Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

Summary

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Abstract

De lever heeft een grote capaciteit om te regenereren. Hepatocyten, de parenchymale cellen van de lever kan regenereren op twee manieren: hepatocyte- of gal aangedreven leverregeneratie. In-hepatocyte gedreven leverregeneratie, regenereren hepatocyten afkomstig van reeds bestaande hepatocyten, terwijl in-gal gedreven regeneratie, regeneratie van hepatocyten zijn afgeleid van gal epitheelcellen (BEC). Voor-hepatocyte gedreven leverregeneratie, zijn er uitstekende knaagdieren modellen die aanzienlijk hebben bijgedragen aan de huidige kennis van de lever regeneratie. Er bestaat echter geen dergelijke knaagdier model voor gal gedreven leverregeneratie. We hebben onlangs gemeld op een zebravis leverschade model waarin BEC uitgebreid tot hepatocyten na ernstige hepatocyte verlies. In dit model worden hepatocyten specifiek geablateerd door farmacogenetische middel. Hier presenteren we in detail de methoden om hepatocyten ablatie en de BEC-gedreven lever regeneratieproces analyseren.Dit hepatocyt-specifieke ablatie model kan verder worden gebruikt om de onderliggende moleculaire en cellulaire mechanismen van biliaire aangedreven leverregeneratie ontdekken. Bovendien kunnen deze werkwijzen worden toegepast om chemische schermen van kleine moleculen die uitbreiding of onderdrukken leverregeneratie identificeren.

Introduction

De lever is een sterk regeneratieve orgaan. Tijdens leverregeneratie, regenereren levercellen, de parenchymcellen van de lever, zijn afgeleid van reeds bestaande hepatocyten (hepatocyte-gedreven lever regeneratie) of BEC (gal gedreven lever regeneratie) ^1,2. Leverbeschadiging teweegbrengt gewoonlijk de verspreiding van latente hepatocyten; Wanneer echter de proliferatie van levercellen wordt aangetast, BEC kan bijdragen tot hepatocyten ^2-4. Deze twee modi van de lever regeneratie zijn klinisch significant. Na chirurgische verwijdering van een gedeelte van de menselijke lever (bijvoorbeeld wegens levertumoren en levende leverdonor), hepa....

Protocol

Zebravis zijn gerezen en gefokt volgens de standaard procedure; experimenten werden goedgekeurd door de Universiteit van Pittsburgh Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Voorbereiding van de embryo's / larven

1. Om getimede paringen, opgezet volwassen mannelijke en vrouwelijke Tg (fabp10a: CFP-NTR) voeren ^s931 hemizygoot of homozygote vissen O / N en plaats een scheidingslijn tussen hen. Verwijder deze divider de volgende morgen toen de paring wordt gewenst. Verzamel embryo's door overbelasting van het water met een fijne plastic zeef.
2. Draai het filter ondersteboven en spoel....

Results

Mtz behandeling van 36 uur (A36h, A staat voor ablatie) 3,5-5 DPF drastisch verminderd size lever (Figuur 1B). Na Mtz wash-out, beschouwd als het begin van de lever regeneratie (R), sterke fabp10a: CFP-NTR en fabp10a: DsRed uitdrukking zich binnen 30 uur (Figuur 1B). De intrahepatische biliaire netwerk, zoals beoordeeld door expressie van Alcam die aanwezig zijn in het membraan van BEC ²² is aanvankelijk ingestort maar werd hersteld op 54 uur na washout (R54.......

Discussion

Serieus, maar niet mild, hepatocyte ablatie lokt-gal gedreven leverregeneratie. Daarom na Mtz behandeling en washout, is het belangrijk om de grootte van de lever Mtz behandelde larven, die kan worden bepaald door intrinsieke fluorescentie van de CFP fabp10a onderzoeken: CFP-NTR transgen. Aangezien een klein percentage van de Mtz behandelde larven niet-geablateerde (0-5%) of gedeeltelijk geablateerd (10-20%) levers weergegeven, is het noodzakelijk om uit slechts analyseren de larven met een zeer kleine lever, d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder	Sigma-Aldrich	A5040	Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M1547
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549
Calcium sulfate dihydrate	Sigma-Aldrich	C3771
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Mounting media (Vectashield)	Vector Laboratories	H-1000
100 x 15 mm petri dish	Denville Scientific Inc.	M5300
clear nail polish	Fisher Scientific	50949071
fine forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5
glass slide	Fisher Scientific	12-544-1
glass coverslip	Fisher Scientific	12-540-A and 12-542-A	18 x 18 mm
zn-5 (mouse anti-Alcam)	ZIRC	zn-5	1:10 dilution
goat anti-Hnf4a	Santa Cruz	sc-6556 (C-19)	1:50 dilution
rat anti-RFP	Allele Biotechnology	ACT-CM-MRRFP10	1:300 dilution
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)	Jackson laboratories	705-605-147	1:500 dilution
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21240	1:500 dilution
Cy3 donkey anti-rat IgG	Jackson laboratories	712-165-150	1:500 dilution
dissecting microscope	Leica Microsystems	S6F
epifluorescence microscope	Leica Microsystems	M205FA
confocal microscope	Carl Zeiss	LSM700
egg water			0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.
[header]
10X PBS			25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.  Bring to 1 L with distilled water.  Adjust pH 7.  Autoclave for 20 min at 121°C.
1X PBSDT			0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS.
PEM buffer			30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.  Bring to 1 L with distilled water.  Adjust pH 7.
Blocking solution			Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT.