Athymische Rat Model voor de Evaluatie van Engineered voorste kruisband Grafts

Samenvatting

Diermodellen zijn belangrijke hulpmiddelen voor de evaluatie van door weefseltechniek ontwikkelde grafts. Dit artikel presenteert het protocol voor het bereiden van een elektrospunnend biologisch afbreekbaar polymeer graft voor gebruik in weefseltechniek van het voorste kruisband, evenals een chirurgisch protocol voor implantatie in een rattenmodel.

Samenvatting

Ruptuur van het voorste kruisband (ACL) is een veelvoorkomende ligamentblessure die vaak een operatie vereist omdat de ACL niet goed geneest zonder tussenkomst. De huidige behandelingsstrategieën omvatten ligamentreconstructie met een autograaf of allograaf, die elk hun eigen beperkingen hebben. Daarom is er belangstelling voor het ontwerpen van een weefselgeëngINEERD graft voor gebruik in ACL-reconstructie. We beschrijven de fabricage van een door elektrospinnen gevormd polymeer-graft voor gebruik in ACL-weefsel engineering. Dit polycaprolacton-graft is biocompatibel, biologisch afbreekbaar, poreus en bestaat uit uitgelijnde vezels. Omdat een diermodel noodzakelijk is om een dergelijk graft te evalueren, beschrijft dit artikel een intra-articulaire athymische rattenmodel van ACL-reconstructie dat kan worden gebruikt om geëngINEERDE grafts te evalueren, inclusief die met xenogene cellen gezaaid. Representatieve histologie en biomechanische testresultaten na 16 weken postoperatief worden gepresenteerd, waarbij grafts onmiddellijk na implantatie worden getest en contralaterale inheemse ACL's als controles dienen. De huidige studie biedt een reproduceerbaar diermodel om weefselgeëngINEERDE ACL-grafts te evalueren en demonstreert het potentieel van een regeneratieve geneeskundebenadering voor de behandeling van ACL-ruptuur.

Inleiding

Breuk van de voorste kruisband (ACL) is een van de meest voorkomende bandletsels van de knie ^1. Omdat de gescheurde ACL's niet in staat is om te genezen zonder chirurgische ingreep, de beperkingen in activiteiten van het dagelijks leven, evenals de deelname aan sport te rijden dan 175.000 patiënten een operatie ondergaan elk jaar ^2, met een geschatte kosten van een miljard dollar per jaar ^3. Momenteel wordt hetzij autograft of allograft pees voor ligament reconstructie. Hoewel hoge slagingspercentages kan worden bereikt met zowel autograft en allotransplantaat vervanging, zijn ernstige complicaties in verband met deze reconstructie opties ^4. Autograft weefsel wordt geassocieerd met donorplaats morbiditeit en is beperkt in het aanbod, met name in gevallen van re-ruptuur of multi-ligamentaire letsel. Anderzijds wordt allograft weefsel verbonden met vertraagde graft integratie nadelige ontstekingsreactie theoretische infectueuze risico en beperkt Supply ^5. Synthetische niet afbreekbare implantaten werden ontwikkeld in de jaren 1970 en 1980, maar werden gehinderd door premature graft breuk, reacties van het lichaam, osteolyse en synovitis ^6. Als gevolg van deze ernstige problemen, er zijn geen synthetische grafts beschikbaar voor klinisch gebruik in de Verenigde Staten.

Vanwege deze beperkingen met bestaande graft opties en recente ontwikkelingen in de biologie, techniek, en regeneratieve geneeskunde, is er grote belangstelling voor een tissue engineered oplossing voor ACL enten. Huidige tissue engineering strategieën hanteren afbreekbare biologische en synthetische materialen toe te staan ​​voor host ingroei van weefsel, terwijl het vermijden van de beperkingen in verband met permanente synthetisch materiaal implantatie ^7.

Polycaprolacton (PCL) is een biologisch afbreekbaar polymeer dat FDA voor een aantal medische toepassingen, zoals antiverklevingssysteem en wondverband ^8, dat u beensed in een grote verscheidenheid van toepassingen omvattende vasculaire, bot, kraakbeen, zenuwen, huid, en slokdarmkanker tissue engineering ^5,9-16. Gunstige biocompatibiliteit, relatief lange in vivo halfwaardetijd, voldoende mechanische sterkte en hoge elasticiteit bijdragen aan de populariteit van dit polymeer in tissue engineering. In een knaagdier model van wondgenezing, geïmplanteerd electrospun PCL weergegeven niet immunogeen te zijn en te integreren in de lokale weefsel, zonder bijwerkingen ^13. Een SEM afbeelding van electrospun PCL is weergegeven in figuur 1.

Met de huidige FDA wettelijke normen, werkzaamheid en veiligheid bij zowel kleine als grote diermodellen nodig zou zijn voor een PCL of andere gemanipuleerde ACL graft te bewegen in klinische studies in de Verenigde Staten. Bovendien kunnen in vivo omstandigheden vaak vergroten de eigenschappen van een in vitro tissue engineered ACL graft. Een rat model van autologe ACL reconstructie met flexor digitorum longus pees eerder is beschreven, waarbij de inheemse ACL werd doorgesneden, femorale en tibiale tunnels werden geboord, en de graft werd doorgegeven en vastgezet op zijn plaats met hechtdraad ^17-22. In dit artikel zullen we een wijziging van dit model te beschrijven voor de evaluatie van gemanipuleerde ACL vervangingen in plaats van voor-autograft gebaseerde reconstructie (figuur 2).

Hoewel vele diermodellen aanwezig voor ligament tissue engineering, de rat voordelig in vergelijking met grotere modellen voor een aantal redenen. Deze voordelen zijn oa makkelijker veeteelt en behandeling, minder ethische overwegingen, en lagere kosten ^17,23. Bovendien heeft het rattenmodel uitgebreid gebruikt als model voor orthopedische weefselregeneratie, waaronder kraakbeen, pees, en beenweefsel ^24. In het bijzonder werden athymische naakt ratten gekozen vanwege hun gebrek aan celgemedieerde immuunrespons ^25, waardoor de uiteindelijke implantatie of xenogene donorcellen in dit model verder te verbeteren de kunstmatige implantaat in de toekomst. In deze werkwijzen paper beschrijven we de fabricage en chirurgische implantatie van een acellulair, biologisch afbreekbaar polymeer implantaat in een athymische ratmodel van ACL reconstructie.

Protocol

OPMERKING: Alle dieren operaties werden goedgekeurd door de plaatselijke veterinaire personeel en dierlijk gebruik commissie voor aanvang van de experimenten.

