Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

13.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52782

⸱

3 mei 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 2Departamento de Biologia, Centro de Biologia Molecular e Ambiental, Universidade do Minho, 3Department of Neurology and Center for Neuroscience, University of California, Davis Imaging of Dementia and Aging Laboratory, 4Department of Ophthalmology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

In dit artikel

Samenvatting

Transporters in celmembranen maken differentiële segregatie van ionen over celmembranen of cellagen mogelijk en spelen een cruciale rol tijdens weefselfysiologie, herstel en pathologie. We beschrijven de ion-selectieve zelfrefererende micro-elektrode die de meting van specifieke ionfluxen bij enkele cellen en weefsels in vivo mogelijk maakt.

Samenvatting

Cellen van dieren, planten en enkele cellen worden omsloten door een barrière genoemd celmembraan dat het cytoplasma van buitenaf scheidt. Cellagen zoals epithelia vormen een barrière die de binnenzijde scheidt van buitenaf of verschillende compartimenten van multicellulaire organismen. Een belangrijk kenmerk van deze barrières is het differentieel verdeling van de ionen door celmembranen en cellagen. Twee eigenschappen maken het mogelijk deze verdeling: 1) membranen en epithelia weer selectieve permeabiliteit voor specifieke ionen; 2) ionen worden vervoerd door middel van pompen door de celmembranen en cellagen. Deze eigenschappen spelen een cruciale rol in het behoud van het weefsel fysiologie en fungeren als het signaleren signalen na beschadiging, tijdens reparatie, of onder pathologische aandoening. De ion-selectieve zichzelf verwijzende micro-elektrode maakt metingen van specifieke fluxen van ionen zoals calcium, kalium of natrium in enkele cel en weefsel niveau. De micro-elektrode bevat een ionofoor cocktail dieselectief permeabel is voor een specifiek ion. De interne vulling oplossing bevat een set concentratie van het ion van belang. De elektrische potentiaal van de micro-elektrode wordt bepaald door de externe concentratie van de ionen. Aangezien de ionenconcentratie varieert het potentieel van de micro-elektrode verandert als een functie van de log van de ion activiteit. Wanneer heen en weer bewogen buurt van een bron of sink van de ionen (bijvoorbeeld in een concentratiegradiënt vanwege ion flux) de micro-elektrode potentiaal schommelt de amplitude evenredig is met de ion flux / gradiënt. De versterker versterkt het micro-elektrode signaal en de uitgang wordt op de computer. De ionenflux kan dan berekend met de wet van Fick diffusie via de elektrodepotentiaal fluctuatie, de amplitude van micro-elektrode, en andere parameters zoals de specifieke ionenmobiliteit. In dit artikel beschrijven we in detail de methodologie om extracellulaire ion fluxen te meten met behulp van de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektrode eend presenteren een aantal representatieve resultaten.

Inleiding

Alle dierlijke cellen zijn omgeven door een lipide dubbellaag membraan dat het cytoplasma van de buitenomgeving gescheiden. De cel onderhoudt een elektrische membraanpotentiaal, negatieve binnen, door actief transport van ionen 1. De membraanpotentiaal is opgeslagen energiebron die de cel kan gebruiken om verschillende moleculaire apparaten werken in het membraan 2. Neuronen en andere exciteerbare cellen grote membraanpotentialen. Spoedig tot natriumkanalen stort de membraanpotentiaal (depolarisatie) en produceert de actiepotentiaal die loopt langs de lengte van het neuron 2 wordt getransporteerd. Naast deze snelle elektrische veranderingen, vele weefsels en organen te genereren en aanzienlijke langdurige elektrische potentialen te handhaven. Bijvoorbeeld, huid en hoornvlies epitheel genereren en trans-epitheliale potentialen en extracellulaire elektrische stroom te handhaven door gerichte pompen van ionen (voornamelijk natrium en chloride) 3.

tent "> Hoewel metingen van endogeen extracellulair elektrische stroom met de trillende probe 4-6 en metingen van membraan of trans-epitheliale potentialen via de micro-elektrode systeem 7-10 laten meten van de elektrische parameters van celmembranen en epitheliale cellagen, ze geven geen vermelding van de ionensoort betrokken.

Micro-elektroden met selectieve ionofoor kunt specifieke ion-concentratie in oplossing te meten. Ion gradiënten of flux gemeten kon worden met twee of meer elektroden op verschillende posities. Echter, zou de intrinsieke spanning drift van elke probe verschillend zijn, waardoor onnauwkeurige meting of detectie van een gradiënt die niet aanwezig was. Een enkele elektrode in "self-referencing" -modus waarbij het beweegt bij lage frequentie tussen twee punten lost dit probleem op. Nu is de ion flux kan worden gezien tegen de achtergrond van een relatief langzame en stabiele signaal drift (zie figuur 3B).

