Triggering Reactief gliosis<em&gt; In Vivo</em&gt; Door een voorhersenen Stab Injury

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol om een voorhersenen-steekletsel te veroorzaken bij volwassen muizen. De steekwond veroorzaakt ernstige reactieve gliose en gliale littekenvorming die vervolgens kan worden onderzocht met standaard immunohistochemische methoden.

Samenvatting

Na een letsel aan het centrale zenuwstelsel ondergaan astrocyten een breed scala aan biochemische, morfologische en moleculaire veranderingen, die gezamenlijk reaktieve astrogliose worden genoemd. Reactieve astrocyten oefenen zowel inflammatoire als beschermende effecten uit die respectievelijk de neurale reparatie remmen en bevorderen. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de diverse functionele eigenschappen van reaktieve astrogliose zijn niet goed begrepen. Het bereiken van een beter begrip van deze mechanismen is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën om het beschadigde centrale zenuwstelsel te behandelen. Hier demonstreren we een methode om reaktieve astrogliose in de voorhersenen van een volwassen muis te activeren met behulp van een prikletsel in de voorhersenen. Dit letselselmodel is eenvoudig, betrouwbaar en vereist alleen een stereotactisch apparaat en een scalpelmes om het letsel te veroorzaken. Het gebruik van prikletsels als letselselmodel in de voorhersenen is goed gevestigd en geschikt voor studies die zich richten op een breed scala aan neuropathologische uitkomsten, zoals neuronale degeneratie, neuro-inflammatie en verstoringen in de bloed-hersenbarrière (BBB). Daarom dient het prikletselselmodel van de voorhersenen als een krachtig hulpmiddel dat kan worden toegepast voor een breed scala aan studies over de reactie van het centrale zenuwstelsel op trauma.

Inleiding

Een grote uitdaging voor het ontwikkelen van succesvolle therapieën om het beschadigde centrale zenuwstelsel te behandelen, is het onvolledige begrip van de complexe multicellulaire gebeurtenissen die door het trauma worden geactiveerd. Reactieve astrocyten krijgen steeds meer erkenning als een veelbelovend doelwit voor nieuwe therapieën¹. Hoewel ze historisch gezien als vijandig voor neurale reparatie werden beschouwd, worden reactieve astrocyten nu erkend als kritieke onderdelen van een complexe, multicellulaire neuroprotectieve respons die verzwakking van inflammatoire processen en beperking van secundaire schade en neurodegeneratie omvat^2-6. Hoewel de neuropathologische kenmerken van reactieve gliose lang goed gedefinieerd zijn, blijven de cellulaire en moleculaire mechanismen die de reactieve gliose reguleren, en de diverse reeks downstreamgevolgen, slecht begrepen. Het begrijpen van de mechanismen die reactieve gliose aansturen, evenals de daaropvolgende cellulaire en moleculaire gebeurtenissen, is een belangrijke stap in de ontwikkeling van strategieën gericht op het bevorderen van de neuroprotectieve eigenschappen van reactieve gliose, terwijl de schadelijke effecten worden verzwakt.

Hier demonstreren we een methode om ernstige reactieve astrogliose in de voorhersenen van volwassen muizen te induceren met behulp van een steekwond. In tegenstelling tot andere modellen voor traumatisch hersenletsel (TBI), zoals gecontroleerde corticale impact (CCI) of vloeistofpercussieletsel (FPI), die gespecialiseerde apparatuur vereisen om een letsel te veroorzaken, vereist de voorhersenensteek slechts een stereotactisch apparaat om het hoofd te stabiliseren en een No. 11 scalpelmes. Daarom is het voorhersenensteekletselmodel toegankelijker voor een breed scala aan laboratoria die geen toegang hebben tot de gespecialiseerde apparaten die nodig zijn voor het creëren van een FPI- of CCI-letsel. De hier beschreven methode stelt onderzoekers in staat om op betrouwbare en reproduceerbare wijze een robuuste glioserespons te activeren om de daaropvolgende cellulaire en moleculaire gebeurtenissen te onderzoeken. Eenmaal hersteld van de operatie kunnen dieren die een voorhersenensteekletsel hebben ontvangen langere tijd overleven zonder dat er speciale zorg voor nodig is en kunnen ze worden teruggezet naar de kolonie voor acute, intermediaire of chronische studies. Hoewel minder klinisch te vertalen dan FPI- of CCI-modellen van TBI, dient een voorhersenenletsel geproduceerd door een steekwond als een eenvoudig maar nuttig experimenteel model om basisbiologische mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan reactieve gliose en andere neuropathologische gebeurtenissen na trauma aan het centrale zenuwstelsel.

