Toepassing van de DNA-Specific Stain Methyl Groen in de Fluorescent Labeling van embryo's

Samenvatting

Een methode voor fluorescente kleuring van gefixeerd biologisch materiaal met het specifieke DNA-label methylgroen wordt beschreven. Methylgroen wordt gebruikt in een verdunde waterige oplossing en is zeer resistent tegen fotobleking. De verre-rode emissie ervan maakt diepe beeldvorming van monsters mogelijk, waardoor het bijzonder geschikt is voor hele embryo's.

Samenvatting

Methylgroen is al lang bekend als een histologische kleurstof met een specifieke affiniteit voor DNA, hoewel zijn fluorescerende eigenschappen tot voor kort onontdekt zijn gebleven. In dit artikel illustreren we de methode voor het bereiden van een methylgroen waterige stockoplossing, die wanneer verdund, kan worden gebruikt als een zeer handige fluorescente nucleaire marker voor gefixeerde cellen en weefsels. Eenvoudige procedures om hele zebravis en kikembryo's te labelen worden gedetailleerd beschreven, en voorbeelden van verkregen afbeeldingen worden getoond. Methylgroen wordt maximaal geëxciteerd door rood licht, op 633 nm, en zendt uit met een relatief scherp spectrum dat piekt bij 677 nm. Het is zeer goedkoop, niet-toxisch, zeer stabiel in oplossing en zeer resistent tegen fotobleking wanneer het aan DNA is gebonden. De rode emissie ervan maakt ongewijzigde hoog resolutie scannende confocale beeldvorming van kernen in dikke specimen mogelijk. Ten slotte is dit methylgroen kleuringsprotocol compatibel met andere celkleuringsprocedures, zoals antilichaammarkering, of actinofilamen markering met fluorofoor-geconjugeerd faloidine.

Inleiding

Fluorescent kleuring van DNA wordt veel en routinematig gebruikt, zowel in biologisch onderzoek als in klinische diagnostiek, hetzij voor de gedetailleerde studie van nucleaire en chromosomaal structuur, voor het tegenstempelen van weefsels en cellen, of voor het bestuderen van celcyclusparameters¹. Hoewel er verschillende DNA-kleuringen beschikbaar zijn, zijn de meest gebruikte die opgewonden worden door UV-licht en blauw uitstralen, die passen in de gebruikelijke drie-filtersystemen die worden gebruikt in de meeste conventionele epifluorescentiemicroscopen wanneer gecombineerd met groen en oranje-rood uitstralende fluoroforen, zoals fluorescerende eiwitten of kleine moleculen die aan antilichamen zijn bevestigd. Onder deze blauw uitstralende DNA-kleuringen zijn DAPI en Hoechst minor groove-binding agents^2,3 de meest voorkomende. Desondanks heeft de integratie van een breed scala aan laser emissielijnen en spectrale detectie in laserscanmicroscopen onderzoekers de mogelijkheid gegeven om te kiezen voor het gebruik van verre-rood uitstralende nucleaire kleuringen zoals propidiumjodide (PI) of TO-PRO 3⁴. Een voordeel van deze kleuringen is dat ze het probleem van autofluorescentie overwinnen dat in veel cellen en weefsels wordt aangetroffen, met name in embryo's⁵, maar veel van hen hebben andere problemen zoals brede emissieprofielen of erg gevoelig zijn voor fotobleken⁶.

De Zwitserse onderzoeker Friedrich Miescher ontdekte DNA in 1869, waarbij hij het uit witte bloedcellen in pus extraheerde. Hij noemde het nucleine en toonde een paar jaar later aan dat het neerslagen vormde met de relatief nieuwe kleuring methylgroen. Methylgroen bestaat uit drie aniline ringen, met verschillende graden van methylering, en heeft twee positieve ladingen die het toelaten zich sterk te binden aan de grote groef van DNA^7,8. DNA kleuring door methylgroen werd al vroeg als specifiek getoond, wat leidde tot de ontwikkeling door Unna en Pappenheim van een gecombineerde kleuring met pyronine, die specifiek RNA labelt. Methylgroen-pyronine is sindsdien uitgebreid gebruikt in routinematige histologische technieken⁹.

Tot voor kort was er heel weinig bekend over de fluorescente eigenschappen van methylgroen. Ons eerder werk heeft echter enkele van de spectrale voordelen van methylgroen onthuld⁶ zoals zijn excitatie bij 633 nm, een handige Stokes-shift, zijn emissie op het nabije-infraroodgedeelte van het elektromagnetische spectrum, hogere fotostabiliteit dan commercieel verkrijgbare DNA-kleuringen met vergelijkbare spectrale eigenschappen en tegen een zeer lage prijs. Dit is de reden waarom we besloten het te testen voor gebruik als een zeer hoog affiniteit en specifiek fluorescerend label voor DNA op embryonale weefsels en in hele embryo's. Bovendien werd methylgroen nucleaire kleuring tot nu toe uitgevoerd bij lage pH, waardoor het moeilijk was te combineren met antilichaamkleuring. Het doel van de hier gedetailleerde methode is om een protocol te hebben voor fluorescente nucleaire DNA-kleuring die het bovengenoemde ongemak overwint door de kleuringsprocedure uit te voeren bij fysiologische pH, waardoor het een geschikte tegenstempel voor immunolabeling op secties en hele weefsels wordt.

