Een Geoptimaliseerd Verrijking Techniek voor de isolatie van Arthrobacter Bacteriophage Soorten uit Soil Sample Isoleert

Samenvatting

We presenteren een verrijkingsprotocol voor de isolatie van bacteriofagen die bacteriën in het Arthrobacter geslacht infecteren. Dit verrijkingsprotocol produceert snelle en reproduceerbare resultaten voor de isolatie en amplificatie van Arthrobacter fagen uit bodemisolaties.

Samenvatting

De isolatie van bacteriofagen uit milieumonsters wordt al tientallen jaren uitgevoerd volgens principes die zijn vastgesteld door pioniers op het gebied van microbiologie. De isolatie van fagen die Arthrobacter-gastheercellen infecteren, is beperkt geweest, misschien vanwege de lage succesgraad van veel eerdere isolatietechnieken, wat heeft geleid tot een ondervertegenwoordigde groep van Arthrobacter-fagen die beschikbaar zijn voor onderzoek. De hier beschreven verrijkingstechniek gebruikt, in tegenstelling tot vele andere, een gefilterd extract vrij van besmettelijke bacteriën als basis voor de groei van indicatorbacteriën, specifiek Arthrobactersp. KY3901. Door eerst de bodembacteriën te verwijderen, worden de doelfaggen niet gehinderd door concurrentie met inheemse bodembacteriën die aanwezig zijn in de oorspronkelijke bodemmonsters. Deze verrijkingsmethode heeft geresulteerd in tientallen unieke fagen uit verschillende bodemtypes en heeft zelfs verschillende soorten fagen geproduceerd uit hetzelfde verrijkte bodemmonster. Het gebruik van deze procedure kan worden uitgebreid naar de meeste voedselrijke aërobe media voor de isolatie van fagen in een grote diversiteit van interessante gastheerbacteriën.

Inleiding

De alomtegenwoordigheid van Arthrobacter soorten in de bodem omgevingen en biedt een groot aantal en de diversiteit van fagen kunnen worden geïsoleerd van deze soort van gastheer bacteriën. Bacteriële leden van de familie Acintobacteriaceae zijn het meest bekend om hun katabole paden van vernederende recalcitrante verbindingen zoals atrazine en diverse andere pesticiden en herbiciden ^1,2,3. Hoewel de meeste onderzoek is gedaan met behulp van het milieu stammen van Arthrobacter, wordt klinische isolaten van deze soort gevonden in bloed, urine, ogen, en vele andere menselijke bronnen die allemaal van fylogenetische heterogeniteit ^4.

Hoewel er een vrij uitgebreid lichaam van het onderzoek op Arthrobacter bacteriën, slechts een paar studies rapporteren over de fagen kunnen infecteren leden van deze diverse geslacht. Interessant is echter, werk eerder gedaan op Arthrobacter fagen hand gelegd aan een aantal belangrijke verschillende onderwerpen, zoals de typering van de bodem Arthrobacter species ^5, industrieel gebruik met het oog op het verminderen van schadelijke schuim in actief slib zuiveringsinstallaties ^6, en werk benadrukken locatiespecifieke recombinatie en integrase genen ^7.

Verschillende verrijkingstechniek protocollen zijn gebruikt voor het genereren zuivere faag isolaten Arthrobacter species. Vroege procedures omvatten incubaties van de bodem met toegevoegde giftige stoffen zoals nicotine zouten voor een periode van meer dan één jaar ⁸ die aanleiding geven tot fagen staat alleen infecteren A. globiformis. Studies gedaan met behulp van de bodem gepercoleerd met labiele organische bleek detecteerbare fagen te produceren via plaque assay technieken, met weglating van lange incubatietijd ^8. Interessant is echter, een techniek lijkt rechtstreeks plateren werd in het verleden gebruikt die tot verschillende fagen terwijl nog steeds een opmerkelijk lage slagingspercentage van de onderzoekers ^5, citeren eerdere studies met lage succespercentages ^8.

Kortom, de isolatietechnieken die in het verleden waren opmerkelijk voor die weinig werkzaamheid in de praktijk, ondanks het geslacht Arthrobacter die de meest voorkomende aerobe bodem isoleren natuur ^4,9, Van Twest en Kropinski ¹⁰ verrijking onderhavige werkwijzen voor het isoleren van fagen van water en grond aangepast van eerdere technieken gebruikt om het milieu bacteriële isolaten maar deze verrijking technieken verrijken inefficiënt gebleken in het isoleren van Arthrobacter fagen. Het doel van de hier beschreven werkwijze verlangde "proof of concept" dat de vroege verrijking werkwijzen kunnen worden aangepast om consistent en effectief te isoleren Arthrobacter fagen overwinnen voorafgaande technische uitdagingen van fagen isoleren van deze bacteriële genus.