De ion-gevoelige meetsysteem maakt gebruik van ion-selectieve self-verwijzingen microelectrodes om kleine extracellulaire stromen van ionen in de buurt van weefsels of enkele cellen op te sporen. Het systeem omvat een versterker die het signaal van de micro-elektrode en een micro-stappenmotor en bestuurder de beweging van de micro-elektrode besturingsprocessen. De ion-selectieve micro-elektrode en de referentie-elektrode die de schakeling sluit zijn verbonden met de versterker via een headstage voorversterker (Figuur 1A). Computer software bepaalt de parameters van de micro-elektrode beweging (frequentie, afstand) en registreert ook de uitgang van de versterker. De stappenmotor regelt de micro-elektrode beweging via een driedimensionale micropositioner. Een laagfrequent trillen ion-selectieve micro-electrode werd eerst ontwikkeld in 1990 specifieke calciumflux 11 meten. Evenals calcium, commercieel toegankelijk ionofoor cocktails zijn nu beschikbaar voor MICR makenoelectrodes gevoelig voor natrium, chloride, kalium, waterstof, magnesium, nitraat, ammonium, fluoride, lithium of kwik.

Kortom, het zichzelf verwijzende ion-selectieve micro-elektrode techniek converteert de activiteit van een specifiek ion in een oplossing in een elektrisch potentiaal, die kan worden gemeten door een voltmeter. De ionofoor cocktail is een mengbare vloeistof (biologisch, lipofiele) fase met ionenwisseling eigenschappen. De ionofoor selectief complexen (bindt) specifieke ionen reversibel en overbrengt tussen de waterige oplossing in de micro-elektrode (elektrolyt) en de waterige oplossing waarin het micro-elektrode is ondergedompeld (figuur 1D). Dit ion overdracht leidt tot een elektrochemisch evenwicht en een variatie van de elektrische potentiaal tussen de micro-elektrode en de referentie-elektrode wordt gemeten door de voltmeter. De spanning is evenredig met de logaritme van de specifieke ionen activiteit volgens de Nernst equation waardoor de berekening van de ionenconcentratie (figuur 2A en B).

Momenteel verscheidene systemen kunnen meten ionenflux met een soortgelijk concept of principe. Bijvoorbeeld, de Scanning Ion-selectieve elektrode Technique (SIET) 12,13 of de micro-elektrode Ion Flux Schatting (MIFE) techniek ontwikkeld door Newman en Shabala 14-16 zijn commercieel verkrijgbaar en veel gebruikt door de onderzoeksgemeenschap om specifieke ion te bepalen fluxen die zich op het celmembraan en weefsel in een verscheidenheid van dieren, planten en enkele levende cel modellen. Ion-selectieve micro-elektroden werden gebruikt om waterstof, kalium en calcium flux tussen plantenwortels 17, chloride flux gemeten in ratten cerebrale arteriën 18 en pollen tubes 19, waterstofflux in skate retinale cellen 20, calciumflux in muizenbeenmerg 21 verschillende ion fluxen in schimmeldraden 22 en in rbij cornea 23 en tenslotte calciumflux in eencellige wondgenezing 12,24. Zie ook de volgende beoordeling voor gedetailleerde informatie over de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektroden 25.

Het volgende artikel beschrijft in detail hoe te bereiden en het meten van endogene extracellulaire ion fluxen met behulp van de ion-selectieve self-verwijzingen micro-elektrode techniek op enkele cel niveau uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Voorbereiding

  1. Bereiding van ion-selectieve micro-elektrode
    1. Warmte trekt dunwandige borosilicaat haarvaten zonder filament (1,5 mm buitendiameter, 1,12 mm binnendiameter) met een micro-elektrode trekker.
      Opmerking: Dit geeft tips 3-4 micrometer in diameter. Kleinere tips hebben een hogere weerstand die microelectrodes gevoeliger zijn voor elektronische ruis produceert en is ook geassocieerd met een langzamere reactie op een verandering in ionenconcentratie. Nuttige informatie kan worden gevonden in de krant gepubliceerd door Smith et al. 26.
    2. Silaniseren de elektroden op het binnenoppervlak hydrofoob hulpmiddel voor retentie van de lipofiele ionofoor cocktail maken. Plaats de micro-elektroden in een metalen rek en warmte O / N in een oven bij> 100 ° C te drogen. Het rek is een metalen plaat met 2 mm diameter gaten geboord deel van de doorgang. Plaats de elektroden in de gaten tip naar boven met een 250 ml glass beker over hen.
    3. In de ochtend, zet de oven uit en terwijl het dragen van isolerende handschoenen, verwijder voorzichtig de metalen rek met de elektroden en de beker op zijn plaats. Sluit de ovendeur om de warmte vast te houden.
    4. Draag latex of nitril, laboratoriumjas en oogbescherming. Met een plastic Pasteur pipet, plaats een druppel silanisering oplossing die ik aan de basis van elke elektrode (houd de beker op zijn plaats, gebruik de stromende lip voor toegang pipet). De silanisatie oplossing wordt verdampt door de hete plaat en silanizes de binnenkant van de elektroden. Gebruik een chemische afzuigkap zuurkast voor deze fase. Plaats het rek / beker / elektroden terug in de hete oven gedurende enkele uren om alle resterende silaneren oplossing te verdampen.
      Opmerking: Om veiligheidsredenen, niet de oven niet weer aan te zetten. Plaats een etiket op de oven aangeeft dat mag niet worden ingeschakeld als het schadelijke en brandbare damp kunnen bevatten.
    5. Na afkoeling, slaan de micro-elektroden in een micro-elektrode opslag jar insiDe een glas exsiccator met 400 g droogmiddel. Micro-elektroden kan dus worden opgeslagen voor vele weken.
      Noot: Een alternatieve silanisatie werkwijze is beschreven in Smith et al 26.
    6. Back vullen van de micro-elektrode met 50 tot 100 gl (een lengte van ongeveer 1 cm) van een oplossing bevattende 100 mM van het ion te meten (zie tabel 1 en figuur 1B). Gebruik een wegwerp plastic Pasteur pipet warmte trok in een bunsenbrander tot een boete filament. Spoel de pipet in dH 2 O daarna om verstopping te voorkomen.
      Opmerking: Als alternatief pas de ionenconcentratie van de opvulling oplossing om de concentratie van ionen passen in de uitwendige oplossing 27.
    7. Let op de micro-elektrode onder een dissectiemicroscoop om de afwezigheid van luchtbellen te verzekeren.
      1. Indien luchtbellen aanwezig zijn kraan de micro-elektrode lichtjes met een nagel terwijl de elektrode verticaal (tip naar beneden) en / of druk op de bubbles uit de tip door het toepassen van tegendruk behulp van een injectiespuit gemodificeerd met een siliconen buis vervangen van de naald.
    8. Tip vullen van de micro-elektrode met 15-20 nl (een lengte van 30-50 pm), van ion-specifieke ionofoor cocktail (zie tabel 1). Plaats een kleine druppel ionofoor cocktail op de korte zijde van een microscoop dia. Let op de micro-elektrode tip onder een dissectie microscoop en bewegen in de richting van de microscoop dia totdat de micro-elektrode tip raakt de ionofoor cocktail voor slechts ongeveer een halve seconde. Teken de ionofoor cocktail in de micro-elektrode door capillaire druk.
      Opmerking: Vermijd een lange kolom van ionofoor cocktail als dit verhoogt de elektrische weerstand van de sonde waarop zij gevoelig zijn voor elektronische storing (ruis) kunnen maken en vertraagt ​​ook de responstijd.
    9. Monteer de micro-elektrode in een rechte micro-elektrode houder met een gouden 1 mm male connector en AgCl (Ag +) draad (Figuur 1B).
    10. Bevestig de micro-elektrode houder aan het hoofd podium gemonteerd op een drie-dimensionale computergestuurde elektronische micropositioner (figuur 1A).
    11. Plaats de micro-elektrode tip in meetoplossing geschikt voor het monster te meten (fysiologisch zout, kweekmedium, etc.) zodat de micro-elektrode stabiliseren van een uur of twee, of zelfs gedurende de nacht.
  2. Bereiding van de referentie-elektrode
    1. Referentie-elektroden (figuur 1C) dezelfde capillairen als hierboven. Snijd de capillair met een diamant potlood in 5 cm lengte en vuur-gepolijst aan elk uiteinde voor 1-2 sec in een Bunsen vlam.
    2. Vul deze elektroden met ~ 200 ul van een 3 M oplossing van NaCl, CH 3 CO 2 K (kaliumacetaat) of KCl met 2% agarose. Kies de oplossing afhankelijk van de ionen te meten (de referentie-elektrode niet de ionen gemeten bevat; zie Tabel 1). Mengenhet agarose en de oplossing en verhit tot bijna koken in een magnetron. Roer tot de agarose op te lossen (de oplossing gaat helder).
    3. Bevestig de referentie-elektrode om een ​​plastic Pasteur pipet en trekken de hete oplossing in het capillair.
    4. Laat de elektrode in koude 3 M NaCl, CH 3 CO 2 K of KCl-oplossing en programmeer op deze 3 M oplossing in afgesloten buizen voor gebruik. Gooi alle referentie-elektroden met luchtbellen.
    5. Monteer de referentie-elektrode in een rechte micro-elektrode houder (pre-gevuld met 3 M-oplossing) met een AgCl (Ag +) pellet binnen en een gouden 2 mm mannelijke connector (figuur 1C) en bevestig de elektrode en houder op een handmatige micro-klepstandsteller gemonteerd op een magnetische standaard.

2. Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Calibration

  1. Het voorbereiden van het kalibreren van oplossingen die het ion van belang als in de referentie-oplossing; zie tabel 1 . Omsluiten de concentratie die in de oplossing het monster in (bijvoorbeeld kweekmedia, fysiologische zoutoplossing). Dat wil zeggen, moet men ijkoplossing een lagere concentratie van ionen bevatten dan in de meetoplossing en één hoger.
    1. Gebruik bijvoorbeeld een zoutoplossing die 1 mM van K + bevat. Om deze concentratie beugel los KCl poeder in gedeïoniseerd water tot een concentratie van 10, 1 en 0,1 mM in seriële verdunningen. Gebruik deze kalibratie-oplossingen. Als alternatief gebruik van ten minste twee van deze oplossingen.
  2. Dompel de ion-selectieve micro-elektrode en de referentie-elektrode in elke ijkoplossing en laat de spanningswaarde stabiliseren 1-3 min voor het opnemen van de overeenkomstige spanning via de speciale software (zie tabel 1).
  3. Omdat de software slaat de data (versterker output) als een txt-bestand, kopieert u de gegevens in een spreadsheet-bestand. Zet de micro-elektrode-uitgang (mV) tegen de logaritme vande molaire ionenconcentratie (Figuur 2A).
  4. Breng een lineaire regressie en bereken de Nernst helling, te onderscheppen en R2 waarde. Accepteer de micro-elektrode als de Nernst helling is 58 ± 11 mV / decade voor monovalente ionen en 29 ± 11 mV / decade voor divalente ionen (voor kationen, de Nernst helling positief is, voor anionen is negatief). Bovendien moet goed microelectrodes een sterke lineaire correlatie (Figuur 2B R 2> 0,9) heeft.
    Opmerking: De mV-uitgang van de versterker die hier gebruikt geeft mV lezing met een tienvoudige gewin. Waarden moeten worden gedeeld door een factor tien.
  5. Met de lineaire regressie om de ruwe mV uitgang van de micro-elektrode converteren naar de eigenlijke ion concentratie (Figuur 2B).

3. Validatie van de Ion-selectieve micro-elektrode Technique

  1. De voorbereiding van een kunstmatige bron
    1. Kunstmatige source haarvaten zijn hetzelfde als haarvatenhierboven. Hitte trek de capillaire met behulp van een micro-elektrode trekker als in stap 1.1.1.
    2. Backfill deze capillairen met 200 gl van een 1 M oplossing van NaCl, KCl, CaCl 2 2 H 2 O of pH 4 buffer. Kies de kunstmatige bron oplossing afhankelijk van de ionen te meten (zie tabel 1).
      Opmerking: Als alternatief, trek elektroden met grotere tip diameter (~ 20 urn) en tip-vullen met dezelfde oplossingen, maar met 0,5-1% agarose (agarose wordt voorkomen dat bulkstroom van de oplossing).
    3. Monteer de kunstmatige bron capillair op een micromanipulator en onder te dompelen in de oplossing wordt gebruikt om de flux van de ionen in de monsters te meten. Laat de kunstmatige bron in de oplossing gedurende 30 min tot 1 h tot een stabiele gradiënt mogelijk.
  2. Validatie van de ion-selectieve micro-elektrode
    1. Dompel de ion-selectieve micro-elektrode ongeveer een centimeter vanaf de kunstmatige capillair bron in de oplossing gebruikt measuopnieuw de flux van ionen op de monsters en sluit het circuit met de referentie-elektrode als voorheen. Laat de spanningswaarde stabiliseren 1-3 min voor het opnemen van de overeenkomstige spanning via de speciale software gedurende 1 tot 2 minuten. Deze waarde correspondeert met de bufferwaarde (in de literatuur ook wel aangeduid als referentie, achtergrond of nulwaarde).
    2. Verplaats de ion-selectieve micro-elektrode tot ongeveer 5 urn van de kunstmatige stralingsbron en laat de spanningswaarde stabiliseren 1-3 min voor het opnemen van de overeenkomstige spanning met de software gedurende 1 tot 2 minuten.
    3. Herhaal de bovenstaande procedure door het plaatsen van de ion selectieve micro-elektrode bij 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 en 1280 urn afstand van de kunstmatige stralingsbron capillair.
    4. Pak de data als een txt-bestand en kopieer de waarden in een spreadsheet-bestand.
  3. Bereken de ion concentratie die overeenkomt met de mV-waarden op dezelfde wijze als de kalibratiewaarden. Plot de waarde.
    Neete: Als een ion flux aanwezig is, de micro-elektrode een verschil in ionenconcentratie tussen de twee standen (figuur 3B) detecteert. Indien de kunstmatige stralingsbron bevat meer ionen van het soort gemeten dan de oplossing moet de concentratie hoger dichtbij de bron dan ver weg, het valideren van het vermogen van de ion-selectieve micro-elektrode te kunnen detecteren de richting van een ion flux (in casu efflux want een kunstmatige spoelbak met lager soortelijk ionenconcentratie dan meetmedium, moet instroom zijn).
    1. Bereken de ionenflux behulp Fick's wet van diffusie: J = c μ (dc / dx) waarbij c de ionenconcentratie in de oplossing (mol -3 cm), μ is de ionenmobiliteit (cm mol N -1 sec -1) en dc is de concentratie verschil over afstand dx (cm) (figuur 2C). Ion flux-gegevens worden gewoonlijk in pmol cm -2 s-1 Of -2 nmol cm -1 sec.
      Noot:.. Een alternatieve werkwijze ionenflux berekenen is beschreven door Smith et al 26 kunnen worden gebruikt. Belangrijke verschillen omvatten het gebruik van de diffusiecoëfficiënt in plaats van de ionenmobiliteit en aftrekken van de achtergrond ionenflux (ook spanningsdrift of correctiefactor) berekend uit metingen van ionenflux in zoutoplossing zonder monster.
    2. Plot het gemiddelde van de ion fluxen van elke stap tegen de afstand tot de bron (Figuur 2D). Afgestapt van de bron, acht een exponentiële afname van de fluxwaarde valideren het vermogen van de ion-selectieve micro-elektrode verschillende magnitude van ionfluxen voelen.
    3. Doe de kunstmatige bron validatie eenmaal voor elk specifiek ion bedoeld om de juiste richting en grootte metingen bevestigen met een grote signaal-n te registrerenoise ratio.
      Opmerking: Ion flux meting van de buffer, zonder samples geeft het achtergrondniveau of ruis. Typisch, buffer meting toont geen duidelijke fluctuatie van de ion concentratie leidt tot zeer kleine flux die variabele richtingen weergeeft.