Protocol

1. Zuivering van de Dye

1. Bereid een 4% oplossing van methyl green door oplossen van 0,4 g vlek poeder in 10 ml gedestilleerd water. Meng grondig tot volledig op te lossen.
2. Onder een rook-kap, meng het met minstens 2 delen van chloroform. Het is belangrijk om vooraf te controleren of de buizen chloroform resistent.
3. Meng goed en centrifugeer gedurende 1 min bij 2000 xg om fasescheiding te versnellen.
4. Na centrifugeren, een bovenste waterfase met methylgroen en een onderste organische fase met chloroform en de gebruikelijke verontreinigingen kristalviolet worden verkregen.
5. Herstellen van de bovenste fase en herhaal deze stap totdat onderste fase lijkt volledig verstoken van kristalviolet.
6. Aan het einde is de bovenste fase teruggewonnen en verdund in water tot een eindconcentratie van 2% methylgroen. Deze voorraad oplossing is op de werkbank maanden en niet behoeft te worden beschermd tegen licht.

2. Fluorescerende Nucleaire kleuring van Whole zebravis embryo's met behulp van Methyl Green

1. Bevestig de embryo overnacht in 4% formaldehyde (van paraformaldehyde) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
   Opmerking: Dit kan duren van enkele uren tot gedurende de nacht, afhankelijk van de dikte van het embryo. In het voorbeeld, we vast 48 uur na de bevruchting (HPF) zebravis embryo's 's nachts.
2. Was de embryo driemaal in PBS-T (1% Triton X-100 in PBS) gedurende 5 min. De verhoogde concentratie van wasmiddel permeabilizes de cuticula.
3. Bereid een 1: 5,000-1: 10,000 oplossing van methyl-groen (van 2% voorraad-oplossing) in PBS-T. De aanwezigheid van detergent tijdens de incubatie bruikbaar voor dikke monsters, zoals zebravis embryo's en larven.
4. Incubeer de embryo's in de oplossing gedurende tenminste 6 uur bij 4 ° C onder zachtjes wiegen. Ook de dikte van het embryo is de parameter ijken van de lengte van de incubatietijd.
5. Was de embryo's 3 times met PBS gedurende 30 min naar het detergens overmaat te verwijderen. Methyl groene fluorescentie alleen zichtbaar indien gebonden aan DNA, waardoor de achtergrond van het ongebonden moleculen verwaarloosbaar.
6. Mount op een opgegraven dia of een zelfgemaakte kamer met montage-oplossing (75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl pH 8).
   Opmerking: Als de nucleaire kleuring wordt uitgevoerd na immunokleuring kan methylgroen worden opgenomen om de bevestiging oplossing vlak werkconcentratie, zonder de noodzaak om het weg te wassen.
7. Store gekoeld of onmiddellijk beginnen beeldvorming. Voer beeldvorming met een confocale laser scanning (of andere fluorescentie) microscoop met excitatie bij 633 nm en emissie filters instellen om te registreren bij 650-750 nm rekening houdend met dat methyl groene emissie haar maximum bereikt op 677 nm.
   LET OP: Wij bieden de gemeten gegevens van de methyl groene emissie profiel, in de acquisitie software worden geladen, als aanvullend materiaal.

3. Fluorescent Nuclear Staining van Whole kippenembryo's met Methyl Green

1. Incubate bevruchte kippeneieren tot het stadium van belang. Bevestig de embryo overnacht in 4% formaldehyde (van paraformaldehyde) in PBS bij 4 ° C. Was embryo 3 maal in PBS-T gedurende 2 uur.
2. Bereid een 1: 5,000-1: 10,000 oplossing van methyl-groen (van 2% voorraad-oplossing) in PBS-T. Incubeer de embryo kleuroplossing overnacht bij 4 ° C. Was de embryo 3 maal in PBS, 1 uur elk. Mount in de kamer met 75% glycerol, 0,1 M Tris, pH 8.

4. Imaging fluorescent gelabelde kernen in Whole-gemonteerde embryo

1. Bereid een imaging kamer door steken verschillende lagen van elektrische tape over een microscoop glijbaan en voorzichtig een gat in het met een scalpel om de embryo's binnen te plaatsen. Hiermee wordt voorkomen dat embryo's uit het verpletteren tijdens de beeldvorming.
2. Breng voorzichtig de embryo's naar de beeldvorming kamer en vult de kamer naar de bovenzijde met 75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8 met eenleegte belvorming.
3. Dek af met een # 0 dekglaasje vermijden of elimineren medium overlopen. Verzegelt het met nagellak.
4. Acquire beelden van het monster op een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 633 excitatiefilter of laser lijn.
   OPMERKING: Emissie filters moet de maximale uitstoot van 677 methyl groene dekken.

Resultaten

Nucleaire kleuring van dikke monsters. De hierin beschreven protocol maakt het bereiken van homogene kleuring van dieptestructuren gehele embryo. Ontwikkeling lens kernen vorm 48 HPF zebravis embryo homogeen aangeduid (figuur 1).

Methylgroen DNA kleuring maakt onderscheid van celcyclus afhankelijke morfologische verschillen zoals de identificatie van mitotische figuren of apoptotische nuclei (figuur 2A). Subnucleaire structuren met een hoge resolutie zijn oo...

Discussie

De progressieve ontwikkeling van microscopietechnieken in de afgelopen decennia, met een bijzondere focus op variaties van fluorescente microscopie, hebben geleid tot de mogelijkheid om de dynamica en structuur van intacte weefselmonsters te onderzoeken, inclusief hele embryo's^10,11. Een grote beperking is echter geweest de beschikbaarheid van hoogwaardige fluoroforen die kunnen worden gebruikt om subcellulaire structuren direct en snel te kleuren.

De meest gebruikte fluorescente DN...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Methyl green	Dr. G. Grübler		Ook getest Sigma-Aldrich 323829, die vrij is van kristalviolet
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma-Aldrich	P1951
chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Centrifuge 5810 R	eppendorf	5811 000.010
microscope slides	Deltalab	D100004
cover slips	Esco optics	R525025