Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

Samenvatting

Om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de door de galgangen gestuurde leverregeneratie bij zebravis te helpen beoordelen, hebben we een leverbeschadigingsmodel opgesteld waarin de nitroreductase-expresserende hepatocyten genetisch worden afgebroken na behandeling met metronidazol. In dit protocol beschrijven we hoe we op bekwame wijze hepatocytenafbraak en door galgangen gestuurde leverregeneratie kunnen manipuleren, bewaken en analyseren.

Samenvatting

De lever heeft een grote capaciteit om te regenereren. Hepatocyten, de parenchymale cellen van de lever kan regenereren op twee manieren: hepatocyte- of gal aangedreven leverregeneratie. In-hepatocyte gedreven leverregeneratie, regenereren hepatocyten afkomstig van reeds bestaande hepatocyten, terwijl in-gal gedreven regeneratie, regeneratie van hepatocyten zijn afgeleid van gal epitheelcellen (BEC). Voor-hepatocyte gedreven leverregeneratie, zijn er uitstekende knaagdieren modellen die aanzienlijk hebben bijgedragen aan de huidige kennis van de lever regeneratie. Er bestaat echter geen dergelijke knaagdier model voor gal gedreven leverregeneratie. We hebben onlangs gemeld op een zebravis leverschade model waarin BEC uitgebreid tot hepatocyten na ernstige hepatocyte verlies. In dit model worden hepatocyten specifiek geablateerd door farmacogenetische middel. Hier presenteren we in detail de methoden om hepatocyten ablatie en de BEC-gedreven lever regeneratieproces analyseren.Dit hepatocyt-specifieke ablatie model kan verder worden gebruikt om de onderliggende moleculaire en cellulaire mechanismen van biliaire aangedreven leverregeneratie ontdekken. Bovendien kunnen deze werkwijzen worden toegepast om chemische schermen van kleine moleculen die uitbreiding of onderdrukken leverregeneratie identificeren.

Inleiding

De lever is een sterk regeneratieve orgaan. Tijdens leverregeneratie, regenereren levercellen, de parenchymcellen van de lever, zijn afgeleid van reeds bestaande hepatocyten (hepatocyte-gedreven lever regeneratie) of BEC (gal gedreven lever regeneratie) ^1,2. Leverbeschadiging teweegbrengt gewoonlijk de verspreiding van latente hepatocyten; Wanneer echter de proliferatie van levercellen wordt aangetast, BEC kan bijdragen tot hepatocyten ^2-4. Deze twee modi van de lever regeneratie zijn klinisch significant. Na chirurgische verwijdering van een gedeelte van de menselijke lever (bijvoorbeeld wegens levertumoren en levende leverdonor), hepatocyten in de lever resterende prolifereren de lever massaverlies herstellen. Daarentegen, bij patiënten met ernstige leverziekten, proliferatie van levercellen sterk aangetast, waardoor BEC of progenitorcellen (LPCs) lijken bij te dragen tot hepatocyten regenereren ^5,6. De knaagdieren 2/3 gedeeltelijke hepatectomie model, waarinhepatocyten verspreiden naar de lever massa verloren te herstellen, heeft aanzienlijk bijgedragen tot de huidige kennis van-hepatocyte gedreven leverregeneratie ^7,8. Er is echter geen geldige knaagdier model waarin hepatocyten regenereren voornamelijk afkomstig van BEC. Hoewel verscheidene knaagdier lever toxine modellen heeft geleid tot de identificatie van biliaire aangedreven leverregeneratie ^2-4, recent lineage tracing studies in muizen wijzen op een minimale bijdrage van BEC te regenereren hepatocyten in deze modellen ^9,10. Enkele knaagdier leverbeschadiging modellen, waaronder gedeeltelijke hepatectomie ^11-13 en acetaminophen geïnduceerde leverschade ^14,15, zijn toegepast op zebravis en leidde tot de identificatie van nieuwe genen en routes die betrokken zijn in leverregeneratie. Echter, hepatocyt-gedreven, maar niet BEC-gedreven, lever regeneratie plaatsvindt in deze zebravis leverschade modellen. Daarom is een nieuw leverschade model waarin BEC schaal bijdragen tot regenerating hepatocyten is nodig voor een beter begrip van BEC-gedreven lever regeneratie.