Protocol

1. Bereiding van Arthobacter Cellen voor Phage Isolatie

• Cultuur Arthrobacter sp. KY3901 kolonies uitgestreken op Luria Bertaini (LB) agar plaat geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen. Kies een kolonie en een steriele lus toe te voegen aan 250 ml LB-bouillon in een baffled cultuur kolf en geïncubeerd in een incubator schudden bij 225 rpm bij 30 ° C.
• Laat ongeveer 24 uur van de groei van de laat-exponentiële / vroeg-stationaire cellen voor faaginfectie experimenten te verkrijgen. Toezicht houden op de toestand van de bacteriële groei nauw aan cellen voorkomen dat het midden tot de late stationaire groei staat.
  OPMERKING: Celgroei moet bestaan ​​uit een optische dichtheid OD ₆₀₀ van 0,5-.0.7 de faag isolatie- en zuiveringswerkwijzen / stappen hieronder beschreven.

2. Het verzamelen van Fagen van bodemmonsters

1. Verzamel 200-400 g grond van gewenste locatie. Let op: Omdat de bacteriën in de Arthrobacter geslacht zijn gemeenschappelijke bodembacteriën zij en de fagen die hen infecteren kan worden gevonden in en zijn alomtegenwoordig in de meeste grondsoorten.
2. Voeg minstens 400 ml faag buffer (PB) [68 mM NaCl, 10 mM _MgSO4, 10 mM Tris-CL (pH 7,5)] om de bodem en meng in een voldoende grote kolf zodat ten minste 200 ml PB is in het supernatant en kan worden geëxtraheerd.
3. Meng door zachtjes te roeren of zwenken totdat de bodem is opgehangen en laat de bodem neerslag bezinken, meestal 30 min.
4. Voorbij de "bodem extract" door filtreerpapier door de zwaartekracht filtratie om bodemsedimenten vuil te verwijderen.
5. Voeg LB poeder en meng tot een oplossing van 2% (4 g LB poeder in 200 ml grond extract) te maken.
6. Laat de oplossing door een filter van 0,22 pm door vacuümfiltratie om een ​​steriele filtraat te verkrijgen. Indien mogelijk, verder op om onmiddellijk stap 2.7. Indien nodig, opslag gefilterd monsters bij 4 ° C gedurende maximaal een week voor procedure echter het aantal levensvatbare faagdeeltjesworden verminderd.
7. Portie meerdere porties van 50 ml de filter gesteriliseerde LB / bodem extract mengsel in de individuele 250 ml gesteriliseerd schudden verbijsterd kweekflessen behulp van aseptische technieken. Voeg steriele 2,0 M _{CaCl2-oplossing} om de uiteindelijke gewenste concentraties (0-50 mM) aangezien verschillende Arthrobacter fagen groeien optimaal onder verschillende _CaCl2 voorwaarden.
   OPMERKING: We zien dat de meerderheid van de Arthrobacter fagen die door ons zijn binnen het bereik van 1 mM-2,5 mM _CaCl2. Echter, een aantal van de geïsoleerde fagen groeide door ons exclusief op 0 mM _CaCl2 .of bij zeer hoge _CaCl2 concentraties. Ga onmiddellijk naar stap 3.1.