4. Voorbereiding van de meetkamer

Opmerking: Voordat experimenten, beschouwen het monster moet worden gemeten en hoe het monster moet worden gemonteerd en geïmmobiliseerd voor micro-elektrode metingen.

  1. Voor Xenopus laevis oöcyten metingen snijd een 1 cm plein van een 800 um nylon mesh (Nitex mesh) en plak het in een plastic petrischaal (figuur 1E).

5. Ion Flux Measurement

  1. Meet de ionenconcentratie in de buffer gebruikt voor de metingen aan het monster op dezelfde wijze als de ijkoplossing. X. laevis eicellen nodig Mark's Modified Ringer (MMR). D100 NaCl, 2 KCl, CaCl 2, 1 en 5 MgCl HEPES: issolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl en HEPES in gedeïoniseerd water tot een uiteindelijke concentratie (mM) te bereiken. Stel de pH van de buffer 7,5 behulp NaOH.
  2. Het monster in de meetkamer en breng de ion-selectieve micro-elektrode nabij het ​​monster (ongeveer 10 urn afstand) met het micropositioner in de sluitstand van de micro-elektrode (figuur 3A) te definiëren.
  3. Start de lage frequentie (0,3 Hz) tocht (100 um) van de micro-elektrode tussen de gesloten positie en een positie verwijderd van het monster (afstand) met de speciale software. Zorg ervoor dat de beweging van de micro-elektrode loodrecht op het oppervlak van het monster.
    Opmerking: De excursie van de micro-elektrode kan worden ingesteld op de software. Grote excursie verhoogt de helling te lezen waardoor een eenvoudiger detectie van kleine stromen tijdens de meting, terwijl verlengt de sampling interval en vermindert de temporele resolutie. Zien Figuur 3A een voorbeeld.
  4. Start de opname met behulp van de software. De micro-elektrode pauzeert op elke positie en de elektrische potentiaal in mV wordt opgenomen op de computer. Verkrijgen metingen gedurende minstens 2 min, waardoor het signaal stabilisatie. Voor korte time-lapse experimenten, opnemen mogelijke variaties op de positie van belang zijn voor de hele tijd natuurlijk.
  5. Pak de data als een txt-bestand en kopieer de waarden in een spreadsheet-bestand.
  6. Bereken de ion concentratie die overeenkomt met de mV-waarden op dezelfde wijze als de kalibratiewaarden. Plot de waarde.
    Opmerking: Als een ion flux aanwezig is, de micro-elektrode een verschil in ionenconcentratie tussen de twee standen (figuur 3B) detecteert.
  7. Bereken de ionenflux behulp Fick's wet van diffusie als hiervoor (stap 3.3.1).
  8. Herhaal de buffer meting voor het meten van een nieuw monster en herhaal de procedure van flux meting en berekening voor elke nieuwemonster.