Protocol

Volwassen (3-4 maanden) mannelijke muizen op een gemengde C57BL / 6 achtergrond werden gebruikt in dit protocol. De dieren werden op een 12 uur licht / donker cyclus gehouden, en de vrije toegang tot voedsel en water. Alle procedures uitgevoerd in dit protocol werden uitgevoerd volgens de protocollen van de Drexel University Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.

1. Voorbereiding Chirurgische omgeving

1. Ontsmet chirurgische tafel met 70% ethanol en vervolgens de gehele chirurgische bank met absorberende kussentjes en regelen chirurgische instrumenten naast stereotaxisch.
2. Opzetten stereotaxische apparatuur zonder manipulator arm. Schik de verwarming pad op de stereotaxische en ingesteld op 37 ° C. Vermijd oververhitting van het dier door het plaatsen van een klein stukje papier handdoek of chirurgische pad tussen het dier en de verwarming pad.
3. Met geautoclaveerd schaar gesneden kleine stukjes geautoclaveerde gelfoam in een steriele petrischaal met 0,9% steriele zoutoplossing tot reaDY gebruikt.
   Opmerking: Handhaaf steriele werkomgeving met behulp van geautoclaveerd instrumenten en steriele chirurgische benodigdheden. Re-steriliseren chirurgische instrumenten tijdens de procedure of tussen de dieren door dompelen in een kraal sterilisator voor 10-15 sec, als dat nodig is. Handhaving van schone handschoenen tijdens de hele procedure door te wrijven handen met 70% ethanol, zoals nodig, ontsmet.

2. Prepping Muis voor Heelkunde

1. Verwijder de muis uit huis kooi en weegt (g).
2. Place muis aan isofluraan inductie kamer en stelt zuurstof 2 l / min en isofluraan vaporizer tot 5 een chirurgische vlak van anesthesie, ongeveer 3-5 min induceren. Monitor voor vertraagde ademhaling en immobilisatie. Controleer of de muis is volledig verdoofd met behulp van de teen knijpen reflex.
3. Wanneer de muis is volledig verdoofd, plaatsen in stereotaxische frame, zet de neus in de neuskegel, die is verbonden met slang aan de isofluraan. Plaats oor bars in de gehoorgang en draai, zodat het hoofd is stabiel.
4. Scheer het hoofd van oor tot oor en van tussen de ogen om achter de oren.
5. Steriliseer de huid met afwisselende doekjes isopropylalcohol en betadine joodoplossing, 3 keer per.
6. Pas kunstmatige tranen in beide ogen om te voorkomen dat ze uitdrogen tijdens de chirurgische ingreep.