1. Voorbereiding van elektrogesponnen Polycaprolacton Steigers

1. Weeg en los medische kwaliteit ester eindigend poly (ε-caprolacton) in korrelvorm in 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol tot 10% maken w / w oplossing van het PCL polymeer. Laat de oplossing roer met een roerplaat minstens 3 uur om een ​​homogene oplossing te verzekeren.
2. Electrospin de PCL oplossing voor een manchet van zeer uitgelijnd PCL vezels voor steiger fabricage creëren.
   1. Bereid de electrospinning opstelling in een zuurkast met de ventilator aan te allen tijde. Deze bestaat uit een grote acryl doos die zal dienen als een geïsoleerd vacuüm medium voor het elektrospinproces en heeft ingangen voor de bron PCL oplossing aangedreven door een spanningsbron, de motoraangedreven verzamelen doorn en een vacuümpoort. Reinig de acrylic doos grondig met ethanol en hebben betrekking op alle oppervlakken met Parafilm bladen om onzuiverheden die de kwaliteit van het electrospun product in gevaar kunnen brengen te verwijderen.
   2. Load ongeveer 3 ml van de bovenstaande oplossing in een 10 ml spuit met een stomp 18 G, 1 ½ inch naald. Verwijder eventuele luchtbellen door het indrukken van de spuit omhoog. Slotoplossing in een programmeerbare spuitpomp. Steek de naald door een klein gat in de acryl doos terwijl ongeveer ½ inch van de naald buiten de acryl doos voor bevestiging van de spanningsbron draad.
   3. Gebruik een 30 mm roterende draaibank doorn als de collector voor de zeer uitgelijnd PCL vezels; betrekking op de doorn stevig met een dunne strook van aluminiumfolie. Vergrendel de doorn in de motor aan de tegenoverliggende zijde van de doos 15 cm afstand van de naald.
   4. Plaats de plastic slang in het vacuüm-poort en verbinding maken met de zuurkast vacuüm bron. Schakel de vacuümbron en dek de acryl doos met een deksel.
   5. Set de infusiesnelheid van de programmeerbare spuitpomp tot 2,5 ml / uur. Zet de motor om de doorn werken bij 3.450 tpm en bevestig de positieve kabel van de spanningsbron aan de naaldtip buitenkant van de doos met behulp van een alligator clip.
   6. Zodra de infusie van de PCL-oplossing is begonnen, zet de spanningsbron en ingesteld op een 20 kV spanning.
   7. Infundeer de oplossing gedurende 12 minuten om een ​​homogene manchet maken van 0,5 ml van de PCL oplossing.
      OPMERKING: gemiddeld elke manchet voldoende electrospun materiaal twee zes-strip platen, die kunnen worden gebruikt in totaal drie vier lagen scaffolds te creëren.
3. Laser gesneden de PCL manchet om meerdere kleine bladen op een VersaLaser Cutter 2.3 werkt bij lage-vacuüminstelling, 10,0 keV landing spanning, 6,4 mm werkafstand, en sonde diameter van 3,0 te vormen.
   Opmerking: In dit voorbeeld werd een computer aided design gebruikt om het mes te instrueren om meerdere vellen opbrengst van 1,5 mm x 35 mm x 150 urn scaffolds metgelijkmatige 150 urn diameter gaten 15% porieoppervlak.
4. Plasma etsen de PCL scaffolds met een plasma reiniger hydrofiliciteit van het oppervlak met PCL ion versnelling induceren. Stel het vacuüm tot 450 mTorr en het behandelen van de draagstructuren voor 30 sec op hoog vermogen (29.6 W).
5. Baden de steigers in 70% ethanol in een steriele omgeving.
6. De vacht van de individuele steigers met collageen om cellulaire hechting en proliferatie in vivo te vergemakkelijken.
   1. Een collageen bekledingsoplossing door verdunning van een 8: 1: 2.5 steriele oplossing van Purecol collageen 3 mg / ml standaardoplossing, 10x PBS en 0,1 N NaOH 1: 9 in 1x PBS bij 4 ° C. Meng grondig tot oplossing homogeniteit.
   2. Coat afzonderlijke 1,5 mm x 35 mm x 150 urn scaffolds met een dunne film van het bovengenoemde collageen oplossing. Laten drogen gedurende 24 uur in een steriele omgeving.
7. Met behulp van een 5-0 Vicryl hechtingen, stapelen en brengen zij vier afzonderlijke 1,5 mm x 35 mm x 150 pm steigersmet een Krackow steek tot een uiteindelijke dikte van 0,6 mm, multi-layered, met collageen beklede scaffold dat klaar voor implantatie creëren.

