Toepassing van de DNA-Specific Stain Methyl Groen in de Fluorescent Labeling van embryo's

Samenvatting

Een methode voor fluorescente kleuring van gefixeerd biologisch materiaal met het specifieke DNA-label methylgroen wordt beschreven. Methylgroen wordt gebruikt in een verdunde waterige oplossing en is zeer resistent tegen fotobleking. De verre-rode emissie ervan maakt diepe beeldvorming van monsters mogelijk, waardoor het bijzonder geschikt is voor hele embryo's.

Samenvatting

Methylgroen is al lang bekend als een histologische kleurstof met een specifieke affiniteit voor DNA, hoewel zijn fluorescerende eigenschappen tot voor kort onontdekt zijn gebleven. In dit artikel illustreren we de methode voor het bereiden van een methylgroen waterige stockoplossing, die wanneer verdund, kan worden gebruikt als een zeer handige fluorescente nucleaire marker voor gefixeerde cellen en weefsels. Eenvoudige procedures om hele zebravis en kikembryo's te labelen worden gedetailleerd beschreven, en voorbeelden van verkregen afbeeldingen worden getoond. Methylgroen wordt maximaal geëxciteerd door rood licht, op 633 nm, en zendt uit met een relatief scherp spectrum dat piekt bij 677 nm. Het is zeer goedkoop, niet-toxisch, zeer stabiel in oplossing en zeer resistent tegen fotobleking wanneer het aan DNA is gebonden. De rode emissie ervan maakt ongewijzigde hoog resolutie scannende confocale beeldvorming van kernen in dikke specimen mogelijk. Ten slotte is dit methylgroen kleuringsprotocol compatibel met andere celkleuringsprocedures, zoals antilichaammarkering, of actinofilamen markering met fluorofoor-geconjugeerd faloidine.

Inleiding

Fluorescent kleuring van DNA wordt veel en routinematig gebruikt, zowel in biologisch onderzoek als in klinische diagnostiek, hetzij voor de gedetailleerde studie van nucleaire en chromosomaal structuur, voor het tegenstempelen van weefsels en cellen, of voor het bestuderen van celcyclusparameters¹. Hoewel er verschillende DNA-kleuringen beschikbaar zijn, zijn de meest gebruikte die opgewonden worden door UV-licht en blauw uitstralen, die passen in de gebruikelijke drie-filtersystemen die worden gebruikt in de meeste conventionele epifluorescentiemicroscopen wanneer gecombineerd met groen en oranje-rood uitstralende fluoroforen, zoals fluorescerende eiwitte....

Protocol

1. Zuivering van de Dye

1. Bereid een 4% oplossing van methyl green door oplossen van 0,4 g vlek poeder in 10 ml gedestilleerd water. Meng grondig tot volledig op te lossen.
2. Onder een rook-kap, meng het met minstens 2 delen van chloroform. Het is belangrijk om vooraf te controleren of de buizen chloroform resistent.
3. Meng goed en centrifugeer gedurende 1 min bij 2000 xg om fasescheiding te versnellen.
4. Na centrifugeren, een bovenste waterfase met methylgroen en een onderste organische fase met chloroform en de gebruikelijke verontreinigingen kristalviolet worden verkregen.
5. Herstellen van de bovenste fase en herhaal deze s....

Resultaten

Nucleaire kleuring van dikke monsters. De hierin beschreven protocol maakt het bereiken van homogene kleuring van dieptestructuren gehele embryo. Ontwikkeling lens kernen vorm 48 HPF zebravis embryo homogeen aangeduid (figuur 1).

Methylgroen DNA kleuring maakt onderscheid van celcyclus afhankelijke morfologische verschillen zoals de identificatie van mitotische figuren of apoptotische nuclei (figuur 2A). Subnucleaire structuren met een hoge resolutie zijn oo.......

Discussie

De progressieve ontwikkeling van microscopietechnieken in de afgelopen decennia, met een bijzondere focus op variaties van fluorescente microscopie, hebben geleid tot de mogelijkheid om de dynamica en structuur van intacte weefselmonsters te onderzoeken, inclusief hele embryo's^10,11. Een grote beperking is echter geweest de beschikbaarheid van hoogwaardige fluoroforen die kunnen worden gebruikt om subcellulaire structuren direct en snel te kleuren.

De meest gebruikte fluorescente DN.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Methyl green	Dr. G. Grübler		Ook getest Sigma-Aldrich 323829, die vrij is van kristalviolet
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma-Aldrich	P1951
chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Centrifuge 5810 R	eppendorf	5811 000.010
microscope slides	Deltalab	D100004
cover slips	Esco optics	R525025