3. Chirurgische Procedure

1. Bewaken van de diepte van de anesthesie door knijpen de teen of staart. De muis in de juiste chirurgische vlak wanneer er geen respons en de ademhaling is traag en zelfs.
2. Maak een parasagittal huidincisie van net achter de ogen bijna tussen de oren in een enkele, stevige beweging met behulp van een nummer 11 scalpel. Beweeg de huid opzij en clip rechterkant met hemostat.
3. Duidelijke schedel van bovenliggende membraan met behulp van de saaie kant van de nummer 11 scalpel en katoen getipt applicators. Eventueel, veeg de schedel met een wattenstaafje gedoopt in 0,9% zoutoplossing. Laat volledig drogen.
4. Onsing een liniaal, markeer de voorste rand van de craniotomie bij 1 mm caudaal van de coronale hechtdraad en de linkerrand van de craniotomie bij 1 mm lateraal van de pijlnaad (figuur 1), met een permanente marker. Markeer rechts en caudale grens van de craniotomie op 4 mm van de sagittale en coronale hechtingen, respectievelijk (figuur 1).
5. Met behulp van een 0,5 mm boor, beginnen te craniotomy maken door het boren langzaam naar aanleiding van de permanent marker omtrek. Zorg ervoor dat u niet helemaal doorbreken van de schedel. Druk voorzichtig op de geïsoleerde stuk pariëtale bot met No. 5 tang, gebieden van zwakte zal plaatsmaken voor de druk. Wanneer de uitgedund bot is de hele omtrek voldoende zwak, het bot stuk is klaar voor verwijdering.
   OPMERKING: Als de onderzoeker ervaringen moeite verwijderen van de bot in een stuk, dit suggereert dat het bot tijdens het boren niet voldoende is uitgedund. Denk verder boren van de schedel in de daaropvolgende dieren Facilitate gemakkelijk verwijderen van het bot stuk.
6. Met behulp van een 10 ml spuit uitgerust met een 23 G naald, een kleine hoeveelheid van 0,9% zoutoplossing om de geïsoleerde bot geboord gebied geniet.
7. Bevestig de manipulator arm naar de stereotaxische apparatuur. Bevestig een nieuw nummer 11 scalpel om de sonde houder met de scherpe kant van het mes tegenover rostraal.
   Opmerking Hoewel de rostrale en caudale weefsels ervaren scherpe en stompe hoeken van het mes respectievelijk de mechanische schade veroorzaakt door de penetrerende verwonding vergelijkbaar gedurende de omvang van de laesie. We zien geen merkbare verschillen in belangrijke kenmerken van reactieve gliosis waaronder opregulatie van GFAP expressie of proliferatie, tussen rostrale en caudale secties.
8. Houden van de manipulator arm uit de weg, til de geïsoleerde bot met behulp van 5/45 schuine pincet. Steek de punt van de tang in de zijkant van de geïsoleerde bot en een lift, met behulp van leverage te trekken uit het stuk bot achtergelaten in een full beweging.
   OPMERKING: Wees voorzichtig niet naar de hersenen steken of verstoren de dura onder de schedel.
9. Neem een ​​klein stukje van de geweekte absorbeerbare gel schuim en plaatsen op de onbedekte hersenen om te voorkomen dat het uitdroogt en geniet van alle bloed dat aanwezig zou kunnen zijn.
10. Zodra de gel schuim is op zijn plaats, draai de manipulator arm op zijn plaats en passen blad naar het centrum van craniotomy over de gel schuim. Verwijder de gel schuim en laat het mes tot aan de punt raakt de dura zonder aanprikken van de dura. Mark dorsale / ventrale coördinaten met behulp van de nonius schaal op de verticale arm van de stereotaxische.
11. De manipulator arm, langzaam lager het blad precies 3 mm in de hersenen. Dit wordt mogelijk door de nonius markeringen op de manipulator arm. Laat het blad om te verblijven in plaats voor 5-10 sec. Beweeg de stereotaxische arm met mes bevestiging rostral tot drie keer waardoor het mes aan de rostrale en caudale grenzen van de craniotomie bereiken caudaal voordat hij naar de opposite einde.
    OPMERKING: De dura is niet voorafgaand aan het plaatsen van het mes verwijderd. In tegenstelling tot de rat dura, die ~ 80 urn dik ^7, de muis dura aanzienlijk dunner (slechts enkele cellagen dik) en geen merkbare weerstand tegen scalpel produceren tijdens het inbrengen. Gebruik een nieuwe scalpel voor elke muis zodat elk dier krijgt een consistente letsel.
12. Langzaam verhogen de stereotaxische arm, het verwijderen van het mes uit de hersenen. Na verwijdering van het mes, onmiddellijk een nieuw vel van gelfoam op het hersenoppervlak te genieten van overtollig bloed of vloeistof.
13. Ondertussen, verwijder de stereotaxische arm en gooi de No. 11 scalpel. Zodra bloeden is gestopt, verwijder de gelfoam.
14. Sluit de wond hechten van de huid met niet-absorbeerbare hechtdraad, zoals Ethilon of Prolene. Hechtingen moeten na de operatie worden verwijderd 9-10 dagen.
15. Zet de muis aan zijn kooi, en laat de muis langzaam terug op een heating pad en monitor voor tekenen van nood. Herstel van-isofluorane geïnduceerde anesthesie treedt meestal binnen 2-5 minuten na verwijdering uit de isofluorane. Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het borstbeen recumbancy heeft herwonnen.
16. Dien 0,5-1 ml Ringer's oplossing subcutaan om hydratatie te verzekeren.