6. Statistische analyse en presentatie van gegevens

  1. Test de onafhankelijke werking van de positie en / of van de tijd op ionfluxen onder controleconditie behulp van een ANCOVA model met gemengde effecten 28.
    Opmerking: Analyse van covariantie (ANCOVA) is een algemeen lineair model dat mengt regelmatige ANOVA en regressie doordat zowel categorische en continue te nemen als onafhankelijke variabelen. Bovendien, in aanwezigheid van gecorreleerde fouten veroorzaakt door herhaalde metingen per individu en eventuele geneste effecten, gemengde effecten modellen worden gebruikt om nauwkeurige schattingen van zowel vaste als random effecten te modelleren.
  2. Bereken paarsgewijze vergelijkingen met behulp van de Student t-test tussen de groep niveaus met Bonferroni correctie voor meerdere testen 28.
  3. Genereer boxplots om ion flux metingen samen te vatten op basis van positie en tijd. Omvat p waarden van de Student t paarsgewijze beschrevenhierboven (Figuur 3D) en vermeld significantie niveau van p-waarden als volgt: *: p <0,05; **: P <0,01; ***: P <0.001 29

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We hebben eerder aangetoond dat calcium influx verschijnt na enkele cel verwonding 24. Daarom hebben we gevraagd of andere ion fluxen optreden bij enkele cel verwonding. We gebruikten de X. laevis eicel, een gevestigde model voor enkele cel wondgenezing 30-34 en elektrofysiologische opname 24,35-39. Interessant kaliumionen zijn geconcentreerd binnen X. laevis oöcyten (ongeveer 110 mM), 40 dan in de extracellulaire oplossing gebruikt (in MMR 1x: 1 mM) suggeree...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meest kritische stappen voor een succesvolle bepaling van extracellulair ion fluxen in vivo: het verminderen van het lawaai, de correcte fabricage van de ion-selectieve microelectrodes en referentie-elektrode, en de positionering van het monster en beide elektroden.

Om de ruis te minimaliseren, dient het registratiesysteem in een geaarde (geaard) Faraday kooi voorkeur met metaal bedekte (trillingsisolatie) tafel die ook geaard. Bovendien moet de microscoop chassis worden geaard. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door National Science Foundation-subsidie MCB-0951199, en gedeeltelijk door de NIH-subsidie EY01910, California Institute of Regenerative Medicine-subsidies RB1-01417 en door de Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT)-subsidie SFRH/BD/87256/2012.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
IonAmp  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAnoneversterker gemaakt door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) of bij “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
IonAmp32  BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAnonesoftware gemaakt door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) of bij “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Headstage pre-amplifier BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAINA116BSR Voltage Follower INA116, ontworpen door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) of bij “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
MicroStep Driver BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USAnonedrie MicroStep-drivers zijn vereist voor X, Y en Z-positionering; gemaakt door het BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij “XBL function matters” (http://www.xuyue.org/) of bij “YoungerUSA” (http://www.youngerusa.com/) of bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Manual micropositioner  World Precision Instruments Model KITE-RSoortgelijk systeem kan worden gekocht bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Magnetic stand   World Precision InstrumentsModel M10Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Vibration isolation table  Newport Inc.     Model VW-3036-OPT-023040Soortgelijk systeem kan worden gekocht bij Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)
Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90°, slotted facesNewport Inc.     Model 360-90Assemblage van de driedimensionale micropositionner vereist ook drie elektrische rotatiemotoren voor X, Y, Z-besturing, MPH-1 montagearm met MCA-2 hoekverstelbare paal en verschillende Newport-connectoren en schroeven om op de vibratietafel te bevestigen
Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X TravelNewport Inc.     460PD-Xnone
Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY TravelNewport Inc.460A-XYnone
Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament World Precision Instruments TW150-4none
Electrode puller Narishige PC-10none
Metal rackMade in-housenoneMetalen elektrodehouder gemaakt in huis door het boren van 2 mm brede gaten op een halve centimeter afstand in een rechthoekige basis van staal van 10 cm bij 15 cm
OvenQLModel 10 Lab Ovennone
Silanization solution I Sigma-Aldrich85126Gevaarlijk, hanteer zoals aanbevolen door de leverancier 
Glass Petri dish; PyrexFisher Scientific316060none
Electrode/micropipette storage jarWorld Precision Instruments E215none
Glass dessicatorFisher Scientific08-595EBevat Drierite-dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Plaats petroleumgelei op de afdichting om deze luchtdicht te maken.
Plastic Pasteur pipette Fisher Scientific11597722none
Bunsen burnerFisher ScientificS97329none
Microscope slideSigma-AldrichS8902none
Straight microelectrode holderWarner InstrumentsQSW-A15Pmet een gouden 1 mm mannelijke connector en Ag/AgCl-draad
Straight microelectrode holder World Precision InstrumentsMEH3Smet een AgCl(Ag+)pellet binnenin en een gouden 2 mm mannelijke connector 
6 cm Petri dishVWR60872-306none
Nitex meshDynamic Aqua-Supply Ltd.NTX750none
Glue; Loctite epoxyVWR500043-451Meng lijm en verharder in gelijke delen in een plastic weegbootje en meng grondig. Zet snel maar laat 24 uur op RT staan voor volledige uitharding
Deionized water Sigma-Aldrich99053none
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653none
Potassium ChlorideSigma-AldrichP9333none
Calcium ChlorideSigma-AldrichC1016none
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM8266none
HepesSigma-AldrichH3375none
Sodium HydroxydeSigma-AldrichS8045none
Potassium AcetateSigma-AldrichP1190none
AgaroseSigma-AldrichA9539none