De algemene doelstellingen van de hepatocyt ablatie model hier beschreven zijn (1) een leverschade model waarin BEC schaal bijdragen tot hepatocyten regenereren, en (2) ophelderen van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen BEC-driven leverregeneratie genereren. Onze hypothese was dat de ernst van de blessure bepaalt de wijze van leverregeneratie; dus we voorspeld dat gal gedreven leverregeneratie zou starten op ernstige hepatocyte letsel. Om deze hypothese te testen, hebben we een zebravis leverschade model door het genereren van een transgene lijn, Tg (fabp10a: CFP-NTR) ^s931, die sterk tot uitdrukking bacteriële nitroreductase (NTR) versmolten met cyaan fluorescente eiwit (GVB) in het kader van de hepatocyt-specifieke fabp10a promoter. Aangezien NTR zet de niet-giftige prodrug, metronidazol (Mtz), een cytotoxisch geneesmiddel, dat ablates alleen de bedoelde NTR-expressie brengen ^16-18, in dit geval, de hepatocyten. Door het manipuleren van de duur van Mtz behandeling, kan de omvang van hepatocyten ablatie worden gecontroleerd. Met behulp van dit model hebben wij onlangs gemeld dat men krijgt bij zware hepatocyt verlies, BEC uitvoerig leiden tot hepatocyten regenereren ^19, die verder werd bevestigd door twee onafhankelijke studies ^20,21. Daarom is in vergelijking met voornoemde knaagdieren en zebravis leverbeschadiging modellen ons hepatocyten ablatie model is voordeliger voor het bestuderen BEC-driven leverregeneratie.

Dit protocol beschrijft de procedure voor het uitvoeren van leverregeneratie experimenten met de zebravis hepatocyte ablatie model. Dit model is geschikt voor het bepalen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan-gal gedreven lever regeneratie en chemische schermen om kleine moleculen die kunnen onderdrukken of versterken leverregeneratie identificeren.

Protocol

Zebravis zijn gerezen en gefokt volgens de standaard procedure; experimenten werden goedgekeurd door de Universiteit van Pittsburgh Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Voorbereiding van de embryo's / larven

1. Om getimede paringen, opgezet volwassen mannelijke en vrouwelijke Tg (fabp10a: CFP-NTR) voeren ^s931 hemizygoot of homozygote vissen O / N en plaats een scheidingslijn tussen hen. Verwijder deze divider de volgende morgen toen de paring wordt gewenst. Verzamel embryo's door overbelasting van het water met een fijne plastic zeef.
2. Draai het filter ondersteboven en spoel het gaas oppervlak met een fijne stroom van ei water afgegeven uit een knijpfles. Breng 100 embryo's in een 100 mm petrischaal met 25 ml water ei. Houd niet meer dan 100 embryo's per petrischaal en hen te verhogen bij 28 ° C.
3. Om pigmentatie remmen, voeg fenylthioureum (PTU) in de petrischaaltjes vóór 10 uur na de bevruchting (HPF) en verhogen embryos / larven tot 80 hpf. De eindconcentratie van 0,2 mM PTU. LET OP: PTU is giftig. Gebruik in overeenstemming met de juiste behandeling richtlijnen.
4. Verdoven de larven door toevoeging van 3-aminobenzoëzuur ethylester (tricaïne) bij een eindconcentratie van 0,016%, in de petrischalen. Dan, met een epifluorescentiemicroscoop, sorteren CFP-positief larven. Gebruik larven met een vergelijkbare grootte lever- en lever met een kleinere of grotere lever.
   OPMERKING: elke CFP-positieve larven, ongeacht de intensiteit kan gebruikt worden omdat er geen verschil in de mate van ablatie hepatocyt tussen hemizygote en homozygote larven. LET OP: tricaïne is giftig. Gebruik in overeenstemming met de juiste behandeling richtlijnen.
5. Verwijder het ei water met tricaïne en voeg ei water aangevuld met 0,2 mM PTU. Houd de embryo's / larven bij 28 ° C.

