Transporters in celmembranen maken differentiële segregatie van ionen over celmembranen of cellagen mogelijk en spelen een cruciale rol tijdens weefselfysiologie, herstel en pathologie. We beschrijven de ion-selectieve zelfrefererende micro-elektrode die de meting van specifieke ionfluxen bij enkele cellen en weefsels in vivo mogelijk maakt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cellen van dieren, planten en enkele cellen worden omsloten door een barrière genoemd celmembraan dat het cytoplasma van buitenaf scheidt. Cellagen zoals epithelia vormen een barrière die de binnenzijde scheidt van buitenaf of verschillende compartimenten van multicellulaire organismen. Een belangrijk kenmerk van deze barrières is het differentieel verdeling van de ionen door celmembranen en cellagen. Twee eigenschappen maken het mogelijk deze verdeling: 1) membranen en epithelia weer selectieve permeabiliteit voor specifieke ionen; 2) ionen worden vervoerd door middel van pompen door de celmembranen en cellagen. Deze eigenschappen spelen een cruciale rol in het behoud van het weefsel fysiologie en fungeren als het signaleren signalen na beschadiging, tijdens reparatie, of onder pathologische aandoening. De ion-selectieve zichzelf verwijzende micro-elektrode maakt metingen van specifieke fluxen van ionen zoals calcium, kalium of natrium in enkele cel en weefsel niveau. De micro-elektrode bevat een ionofoor cocktail dieselectief permeabel is voor een specifiek ion. De interne vulling oplossing bevat een set concentratie van het ion van belang. De elektrische potentiaal van de micro-elektrode wordt bepaald door de externe concentratie van de ionen. Aangezien de ionenconcentratie varieert het potentieel van de micro-elektrode verandert als een functie van de log van de ion activiteit. Wanneer heen en weer bewogen buurt van een bron of sink van de ionen (bijvoorbeeld in een concentratiegradiënt vanwege ion flux) de micro-elektrode potentiaal schommelt de amplitude evenredig is met de ion flux / gradiënt. De versterker versterkt het micro-elektrode signaal en de uitgang wordt op de computer. De ionenflux kan dan berekend met de wet van Fick diffusie via de elektrodepotentiaal fluctuatie, de amplitude van micro-elektrode, en andere parameters zoals de specifieke ionenmobiliteit. In dit artikel beschrijven we in detail de methodologie om extracellulaire ion fluxen te meten met behulp van de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektrode eend presenteren een aantal representatieve resultaten.
Inleiding
Alle dierlijke cellen zijn omgeven door een lipide dubbellaag membraan dat het cytoplasma van de buitenomgeving gescheiden. De cel onderhoudt een elektrische membraanpotentiaal, negatieve binnen, door actief transport van ionen 1. De membraanpotentiaal is opgeslagen energiebron die de cel kan gebruiken om verschillende moleculaire apparaten werken in het membraan 2. Neuronen en andere exciteerbare cellen grote membraanpotentialen. Spoedig tot natriumkanalen stort de membraanpotentiaal (depolarisatie) en produceert de actiepotentiaal die loopt langs de lengte van het neuron 2 wordt getransporteerd. Naast deze snelle elektrische v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Voorbereiding
- Bereiding van ion-selectieve micro-elektrode
- Warmte trekt dunwandige borosilicaat haarvaten zonder filament (1,5 mm buitendiameter, 1,12 mm binnendiameter) met een micro-elektrode trekker.
Opmerking: Dit geeft tips 3-4 micrometer in diameter. Kleinere tips hebben een hogere weerstand die microelectrodes gevoeliger zijn voor elektronische ruis produceert en is ook geassocieerd met een langzamere reactie op een verandering in ionenconcentratie. Nuttige informatie kan worden gevonden in de krant gepubliceerd door Smith et al. 26. - Silaniseren de elekt....