2. Rat Chirurgie Protocol

1. Induceren anesthesie door het plaatsen van rat in inhalatiekamer en het leveren van 2% isofluraan met 2 l / min zuurstof. Bevestig de rat is voldoende verdoofd door druk uit te oefenen op voet achterbenen en evalueren voor elke reactie.
2. Op de niet-steriele back tafel, subcutaan injecteren 25 mg / kg ampicilline en 0,03 mg / kg buprenorfine.
3. Breng oftalmische zalf voor de ogen. Clip de vacht van de werkzame achterpoot en prep het chirurgisch drie afwisselende scrubs chloorhexidine en 70% ethanol.
4. Breng de rat aan de operatietafel, op een verwarmde pad om onderkoeling te voorkomen. Beveiligde neuskegel, en onderhouden van anesthesie door middel van de procedure met 2% isofluraan in 2 l / min zuurstof, geleverd neuskegel. Draperen op een steriele wijze, waardoor het werkzame onderdeel blootgesteld.
5. Voordat u begint met de operatie, eerst bevestigen adequate verdoving door het ontbreken van een antwoord op de voetdruk achterbenen.
6. Voeg een 2 cm lange verticale insnijding mediaal van de knie, gecentreerd op het niveau van de patella. Trek de huid zijwaarts totdat de incisie wordt gecentreerd over de knie.
7. Gebruik een scalpel een mediale parapatellaire arthrotomie maken afsnijden en mediaal van de patella en proximaal uitstrekt tot het niveau van de musculotendineuze kruising van de quadriceps en distaal tot het niveau van de kniepees aanhechting aan het tibiale tubercule. Zorg ervoor dat u de patella of quadriceps pezen snijden.
8. Vrijkomen knieschijf lateraal door het maken van een 1 cm verticale incisie door de knie capsule net lateraal van de kniepees.
9. Zorg ervoor dat de knie wordt verlengd. Neem een ​​paar fijne schaar en ga onder de knieschijf van lateraal naar mediaal. Verdeel de schaar een paar keer, zodat de extensor mechanisme kan worden vertaald naar beide kanten.
10. Terwijl buigen tHij knie, vertaalt de patella zijkanten aan de binnenkant van het kniegewricht bloot. Zorgen voor duidelijke visualisatie van de intercondylaris notch en femurcondylen. Met behulp van een scalpel, doorsnijden de ACL en PCL in de inkeping.
11. Load power boor met een 1,6 mm k-draad. Plaats k-draad tip over ACL oorsprong in de intercondylaris inkeping. Boor superolaterally en visualiseren van de uitgang op de laterale aspect van het dijbeen, het verwijderen van alle weke delen als nodig is met een scalpel. Passeer de k-draad in en uit een paar keer de vrije doorgang voor het transplantaat te garanderen.
12. Plaats de k-draad op de ACL voetafdruk op het tibiaplateau. Boor anterolaterally en visualiseren exit punt op de anterolaterale proximale tibia. Gebruik scalpel zacht weefsel duidelijk nodig zodat het punt waar de k-uitgang uit het scheenbeen volledig gevisualiseerd.
13. Passeren een verkorte Keith naald (idealiter niet meer dan 2 cm lang) door de dijbeen tunnel. Rijg de twee hechtdraad uiteinden van het ene uiteinde van het transplantaat door het oog van de Keith naald. Gebruik de naald met een uiteinde van het transplantaat te trekken door de femorale tunnel.
14. Herhaal de voorafgaande stap om het andere uiteinde van het transplantaat door het tibiale tunnel.
15. Gebruik 4-0 Vicryl hechting aan het femorale einde van het transplantaat aan op omringende periosteum of ander zacht weefsel met een steek-figuur acht. Handmatig spanning het transplantaat met de knie in extensie. Bevestig het tibiale einde van het transplantaat omringende periosteum of ander zacht weefsel met een steek-figuur acht.
16. Gebruik een schaar om aan beide uiteinden afgesneden overtollige implantaat, waardoor 1-2 mm aan beide uiteinden voorbij het steek-figuur acht.
17. Verleng de knie en vermindering van de patella. Met behulp van een 4-0 vicryl, plaats een enkel cijfer-van-acht steek aan de mediale gewrichtskapsel sluiten, het voorkomen van laterale subluxatie van de patella.
18. Sluit de huid met een draaiende subcutane 5-0 Monocryl of Vicryl hechtdraad voorzichtig de onderliggende spieren niet te hechten of zichtbare hechtdraad zodra de huid wordt gesloten.
19. Inject ratten subcutaan met buprenorfine elke 12 uur voor een totaal van drie dagen na de operatie. Controleer operatieplaats voor drainage of wonddehiscentie ten tijde van de injectie. Hinkend en sommige zwelling normaal in de eerste paar dagen na de operatie, maar prompt pakken elke postoperatieve zorgen in combinatie met het diergeneeskundig personeel. Het dier kan worden terug te keren naar de sociale huisvesting op 2 weken na de operatie, toen chirurgische incisies helemaal genezen zijn.