Referenties

  1. Weber, W. M., Liebold, K. M., Clauss, W. Amiloride-sensitive Na+ conductance in native Xenopus oocytes. Biochimica et biophysica acta. 1239, 201-206 (1995).
  2. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. Journal of cell science. 122, 4267-4276 (2009).
  3. Zhao, M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Seminars in cell & developmental biology. 20, 674-682 (2009).
  4. Jaffe, L. F., Nuccitelli, R. An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents. The Journal of cell biology. 63, 614-628 (1974).
  5. Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe. Nature protocols. 2, 661-669 (2007).
  6. Reid, B., Zhao, M. Measurement of bioelectric current with a vibrating probe. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  7. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  8. Moore, J. W. The patch clamp: single-channel recording. Science. 224, 50-51 (1984).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of visualized experiments. , (2008).
  10. McCaig, C. D., Robinson, K. R. The ontogeny of the transepidermal potential difference in frog embryos. Developmental biology. 90, 335-339 (1982).
  11. Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F. Detection of extracellular calcium gradients with a calcium-specific vibrating electrode. The Journal of cell biology. 110, 1565-1573 (1990).
  12. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. Fertilisation in Higher Plants: molecular and cytological aspects. Cai, G., Cresti, M., Moscatelli, A. , Springer-Verlag. 235-252 (1999).
  13. Kunkel, J. G., Xu, Y., Shipley, A. M., Feijó, J. A. The use of non-invasive ion-selective microelectrode techniques for the study of plant development. Plant Electrophysiology – Theory and Methods. (ed Volkov AG. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 109-137 (2006).
  14. Ordonez, N. M., Shabala, L., Gehring, C., Shabala, S. Noninvasive microelectrode ion flux estimation technique (MIFE) for the study of the regulation of root membrane transport by cyclic nucleotides. Methods in molecular biology. 1016, 95-106 (2013).
  15. Tegg, R. S., Melian, L., Wilson, C. R., Shabala, S. Plant cell growth and ion flux responses to the streptomycete phytotoxin thaxtomin A: calcium and hydrogen flux patterns revealed by the non-invasive MIFE technique. Plant & cell physiology. 46, 638-648 (2005).
  16. Newman, I. A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant, cell & environment. 24, 1-14 (2001).
  17. Kochian, L. V., Shaff, J. E., Kuhtreiber, W. M., Jaffe, L. F., Lucas, W. J. Use of an extracellular, ion-selective, vibrating microelectrode system for the quantification of K(+), H (+), and Ca (2+) fluxes in maize roots and maize suspension cells. Planta. 188, 601-610 (1992).
  18. Doughty, J. M., Langton, P. D. Measurement of chloride flux associated with the myogenic response in rat cerebral arteries. The Journal of physiology. 534, 753-761 (2001).
  19. Messerli, M. A., Smith, P. J., Lewis, R. C., Robinson, K. R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation. The Plant journal : for cell and molecular biology. 40, 799-812 (2004).
  20. Molina, A. J., et al. Neurotransmitter modulation of extracellular H+ fluxes from isolated retinal horizontal cells of the skate. The Journal of physiology. 560, 639-657 (2004).
  21. Marenzana, M., Shipley, A. M., Squitiero, P., Kunkel, J. G., Rubinacci, A. Bone as an ion exchange organ: evidence for instantaneous cell-dependent calcium efflux from bone not due to resorption. Bone. 37, 545-554 (2005).
  22. Lew, R. R. Ionic currents and ion fluxes in Neurospora crassa hyphae. Journal of experimental botany. 58, 3475-3481 (2007).
  23. Vieira, A. C., et al. Ionic components of electric current at rat corneal wounds. PloS one. 6, e17411(2011).
  24. Luxardi, G., Reid, B., Maillard, P., Zhao, M. Single cell wound generates electric current circuit and cell membrane potential variations that requires calcium influx. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 6, 662-672 (2014).
  25. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. H. , (2007).
  26. Smith, P. J., Hammar, K., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Trimarchi, J. R. Self-referencing, non-invasive, ion selective electrode for single cell detection of trans-plasma membrane calcium flux. Microscopy research and technique. 46, 398-417 (1999).
  27. Messerli, M. A., Smith, P. J. Construction theory, and practical considerations for using self-referencing of Ca(2+)-selective microelectrodes for monitoring extracellular Ca(2+) gradients. Methods in cell biology. 99, 91-111 (2010).
  28. Chambers, J., Hastie, T., Pregibon, D. Ch. 48. Compstat. Momirović, K., Mildner, V. , Physica-Verlag HD. 317-321 (1990).
  29. Chambers, J. M., Cleveland, W. S., Kleiner, B., Tukey, P. A. Graphical methods for data analysis. , Wadsworth & Brooks/Cole. (1983).
  30. Burkel, B. M., Benink, H. A., Vaughan, E. M., von Dassow, G., Bement, W. M. A Rho GTPase signal treadmill backs a contractile array. Developmental cell. 23, 384-396 (2012).
  31. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current biology : CB. 9, 579-587 (1999).
  32. Mandato, C. A., Bement, W. M. Contraction and polymerization cooperate to assemble and close actomyosin rings around Xenopus oocyte wounds. The Journal of cell biology. 154, 785-797 (2001).
  33. Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. The Journal of cell biology. 168, 429-439 (2005).
  34. Simon, C. M., Vaughan, E. M., Bement, W. M., Edelstein-Keshet, L. Pattern formation of Rho GTPases in single cell wound healing. Molecular biology of the cell. 24, 421-432 (2013).
  35. Petersen, C. C., Dupont, G. The initiation of a calcium signal in Xenopus oocytes. Cell calcium. 16, 391-403 (1994).
  36. Horisberger, J. D., Lemas, V., Kraehenbuhl, J. P., Rossier, B. C. Structure-function relationship of Na,K-ATPase. Annual review of physiology. 53, 565-584 (1991).
  37. Miledi, R. A calcium-dependent transient outward current in Xenopus laevis oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. London, England, , 491-497 (1982).
  38. Miledi, R., Parker, I. Chloride current induced by injection of calcium into Xenopus oocytes. The Journal of physiology. 357, 173-183 (1984).
  39. Parker, I., Miledi, R. A calcium-independent chloride current activated by hyperpolarization in Xenopus oocytes. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society. 233, 191-199 (1988).
  40. Costa, P. F., Emilio, M. G., Fernandes, P. L., Ferreira, H. G., Ferreira, K. G. Determination of ionic permeability coefficients of the plasma membrane of Xenopus laevis oocytes under voltage clamp. The Journal of physiology. 413, 199-211 (1989).
  41. Adams, D. S., Levin, M. General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters. Cold Spring Harbor protocols. 2012, 385-397 (2012).
  42. Porterfield, D. M. Measuring metabolism and biophysical flux in the tissue, cellular and sub-cellular domains: recent developments in self-referencing amperometry for physiological sensing. Biosensors. 22, 1186-1196 (2007).
  43. McLamore, E. S., et al. A self-referencing glutamate biosensor for measuring real time neuronal glutamate flux. Journal of neuroscience methods. 189, 14-22 (2010).
  44. Yin, M., et al. Highly sensitive and fast responsive fiber-optic modal interferometric pH sensor based on polyelectrolyte complex and polyelectrolyte self-assembled nanocoating. Analytical and bioanalytical chemistry. 399, 3623-3631 (2011).
  45. Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrode technology for non-invasive real-time measurement of biophysical flux and physiological sensing. The Analyst. 134, 2224-2232 (2009).
  46. McLamore, E. S., Jaroch, D., Chatni, M. R., Porterfield, D. M. Self-referencing optrodes for measuring spatially resolved, real-time metabolic oxygen flux in plant systems. Planta. 232, 1087-1099 (2010).
  47. McLamore, E. S., et al. A self referencing platinum nanoparticle decorated enzyme-based microbiosensor for real time measurement of physiological glucose transport. Biosensors & bioelectronics. 26, 2237-2245 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Meting van extracellulaire ionenstroomkalibratie van ionenstroomdiffusie volgens de wet van Fickmicro elektrode assemblageconversie van spanningsregistratieionofoor cocktailoplossingpositionering van biologische monsterskaliumionenstroomanalyse van wondgenezing
Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.