakken, zullen de meeste methoden vermoedelijk PCR-gebaseerde, ofwel dat een meerdere stappen PCR aanpak of een massively-parallel singleplex PCR aanpak. Bovendien heeft moleculaire barcodes individuele amplicons aangetoond dat drastisch verminderen sequencing achtergrond ruis en controle van monsters mogelijk met lagere verhoudingen van tumorcellen lagere allel frequenties te bereiken en de richting vastleggen circulatieing tumorcellen.

Detectie van ziekte-geassocieerde mutaties in kanker specimens heeft kwaliteit van de zorg voor decennia. Historisch gezien genen werden vaak getest achtereenvolgens, één gen / exon tegelijk met de identificatie van een mutatie die leidt tot het einde van de testvolgorde. De komst van NGS is toegestaan ​​voor een neutraler benadering sequencing meerdere genen geassocieerd met vele kankers tegelijkertijd leiden tot de identificatie van verschillende mutaties die zijn geassocieerd met neoplasie. De klinische bruikbaarheid van NGS voor de detectie van somatische mutaties in kanker is steeds duidelijker. Inderdaad, NGS-gebaseerde analyse van de tumor monsters vertegenwoordigt een nieuw paradigma dat de traditionele, enkel gen testen uitdaagt, maar de klinische bruikbaarheid is heel duidelijk. Klinische laboratoria vandaag de dag hebben de opwindende kans om een ​​zorgvuldige methode validatie en test interpretatie trouwen met de toepassing van deze krachtige technologie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genomic DNA ScreenTape	Agilent Technology	5067-5365
Genomic DNA Reagents	Agilent Technology	5067-5366
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent Technology	5067-5584
High Sensitivity D1000 Reagents	Agilent Technology	5067-5585
TapeStation 2200	Agilent Technology	G2965A
TapeStation Analysis Software	Agilent Technology	A.01.04 of hoger
96-well Tube Storage Racks	Elke leverancier
15/50 ml Tube Rack	Elke leverancier
96-well Plate Rack	Elke leverancier
Pipette, single-channel, 0.5–2.5 μl	Elke leverancier
Pipette, single-channel, 1–10 μl	Elke leverancier
Pipette, single-channel, 2–20 μl	Elke leverancier
Pipette, single-channel, 10–100 μl	Elke leverancier
Pipette, single-channel, 20–200 μl	Elke leverancier
Pipette, single-channel, 100–1,000 μl	Elke leverancier
Serological Pipettor	Elke leverancier
Vortexer	Elke leverancier
IJsemmer	Elke leverancier
Microcentrifuge (voor buisjes en stripbuisjes)	Elke leverancier
Vriezer, -20 °C	Elke leverancier
4 °C Koelkast	Elke leverancier
Water- of parelbad	Elke leverancier
Incubator (37 °C)	Elke leverancier
Serologische pipetten, 1 ml	Elke leverancier
Serologische pipetten, 5 ml	Elke leverancier
Serologische pipetten, 10 ml	Elke leverancier
Serologische pipetten, 25 ml	Elke leverancier
Handschoenen	Elke leverancier
Vakmessen/schaafmesjes	Elke leverancier
KimWipes	Elke leverancier
15 ml conische buis	Elke leverancier
50 ml conische buis	Elke leverancier
Papierhanddoeken	Elke leverancier
200 proof Ethanol	Elke leverancier		Bewaar in ontvlambare kast
2-Propanol (Isopropanol)	Elke leverancier		Bewaar in ontvlambare kast
25 ml reservoirs	Elke leverancier
10 N NaOH	Elke leverancier
Pipette, 8-kanaals, 1 – 10 μl	Elke leverancier
Pipette, 8-kanaals, 10 – 100 μl	Elke leverancier
Pipette, 8-kanaals, 20 – 300 μl	Elke leverancier
IJsemmer	Elke leverancier
Waterspuitfles	Elke leverancier
Alcoholspuitfles	Elke leverancier
Lensreinigingspapier	Elke leverancier
Plates, 96-well PCR, Semi-Skirted	Elke leverancier
Tube strips, 8-well, 0.2 ml	Elke leverancier
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881
BioShake IQ of 3000-T elm	Bulldog Bio/Q.Instruments	1808-0506/ 1808-0517
DropPlate96 S - LabChipDS	Caliper	128876
DropPlate96 D - LabChipDS	Caliper	132848
DropSense96	Caliper (Trinean)
DropQuant Software	Caliper (Trinean)
Plate Sealing Film	Denville	B1212-5S
Aluminum Seal Foil	Denville	B1212-6S
Nuclease-Free, Pure Water System	EMD Millipore
5424 centrifuge	Eppendorf	22621408
5804R centrifuge	Eppendorf	22623508	Beide 15 ml buisjes en platenrotators, bij voorkeur een centrifuge die tot 2.500 x g kan gaan.
Safe-Lock Tube 1.5 ml, Natural	Eppendorf	22431021
5 ml Tube, DNA LoBind Tube	Eppendorf	30108310
5430R Centrifuge	Eppendorf	022620645	Elke platenrotator centrifuge werkt
Hybex Microsample Incubator	Fisher Scientific	1057-30-0
Hybex 0.2 ml Tube Block	Fisher Scientific	1057-31-0
TruSeq Amplicon – Cancer Panel	Illumina	FC-130-1008	96 reacties
TruSeq Custom Amplicon	Illumina	PE-940-1011	96 reacties
TruSeq Custom Amplicon Index Kit	Illumina	FC-130-1003	96 indices, 384 monsters
MiSeq Reagent Kit v3, 500 Cycles	Illumina	MS-102-3003
MiSeq Reagent Kit v2, 300 Cycles	Illumina	MS-102-2002
MiSeq Reagent Kit v2, 500 Cycles	Illumina	MS-102-2003
Experiment Manager	Illumina	1.3 of hoger
MiSeq Reporter	Illumina	2.0 of hoger
Sequencing Analysis Viewer	Illumina	1.8 of hoger
TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit	Illumina	FC-130-1