4. Post-chirurgische zorg

1. Nauw post-operatief te controleren dieren tot het herstel van de anesthesie alvorens terug te keren naar de kolonie.
   1. Om pijn en ongemak postoperatief te verminderen, te beheren 0.05-0.1 mg / kg buprenorfine door ip injectie onmiddellijk na de procedure.
   2. Observeer dieren voor 2-3 dagen post-operatief voor ernstige tekenen van angst zoals beperkte bewegingen, gebrek aan verzorging, of gewichtsverlies. Euthanaseren dieren demonstreren een van deze tekenen van nood en uit de studie.
2. Om histopathologie van gewonde weefsels te onderzoeken, euthanaseren dieren door standaard intracardiale perfusie.
   1. Kort verdoven dieren met een overdosis van ketamine / xylazine, vervolgens intracardiaal geperfuseerd met 15-20 ml 0,9% NaCl of totdat de lever verwijdering van bloed, gevolgd door 60 ml van 4% paraformaldehyde aan het einde van het experiment.
3. Ontleden hersenen en post-fix voor 2-4 uur in 4% paraformaldehyde alvorens naar 30% sucrose-oplossing. Sectie hersenen op een cryostaat bij 40-60 urn en proces standaard histologische en immunohistochemische procedures, of zoals beschreven in Garcia ^8,9.

Resultaten

Omdat dieren die in deze procedure niet behoeft speciale post-operatieve zorg, korte of lange-termijn overleving perioden worden gemakkelijk opgenomen in de studie, afhankelijk van de behoefte aan acute of chronische pathologie na letsel te onderzoeken. Belangrijkste kenmerken van reactieve gliosis, zoals opregulatie van GFAP en hypertrofie van de soma, kan zo vroeg 2-3 dagen na letsel worden genomen. De piek fase van de proliferatie van reactieve astrocyten is gedurende 3-5 dagen na verwonding ^10. De represe...

Discussie

Het is essentieel dat de schedel of de onderliggende dura niet worden beschadigd tijdens het boren. Gebruik lichte druk tijdens het boren aan de schedel te verzekeren wordt niet doorboord. Bovendien dient men tijdens het heffen de schedel stuk naar de dura waarborgen is niet opgeheven met het bot.

De voorhersenen stab letsel hier beschreven modellen een indringende letsel aan het centrale zenuwstelsel. Hoewel minder klinisch vertaalbaar dan TBI modellen zoals FPI of CCI, de voorhersenen stab...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Stereotax	Harvard Apparatus	726049
High speed micro drill	Harvard Apparatus	724950
stainless steel scalpel blade, #11	MedVet	JOR581S
5/45 angled forceps	Fine Science Tools	11251-35
Gelfoam sponge 12 cm x 7 mm	Fisher	NC9841478
Rb anti-GFAP	DAKO	Z033429-2	Dilution - 1:20.000 (bright-field); 1:1.000 (fluorescentie)
Shp anti-BrdU	Abcam	ab1893	Dilution - 1:20.000 (bright-field); 1:500 (fluorescentie)
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution - 1:400 (bright-field)
Biotinylated rabbit anti-sheep	Vector Laboratories	BA-6000	Dilution - 1:400 (bright-field)
Alexafluor 488 goat anti-rabbit	Life Technologies	A-11008	Dilution - 1:400 (bright-field)
Alexafluor 568 donkey anti-sheep	Life Technologies	A-21099	Dilution - 1:1.000 (fluorescentie)
DAPI Nucleic Acid Stain	Life Technologies	D3571	Dilution - 1:1.000 (fluorescentie)
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042-10G	Dilution - 1% (bright-field)