3. Fagen Isolatie

1. Voeg 1 tot 2,5 ml late exponentiële / vroege stationaire fase bacteriekweek aan elk van de kolven. Voor een OD ₆₀₀ 0,5-0,7, gebruik 1 ml van de cellen. Voor een OD ₆₀₀ lager dan een OD van 0,7 gebruiken 2.5 mlcellen.
   OPMERKING: Cellen in exponentiële groeifase leveren doorgaans meer fagen en hogere titers dan cellen in stationaire groeifase.
2. Schudflessen bij 250 rpm bij 30 ° C gedurende ongeveer 24 uur in een schudincubator.
3. Na een 24 uur incubatietijd verwijderen verrijking flesjes uit de schudincubator en verdun de verrijking monsters tienvoudige in faag buffer.
4. Stel cultuur buizen met 0,5 ml van laat-exponentiële / vroege stationaire fase bacteriekweek en voeg verschillende hoeveelheden verrijking kweek (5 ui tot 500 ui van een 10 ^-1 verdunning in PB) aan de kweek buizen.
   OPMERKING: Het is raadzaam om een ​​breed scala van concentraties te testen, aangezien elk grondmonster genereert verschillende faagtiters na verrijking.
5. Voeg _CaCl2 cultuur buizen tot een uiteindelijke concentratie van de aanwezige concentratie in het oorspronkelijke verrijking kolf maken. Gebruik een reeks verschillende _CaCl2 concentraties selecteren voor vele fagen wi variërende _CaCl2 afhankelijkheden.
   LET OP: De meeste fagen wordt geïsoleerd binnen de _CaCl2 scala van 1-2,5 mM maar er zijn fagen geïsoleerd meest optimaal overal 0-50 mM _CaCl2 concentraties. Hierdoor is het het beste om een reeks van _CaCl2 concentraties controleren om het aantal unieke geïsoleerde fagen Arthrobacter maximaliseren.
6. Meng 4,5 ml LB top agar in de cultuur buis en giet het mengsel op een LB agar plaat. Roer voorzichtig te verspreiden over de plaat gelijkmatig en zorgen voor top agar stollen voor ongeveer 15 min.
   OPMERKING: topagar kunnen worden bereid in grote series (250 ml) en extra topagar kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur en opnieuw gebruikt voor daaropvolgende experimenten minstens twee weken. Hoewel er verschillende formules gebruikt om de top agar, maken we top afstrijken met 7 g / L van agar gemengd met LB. Plaats top agar in een 60 ° C waterbad voor het vloeibare toestand behouden in de loop van een experiment.
7. Omkeren tHij plaat en incubeer bij de gewenste temperatuur (temperatuur 30 ° C) O / N tot 48 uur. Variëren deze voorwaarden te optimaliseren voor de huidige fagen. De meeste fagen geïsoleerd vandaan platen geïncubeerd bij 30 ° C bij 1-2,5 mM _{CaCl2-concentratie} na 24 uur incubatie periode.