3. Data Collection Protocol

1. Op het moment van opoffering, stikken ratten individueel in een gesloten CO ₂ kamer gevolgd door thoracotomie.
2. Oogst zowel chirurgisch gereconstrueerd contralaterale ledematen door het scheiden van het heupgewricht.
   1. Voor de gereconstrueerde ledematen, verwijder alle weke delen, met inbegrip van de achterste kruisband en de restanten van het chirurgisch verstoord inheemse ACL, door fijne dissectie om alleen het dijbeen, het scheenbeen en graft isoleren.
   2. Voor de contralaterale ledematen, verwijder alle zachte weefsels behalve de natieve ACL als de femur en tibia door fijne dissectie.
   3. Gebruik een draaiend gereedschap zoals Dremel, al vanaf elk uiteinde van het femur-transplantaat-complex tibia verwijderd maar ¾ tot 1 cm bot.
   4. Tijdens dit proces en de rest van biomechanische testen, regelmatig en veelvuldig spuit de ligamentaire regio's met een normale zoutoplossing om uitdroging van de geoogste knie die valselijk resultaten kunnen veranderen voorkomen.
3. Voor histologische analyse vast elke knie afzonderlijk in 4% paraformaldehyde oplossing bij 25 ° C gedurende 48 uur. Vervolgens onderdompelen knie in een oplossing van Immunocal reagens voor volledige ontkalking; Dit proces is afhankelijk van de inhoud calcific van het monster en kan tot vijf dagen. Controleer individuele monsters dagelijks naar vooruitgang als onvolledig ontkalking kan kwaliteit van het monster lager beoordelen. Eenmaal voltooid, voert snijden, dia montage en kleuring zoals gewenst.
4. Perform biomechanische testen om de functionele capaciteit van de tissue engineered ligament beoordelen.
   1. Bevestig het bovenbeen en onderbeen door de verpakking van 28 G gegalvaniseerd staaldraad rond de epifyse van elk been afzonderlijk. Dit is een onnauwkeurige biomechanische testen data van voortijdig falen treksterkte van het monster bij het bot in plaats van op het ligament van belang voorkomen.
   2. Pot het dijbeen in een mengsel van polymethylmethacrylaat (PMMA) botcement. Om dit te doen, meng de twee cement componenten en direct gebruik maken van de viskeuze mengsel aan het dijbeen te beveiligen in het metaal, het omkleden van de diafyse van het bot in de gecementeerde pot met de epifyse en de bijgevoegde ligament vrij uitsteekt. Laat spontane radicaalpolymerisatie geleidelijk transformeren gemengde viskeuze componenten tot een deegachtig materiaal en uiteindelijk tot een vaste geharde matrix.
      OPMERKING: Dit proces duurt enkele minuten en kan gevolgd worden door handmatig de beoordeling van de temperatuur van een bolus gemaakt vanhet resterende cement; moet de temperatuur tijdelijk te verhogen tijdens de exotherme polymerisatiereactie en nemen tot kamertemperatuur nadat het materiaal stolt.
   3. Herhaal hetzelfde proces hierboven voor het cementeren van de tibia, behalve met behoud van de knie ligament bij 20 ° flexie voor een ideale mechanische testen.
   4. Monteer de gecementeerde femur-graft-tibia complex op een treksterkte testapparatuur, en bereid opnemen belasting en verplaatsing als functie van de tijd vanaf het begin van spanning te mislukken. In dit voorbeeld gebruikten we een Instron Model 5564 met 1 kN laadcel.
   5. Voorspanning het transplantaat 2 N met een helling van 0,5 N / min en test het transplantaat tot mislukking bij een vervormingssnelheid van 0,5 mm / sec. Tijdens het proces, er zeker van zijn dat het ligament wordt niet op het midden van de stof en dat de benige bovenbeen en onderbeen zijn veilig en niet voortijdig falen, die onnauwkeurig biomechanische eigenschappen van de geteste ligament kan beoordelen.
   6. Gebruik de gegenereerde last-verplaatsingbuigt naar breukbelasting en stijfheid van de geteste ligament berekenen.

