Hier demonstreren we de meest efficiënte methoden voor het invriezen, inbedden, cryosecteren en kleuren van spierbiopten om bevriezingsartefacten te voorkomen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Do's en Don'ts in de voorbereiding van Muscle Weefsel secties voor histologische analyse
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Histologische evaluatie van de spier biopsieën heeft gediend als een onmisbaar hulpmiddel in het begrijpen van de ontwikkeling en progressie van de pathologie van neuromusculaire aandoeningen. Echter, om dit te doen, de juiste zorg moet worden genomen bij het uitsnijden en conservering weefsels optimale kleuring bereiken. Een methode van weefsel behoud impliceert vaststelling van weefsels in formaldehyde en vervolgens inbedding ze met paraffine. Deze werkwijze behoudt morfologie goed en zorgt voor langdurige opslag bij kamertemperatuur, maar is omslachtig en vereist behandeling van toxische stoffen. Verder formaldehyde fixatie leidt antigeen cross-linking die antigen retrieval protocollen noodzakelijk voor een effectieve immunokleuring. Integendeel, ofwel bevroren coupes geen fixatie nodig en behoudt dus biologische antigen conformatie. Deze methode biedt ook een duidelijk voordeel in snelle draai rond tijd, waardoor het vooral handig in situaties nodig snel histologische evaluatie zoals intraoperatief chirurgische biopten. Hier beschrijven we de meest effectieve methode voor het bereiden spierbiopsieën visualisatie met verschillende histologische en immunologische vlekken.
Inleiding
Onderzoek van de spieren histologie speelt een cruciale rol in het begrijpen van verschillende soorten neuromusculaire aandoeningen 1-4. In combinatie met andere technieken, laat onderzoekers een beter beeld van de openbaring en de progressie van de pathologie krijgen en kunnen ook van essentieel belang voor de efficiëntie van een therapeutische interventie 10/05 evalueren. Echter, om nauwkeurig te zijn, moet het weefsel op de juiste wijze worden bewaard om de fysiologische toestand onmiddellijk voor excisie behouden. Dit vereist grote zorg tijdens het verwijderen, behoud, snijden, en vlekken.
Weefsels kunnen worden bereid op twee verschillende manieren voor lichtmicroscopische studie. De eerste methode, formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) secties, vereist weefsels in 10% natuurlijk gebufferd formaldehyde vast te stellen voordat ze worden ingebed met paraffine 11,12. De fixatie stap helpt om de morfologie beter, maar ook kruisverbindingen endogene pr behoudenoteins dus noodzakelijk ingewikkelde antigen retrieval procedures voor immunokleuring en het elimineren van de mogelijkheid van enzymatische vlekken op dergelijke secties 12. Vriescoupes, anderzijds, hoeven niet vooraf vastgesteld of verwerkt; Daarom, eiwitten zijn in staat om inheemse biologische conformaties 13,14 behouden. Verder vriescoupes stelt snel doorlooptijd, die soms noodzakelijk is, bijvoorbeeld in de intra-operatieve diagnose van sarcomen en andere chirurgische biopten 15. Indien niet goed uitgevoerd, deze methode is gevoelig voor beschadiging, die wijzigingen van de spierarchitectuur waardoor de secties geschikt zijn voor histologisch onderzoek introduceert bevriezen. Dit document zal de meest effectieve methode om spieren biopten te bereiden met het oog op een optimale kleuring voor de juiste examen te bereiken schetsen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Tissue Oogst en Bevriezing van spierweefsel
- Euthanaseren de muizen met een overdosis van isofluraan (2-chloor-2- (difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethaan). Voer deze stap in een zuurkast en gebruik een secundaire containment methode, zoals een exsiccator of een stolp met een wattenstaafje gedrenkt in isofluraan.
- Bevestig de dood door stevig knijpen voetzool. Met een tweede werkwijze voor euthanasie zoals cervicale dislocatie.