2. Mtz Behandeling

1. Bereid verse 10 mM Mtz oplossing door het oplossen van 0,171 g Mtz poeder in 100 ml ei water, aangevuld met 0,2% DMSO en 0,2 mM PTU. Om volledig op te lossen de Mtz, meng de oplossing bij RT met snel roeren gedurende 20-30 minuten. Om u te helpen oplosbaar Mtz en Mtz permeatie verbeteren in de larven, voeg DMSO bij de voorbereiding Mtz. LET OP: langdurige blootstelling of een verhoogde concentratie van Mtz is giftig. Gebruik in overeenstemming met de juiste behandeling richtlijnen.
2. Scheid de larven in controle- en experimentele groepen door overdracht gewenst aantal larven in twee afzonderlijke 100 mm petrischaaltje of multi-well plaat. Voor de experimentele groep, houden de larven in 10 mM Mtz oplossing; voor de controle groep, bewaar ze in ei water met 0,2% DMSO.
3. Bedek de platen of platen met de Mtz oplossing met aluminiumfolie om de foto-inactivatie van Mtz voorkomen en incubeer bij 28 ° C. De duur van Mtz behandeling is afhankelijk van het larvale stadium en transgene lijn.
4. Om soortgelijke ernstige hepatocyte ablatie in het observeren Tg (fabp10a: CFP-NTR) lijn, behandelen de larven met de Mtz oplossing van ofwel 3,5 dagen na de bevruchting (DPF) (voor een periode van 36 uur) of van 5 DPF (voor een periode van 24 uur).

3. Analyse van Biliary-driven leverregeneratie

1. Aan het einde van het ablatie periode verwijderen Mtz oplossing van de platen. Was de Mtz-behandelde larven door het toevoegen van 25 ml van het ei water. Swirl de plaat 2-3 keer om de larven te wassen voor het teruggooien het ei water. Herhaal dit drie keer en dan dompel de larven nogmaals in ei water. Om hart oedeem en larven dood te vermijden in de Mtz behandelde larven, voeg een lagere concentratie tricaïne, bij een eindconcentratie van 0,008%, de larven immobiliseren.
2. Voor lever analyse onderzoekt de lever grootte van de Mtz-behandelde larven onder een epifluorescentiemicroscoop met het GVB filter. Beoordelen hepatocyte ablatie niveaus op basis van de relatieve grootte van de lever: grote (non-ablatie; 0-10% larven), medium (deels weggenomen; 10-20%) en kleine (volledig weggenomen; 80-90%).
3. Verwijder de larven met niet-ablatie of gedeeltelijk weggenomen levers. Alleen houden larven met een kleine lever, wat duidt op ernstige hepatocyt ablatie. Voor lever analyse op de regeneratie 0 uur tijdstip (R0h), oogsten de larven na Mtz uitspoeling en CFP sorteren. Anders houdt de gesorteerde larven in ei water aangevuld met 0,2 mM PTU totdat klaar voor de oogst.
4. Overdracht geoogst larven in een 1,5 ml microcentrifugebuis en vervangen ei water met de fixatie oplossing van 3% formaldehyde in PEM buffer. Incubeer de buis op een rotator O / N bij 4 ° C.
5. Vervang de fixatie-oplossing met 1 ml van PBSDT en draai de buis met de larven op de rotator gedurende 5 min.
6. Breng de vaste larven in een 100 mm petrischaaltje met PBSDT en behulp van een tang, handmatig dooier en borstvinnen te verwijderen onder een dissectie microscoop. Transfer up tp 20 ontleed larven in een 1,5 ml buis.
7. Vervang PBSDT oplossing 1 ml blokkeringsoplossing en rock de buis op een rotator bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
8. Vervang blokkeeroplossing met 100 ul van blokkeeroplossing die primaire antilichamen. Langzaam rock de buis op een rotator O / N bij 4 ° C.
9. Verwijder het primaire antilichaam oplossing en was met PBSDT 5 maal gedurende 10 minuten per keer. Voeg vervolgens 100 ul van blokkeeroplossing die secundaire antilichamen en schommel het op een rotator bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
10. Was 5 keer met PBSDT gedurende 10 minuten per keer bij RT door rocken op een rotator.
11. Richt de larven zijdelings op een microscoopglaasje en voeg een druppel fixeermiddelen. Bedek ze voorzichtig met een glazen deksel en sluit het deksel glas met een nagel polijstmachine. Nu het klaar is voor confocale microscopie.

Resultaten

Mtz behandeling van 36 uur (A36h, A staat voor ablatie) 3,5-5 DPF drastisch verminderd size lever (Figuur 1B). Na Mtz wash-out, beschouwd als het begin van de lever regeneratie (R), sterke fabp10a: CFP-NTR en fabp10a: DsRed uitdrukking zich binnen 30 uur (Figuur 1B). De intrahepatische biliaire netwerk, zoals beoordeeld door expressie van Alcam die aanwezig zijn in het membraan van BEC ²² is aanvankelijk ingestort maar werd hersteld op 54 uur na washout (R54...

Discussie

Serieus, maar niet mild, hepatocyte ablatie lokt-gal gedreven leverregeneratie. Daarom na Mtz behandeling en washout, is het belangrijk om de grootte van de lever Mtz behandelde larven, die kan worden bepaald door intrinsieke fluorescentie van de CFP fabp10a onderzoeken: CFP-NTR transgen. Aangezien een klein percentage van de Mtz behandelde larven niet-geablateerde (0-5%) of gedeeltelijk geablateerd (10-20%) levers weergegeven, is het noodzakelijk om uit slechts analyseren de larven met een zeer kleine lever, d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Maak 0.4% (15 mM) tricaine stock : Breng 0.4 g tricaine tot 100 mL met eiwater. Pas aan tot pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549
Calcium sulfate dihydrate	Sigma-Aldrich	C3771
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Montage medium (Vectashield)	Vector Laboratories	H-1000
100 x 15 mm petrischaal	Denville Scientific Inc.	M5300
heldere nagellak	Fisher Scientific	50949071
fijne pincetten	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
glasplaatje	Fisher Scientific	12-544-1
glasdekje	Fisher Scientific	12-540-A en 12-542-A	18 x 18 mm
zn-5 (muis anti-Alcam)	ZIRC	zn-5	1:10 verdunning
geit anti-Hnf4a	Santa Cruz	sc-6556 (C-19)	1:50 verdunning
rat anti-RFP	Allele Biotechnology	ACT-CM-MRRFP10	1:300 verdunning
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-geit IgG (H+L)	Jackson laboratories	705-605-147	1:500 verdunning
AlexaFluor 647 AffiniPure Geit Anti-muis IgG (H+L)	Invitrogen	A21240	1:500 verdunning
Cy3 ezel anti-rat IgG	Jackson laboratories	712-165-150	1:500 verdunning
dissectiemicroscoop	Leica Microsystems	S6F
epifluorescentiemicroscoop	Leica Microsystems	M205FA
confocale microscoop	Carl Zeiss	LSM700
eiwater			0.3 g/L zeezouten ‘Instant Ocean’ en 0.5 mM CaSO4 in gedistilleerd water.
[header]
10X PBS			25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.  Breng tot 1 L met gedistilleerd water.  Pas pH 7 aan.  Autoclaveer gedurende 20 min bij 121°C.
1X PBSDT			0.2% Triton X-100 en 0.2% DMSO in 1 X PBS.
PEM buffer			30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.  Breng tot 1 L met gedistilleerd water.  Pas pH 7 aan.
Blocking oplossing			Meng 1 ml verhitte geitenserum met 9 ml van 1X PBSDT.