- Warmte trekt dunwandige borosilicaat haarvaten zonder filament (1,5 mm buitendiameter, 1,12 mm binnendiameter) met een micro-elektrode trekker.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We hebben eerder aangetoond dat calcium influx verschijnt na enkele cel verwonding 24. Daarom hebben we gevraagd of andere ion fluxen optreden bij enkele cel verwonding. We gebruikten de X. laevis eicel, een gevestigde model voor enkele cel wondgenezing 30-34 en elektrofysiologische opname 24,35-39. Interessant kaliumionen zijn geconcentreerd binnen X. laevis oöcyten (ongeveer 110 mM), 40 dan in de extracellulaire oplossing gebruikt (in MMR 1x: 1 mM) suggeree.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritische stappen voor een succesvolle bepaling van extracellulair ion fluxen in vivo: het verminderen van het lawaai, de correcte fabricage van de ion-selectieve microelectrodes en referentie-elektrode, en de positionering van het monster en beide elektroden.
Om de ruis te minimaliseren, dient het registratiesysteem in een geaarde (geaard) Faraday kooi voorkeur met metaal bedekte (trillingsisolatie) tafel die ook geaard. Bovendien moet de microscoop chassis worden geaard. .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door National Science Foundation-subsidie MCB-0951199, en gedeeltelijk door de NIH-subsidie EY01910, California Institute of Regenerative Medicine-subsidies RB1-01417 en door de Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)-subsidie SFRH/BD/87256/2012.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| IonAmp | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | versterker gemaakt door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) of bij “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| IonAmp32 | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | software gemaakt door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) of bij “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Headstage pre-amplifier | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | INA116 | BSR Voltage Follower INA116, ontworpen door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) of bij “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| MicroStep Driver | BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA | none | drie MicroStep-drivers zijn vereist voor X, Y en Z-positionering; gemaakt door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) of bij “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Manual micropositioner | World Precision Instruments | Model KITE-R | Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | Model M10 | Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Vibration isolation table | Newport Inc. | Model VW-3036-OPT-023040 | Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/) |
| Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted faces | Newport Inc. | Model 360-90 | Assemblage van de driedimensionale micropositionner vereist ook drie elektrische rotatiemotoren voor X, Y, Z-besturing, MPH-1 montagearm met MCA-2 hoekverstelbare paal en verschillende Newport-connectoren en schroeven om op de vibratietafel te bevestigen |
| Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel | Newport Inc. | 460PD-X | none |
| Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel | Newport Inc. | 460A-XY | none |
| Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament | World Precision Instruments | TW150-4 | none |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | none |
| Metal rack | Made in-house | none | Metalen elektrodehouder gemaakt in huis door het boren van 2 mm brede gaten op een halve centimeter afstand in een rechthoekige basis van staal van 10 cm bij 15 cm |
| Oven | QL | Model 10 Lab Oven | none |
| Silanization solution I | Sigma-Aldrich | 85126 | Gevaarlijk, hanteer zoals aanbevolen door de leverancier |
| Glass Petri dish; Pyrex | Fisher Scientific | 316060 | none |
| Electrode/micropipette storage jar | World Precision Instruments | E215 | none |
| Glass dessicator | Fisher Scientific | 08-595E | Bevat Drierite-dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Plaats petroleumgelei op de afdichting om deze luchtdicht te maken. |
| Plastic Pasteur pipette | Fisher Scientific | 11597722 | none |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | S97329 | none |
| Microscope slide | Sigma-Aldrich | S8902 | none |
| Straight microelectrode holder | Warner Instruments | QSW-A15P | met een gouden 1 mm mannelijke connector en Ag/AgCl-draad |
| Straight microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH3S | met een AgCl(Ag+)pellet binnenin en een gouden 2 mm mannelijke connector |
| 6 cm Petri dish | VWR | 60872-306 | none |
| Nitex mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX750 | none |
| Glue; Loctite epoxy | VWR | 500043-451 | Meng lijm en verharder in gelijke delen in een plastic weegbootje en meng grondig. Zet snel maar laat 24 uur op RT staan voor volledige uitharding |
| Deionized water | Sigma-Aldrich | 99053 | none |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | none |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | none |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | none |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | none |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | none |
| Sodium Hydroxyde | Sigma-Aldrich | S8045 | none |
| Potassium Acetate | Sigma-Aldrich | P1190 | none |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | none |
Referenties
- Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