- Bevochtig de vacht met 70% alcohol aan het plakken van losse haarlokken op de spieren te verminderen. Schil de huid van de ledematen met een fijne tang, zoals # 5.
- Haal voorzichtig de spier plaats (tibialis anterior (TA) in dit geval) van de botten eronder, uitgaande van de pees en verwijderen.
- Accijnzen de spier, bedek het in oktober (Optimale Cutting Temperature verbinding), en leg het plat op een label wegwerp bevriezing schimmel. Zorg ervoor dat de spier is op zijn normale fysiologische oriëntatie (kop tot tail) zonder strekken. Alternatief invriezen spier aan kleine vierkantjes piepschuim en speld gebruik insect pinnen op de juiste lengte van de spieren te waarborgen.
- Chill 2-methylbutaan (isopentaan) in een stalen beker met behulp van vloeibare stikstof. Dit duurt gemiddeld 3-5 min. Blijf roeren met tussenpozen totdat witte neerslagen beginnen te vormen op de bodem en wanden van de beker.
OPMERKING: Wanneer dit gebeurt, isopentaan heeft optimale vriestemperatuur bereikt (-150 ° C) - Dompel het -vormen met spieren in de gekoelde 2-methylbutaan. Freeze kleine spieren zoals het membraan en extensor digitorum longus (EDL) gedurende 6-12 sec en grotere spieren zoals de gastrocnemius soleus (GS) en triceps gedurende 15-20 sec. Laat de spieren niet te bevriezen te lang, omdat dit kan leiden tot scheurvorming.
- Breng de bevroren weefsel op droog ijs en laat de isopentaan verdampen (dit proces duurt gemiddeld ongeveer 15 - 20 min). Wikkel de weefsels in aluminiumfolie en bewaar ze bij uLTRA lage temperatuur (-70 ° C tot -80 ° C) tot snijden.
2. Inbedding de weefsels in oktober naar Tissue Block Bereid
- Transport weefsels op droog ijs naar cyrostat te ontdooien te voorkomen. Overdracht weefsel kamer (ingesteld op -20 tot -24 ° C volledig ontdooien van weefsels te voorkomen) en laat ze equilibreren gedurende 30 min Cryostaat.
- Draai de baai Peltier koeling op. Als de cryostaat deze koeling niet heeft, gebruikt aerosol koeling spray om snel te bevriezen de LGO. Laat niet de spier dooi op enig moment tijdens de inbedding, want dit kan resulteren in vorstschade.
- Voeg een uniforme dunne laag van oktober op het monster schijf en laat het afkoelen. Wanneer de meeste van de oktober onderaan terwijl vloeistof op de bovenkant bevroren, plaatst het weefsel in de juiste richting (loodrecht op oktober voor dwarsdoorsneden evenwijdig aan oktober voor langsprofielen). Gebruik aerosol koelnevel snel bevriezen oktober Raak de unembeded deel van het weefsel met warmte extractor en wacht 45 sec.
- Voeg een dun laagje oktober rond de spier, nevel met aerosol koelnevel en uitpakken warmte in de vorige stap.
- Voeg hieraan oktober in kleine stappen snel invriezen oktober een combinatie van aerosol koelnevel en warmteafvoerblok totdat alle spieren bedekt.
- De thermische extractor bovenop de weefselblokje en wacht 5 minuten.
3. Voorbereiden van Profielen en identificeren van de secties van Mid-buik regio van de spieren
- Monteer het monster op de objectkop. Draai de knop om de schijf te beveiligen. Zorg ervoor dat het monster schijf in goed contact met het monster hoofd.
- Pas de kamer temperatuur tussen -21 en -24 ° C en wacht tot de ingestelde temperatuur is bereikt.
- Pas de dikte instellingen (7 urn); trimmen van het blok door oprukkende of terugtrekken van de blok met grove en fijne instellingen.