Resultaten

In onze ervaring 92 rat operaties door een enkele chirurg, gemiddelde operatieduur van incisie voltooid wond 16.9 min, met een standaardafwijking van 4,7 min. Op het moment van opoffering, ratten woog 356 ± 23 g. Alle ratten verdragen de operatie goed, en ervaren geen complicaties. Onmiddellijk na de operatie werden de ratten vastgesteld belastbaarheid van het werkzame uiteinde, maar vertoonde een lichte slap. Door een week na de operatie, alle ratten werden ambulating zonder noemenswaardige slap. De dieren alle opgedaa...

Discussie

ACL verwondingen zijn een veel voorkomende aandoening in de orthopedische chirurgie sport, met beperkte mogelijkheden voor de wederopbouw in de huidige tijd. Om een geschikte tissue-engineered substituut voor de ACL dat regeneratie in vivo zal toestaan ​​te ontwikkelen, is een geschikte diermodel vereist. In deze studie wordt de fabricage van een biologisch afbreekbare engineered graft beschreven, zoals de in vivo implantatie met behulp van een reproduceerbaar model van ACL reconstructie in een athymic...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Medische ester-getermineerde poly (ε-caprolacton), korrelvorm (MW = 110,000)	Lactel Absorbable Polymers		Op bestelling gesynthetiseerd polymeer naar gewenst molecuulgewicht
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol	Sigma-Aldrich	105228	Oplosmiddel voor PCL-polymeer
18 G x 1½" schuine naald	BD Medical	305196
Remote Infuse/Withdraw Programmeerbare Spuitenpomp	Harvard Apparatus	702101
VersaLaser VLS2.30 Lasergraveermachine	Microgeo USA	VLS2.30
Expanded Plasma Cleaner 115 V	Harrick Plasma	PDC-001	Plasma-etsen vlak voor collageencoating voor oppervlaktemodificatie
PureCol Collageen Standaardoplossing, 3 mg/ml	Advanced Biomatrix	5015-A	Meng 8:1:2,5 oplossing van PureCol, 10x PBS, 0,1 N NaOH 1:9 in 1x PBS
Hechtmateriaal, 5-0 Vicryl	Henry Schein	1086471
Hechtmateriaal, 4-0 Vicryl	Henry Schein	6540072
Scherp gepunte dissectieschaar (recht; 4,5 inch)	Fisher Scientific	8940
Buprenorfine hydrochloride	Sigma-Aldrich	B9275	Gebruik 0,03 mg/kg zowel intra- als postoperatief voor pijnbeheersing
Ampicilline, injecteerbaar	Henry Schein	1185678	Gebruik 25 mg/kg subcutaan tijdens de procedure
K-draad, 1,6 mm	Spectrum Surgical	SI040062
Keith Naald, recht 1½"	Delasco Dermatology Lab & Supply	KE-112
Immunocal Decalcifying Solution	Fisher Scientific	NC9491030
Opticryl Acrylhars Botcement (PMMA) (Monomeer en polymeer)	US Dental Depot	OPTICRYL 100410
Instron Model 5564 Trekbank	Instron	5564	Elke vergelijkbare trektestapparatuur is geschikt