4. Fagen Zuivering

1. Na 24 uur incubatie cheque voor de vorming van tandplak op platen. Verder incubatie tot 72 uur indien geen plaques zijn evident of om te bepalen of aanvullende plaques verschijnen. Indien nodig, opslag platen met vermeende plaques voor tot een week bij 4 ° C alvorens verder te gaan.
   LET OP: Het is niet ongewoon om een ​​verscheidenheid van verschillende plaque morfologie vinden op een bord. Het vinden plaques na 3 dagen incubatie mogelijk maar zeldzaam.
2. Zuiveren gewenste fagen uit duidelijk geïsoleerd plaques met behulp van de streak plaque methode. Raak een plaquette met een steriele houten stok. Streak de plaque door het uitvoeren van een houten stok door een vlam, allowinG de stok kort afkoelen en vervolgens wrijven de stok op de agar plaat in de zachte beweging zoals weergegeven in figuur 1. Herhaal deze met een schone stick voor elke doorgang.
3. U kunt ook gebruik maken van de traditionele plaque titer test om individuele faagplaques isoleren. De plaque assay titer vereist het gebruik van reagentia zoals LB agar en LB top agar en materialen zoals petrischalen voor faag plaque isolatie. We zijn zeer succesvol verlopen met behulp van de streak plaque methode, maar het is technisch eenvoudiger om individuele plaques met behulp van de plaque titer test te isoleren.
4. Zodra de LB agar plaat minstens driemaal strepen, markeer het gebied met de laagste concentratie van putatieve faagdeeltjes en voorzichtig 0,5 ml Arthrobacter en 4.5 ml van gesmolten LB top agar (die dezelfde concentratie van calciumchloride als het werkstukoppervlak ) en laat het gelijkmatig over de plaat gespreid.
5. Omkeren en incubeer plaat O / N. Herhaal de streak plaquetechniek minstens drie iteraties te zorgen voor een soort zuivere faag wordt geïsoleerd. WINKEL platen bij 4 ° C gedurende maximaal een week nodig tussen stroken zonder significant verlies van levensvatbaarheid faag.
6. Zodra de gewenste plaques zijn geteeld en op de laatste streak plaat geïsoleerd, raakt een goed geïsoleerd plaquette met een micropipet tip en opnieuw op te schorten in 100 ul PB. Serieel verdunnen deze 10 ⁰ oplossing uit naar de 10 ^-8 verdunning door het passeren van 20 ul van het monster in 180 ul van verse PB.
7. Voeg 10 ul van elke verdunning tot 0,5 ml gekweekt Arthrobacter in een kweekbuis 5 tot 10 minuten bij kamertemperatuur en de plaat door het mengen van de geïnfecteerde bacteriën met 4,5 ml van gesmolten LB top agar die dezelfde concentratie van CaCl ₂ gebruikt om de faag te isoleren van de oorspronkelijke bodemmonster. Bewaar alle verdunningen gemaakt bij 4 ° C tot de volgende dag.
8. Bepaal de faag seriële verdunning nodig om een ​​web patroon met behulp van de traditionele plaque titer zo makenzeg eens. Het doel van de plaque assay titer is de faag titer nodig om een ​​web patroon plaat verkrijgen bepalen. Identificeer een web patroon plaat als grotendeels verstoken van bacteriën maar die resten van bacteriën die nog niet gelyseerd door fagen. Voeg 5 ml van de laat-exponentiële / vroeg-stationaire Arthro- cultuur tot een steriele 50 ml kolf.
   1. Voeg 100 ul van de verdunning (dat gaf Webpatroon de Arthrobacter cultuur) in cultuur kolf en laat de fagen om de bacteriën infecteren gedurende 5 tot 10 min bij kamertemperatuur. Meng met gesmolten LB top agar die dezelfde concentratie van CaCl ₂ zoals gebruikt aanvankelijk identificeren faag en plaat 5 ml van dit mengsel op 10 vers LB-platen. Laten stollen en incubeer omgekeerde platen bij 30 ° C.
9. De volgende dag, overstromen Webpatroon platen met 5 ml PB en opslaan O / N bij 4 ° C of 4 uur bij KT.
10. Filter de faaglysaat door een 0,22 pm spuitfilteren bewaar bij 4 ° C. Met deze laatste faagvoorraad aanvullende experimenten zoals elektronen microscopie foto van faagdeeltjes faag genomisch DNA isolatie van DNA restrictie-enzymanalyse en genomische sequencing met behulp van standaardprocedures. Voor de lange termijn opslag van de faag voorraad, voeg een gelijke hoeveelheid van de faaglysaat om steriele glycerol in kleine flesjes voor voorraad archivering bij -80 ° C.
    OPMERKING: Voor degenen die niet ervaren met deze faag technieken, een geweldige bron is de online toegankelijk www.phagesdb.org website.

Resultaten

Om de reproduceerbaarheid van de verbeterde verrijking techniek voor Arthrobacter fagen te tonen, werden 30 verschillende grondmonsters gebruikt op verschillende tijdstippen en locaties tijdens de lente en zomer van 2014. Van deze 30 grondmonsters unieke Arthrobacter fagen werden verkregen uit 22 van verzamelde grondmonsters met behulp van deze verrijking procedure. De standaard verrijkingsprocedure leverde unieke fagen van 3 van dezelfde bodemmonsters. De verrijking monsters kunnen een faag titer hoog...

Discussie

Ondanks vele eerdere pogingen om fagen kunnen infecteren Arthrobacter gastheren isoleren, we hadden weinig succes met behulp van standaard verrijking procedures. De algemene werkwijze van bacteriële verrijking ontwikkeld en aangepast door van Twest en Kropinski ¹⁰ fagen verrijken van milieumonsters blijft de basis voor de meeste verrijking procedures. Bewijs uit eerdere studies blijkt dat methoden van directe plating detecteerbaar plaques op stammen van Arthrobacter hebben geproduceerd, zij ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
LB Broth poeder	Fisher	BP9722-2	Het is het beste om deze in bulk te bestellen.
Gegranuleerde Agar	Fisher	BP1423-2	Het is het beste om deze in bulk te bestellen.
0,22 um spuitfilters	Fisher	09-719A
0,22 um Büchner filters	Fisher	430320	Meer dan 50 ml vloeistof kan worden verkregen door voorzichtig de ontvangstbuis te verwisselen.
Eppendorf buisjes	Fisher	05-408-129
5 ml pipetten individueel	Fisher	13-678-11D
50 ml conische buizen	Fisher	76002844
15 ml conische buizen	Fisher	76002845
10 ml pipetten individueel	Fisher	13-676-10J
25 ml pipetten individueel	Fisher	13-676-10K
Whatman kwalitatief filterpapier	Fisher	1001-824