- Verzamel de sectieson voorverwarmde positief geladen objectglaasjes door de bovenkant van de schuif op de secties via de aantrekking tussen tegengestelde ladingen op de hechting van de snijvlakken aan de slede te vergemakkelijken.
- Identificeer de mid-belly secties door het meten doorsnede (CSA) van de secties. Gebruik hiervoor imaging software op de computer die is aangesloten op de microscoop.
OPMERKING: fasecontrastbeelden genomen en de omtrek van de gehele spier wordt gemeten via een tracing functie het softwareprogramma. Daardoor wordt het CSA als minimale fret diameter (maat fiber dwarsdoorsnedeafmeting die wordt uitgedrukt als de kleinste afstand tussen twee evenwijdige raaklijnen aan weerszijden van een deeltje) metingen verkregen. Opmerking: Wanneer CSA en minimale fret diameter metingen beginnen te plateau, is medio buik bereikt. - Inventarisatie en archiveren van de dia's bij -80 ° C voor toekomstige vlekken.
OPMERKING: oktober hoeft niet vooraf te worden verwijderd staining procedures. Zodra dia's worden afgedekt, zijn ze klaar om direct te worden gekleurd.
4. kleuring
OPMERKING: Terwijl de uitvoerige stap-voor-stap procedures kan gevonden worden op het product informatieblad en moet worden gevolgd voor het kleuren procedures, kunnen persoonlijke optimalisatie nodig zijn om een optimale kleuring te verkrijgen.
- Omdat fixeermiddelen (zie tabel) niet mengbaar is met water, droogt dia's door toenemende graden van alcohol (2 minuten elk in 70%, 95% en 100% ethanol) en duidelijke hen met xyleen (100% gedurende 5 minuten) om te waarborgen slides niet ondoorzichtig geworden in de tijd.
- Coverslip secties en laat ze drogen. Afbeelding met microscoop uitgerust met imaging software.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De set-up voor de oogst en bevriezen van weefsel te zien in figuur 1. Uitgesneden weefsels moeten worden opgeslagen op een gaasje gedrenkt in PBS tot drogen (figuur 1A) voorkomen. Wanneer weefsels zijn geselecteerd om te worden gebruikt voor histologische analyse moeten ze worden ondergedompeld in OCT en aangelegd op cryo schimmel in de juiste oriëntatie en zo dicht mogelijk fysiologische lengte mogelijk nauwkeurige morfologie (figuur 1B) te waarborgen. Slurry isopentaa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Histologie en immunohistochemie werden gebruikt als essentiële hulpmiddelen voor het begrijpen van de openbaring en de progressie van de pathologie in verschillende neuromusculaire aandoeningen. Klassiek, werden spierbiopten eerst vastgesteld in formaldehyde en vervolgens ingebed met paraffine. Terwijl formaldehyde fixatie behoudt weefsel architectuur en maakt het weefsel opslag en transport bij RT, maar inactiveert ook enzymen en crosslinks eiwitten noodzakelijk verdere stappen om nauwkeurige immunokleuring bereiken. D...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen Alex Miller bedanken voor het revisiewerk aan het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de onderzoekssubsidies die aan M.G. werden toegekend door Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) en Muscular Dystrophy Association (218938).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., kantoor telefoon 1-800-248-0123 Alternatief: Richard Allen Scientific |
| Microscoop | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Telefoon: 1-631-547-8500 Alternatief: Olympus |
| Beeldanalysesoftware | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Telefoon: 1-631-547-8500 Alternatieven: Image J, Metamorph |
| Isofluraan | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternatieve bron: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific |
| Wegwerp weefselvorm | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific |
| Colorfrost plus-glazen | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific |
| Aceton | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific |
| Ethylalcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific |
| 2-methyl butaan | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific |
| XYleen | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific |
| Hematoxyline Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific |
| Eosine | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternatieve bron: VWR Scientific |
Referenties
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779(2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14(2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
