In situ detectie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een gemerkte DNA-Digoxine Probe Targeting 16S rRNA

Samenvatting

Hier is een methode beschreven om bacteriën in paraffine-ingebedde weefsels te lokaliseren met behulp van DIG-gelabelde 16S rRNA-targeterende DNA-sondes. Dit protocol kan worden toegepast om de rol van bacteriën in verschillende ziekten zoals parodontitis, kankers en inflammatoire immuunziekten te bestuderen.

Samenvatting

De aanwezigheid van bacteriën in het zakepitheel en onderliggende bindweefsel in gingivale biopsieën van patiënten met parodontitis is gemeld met behulp van verschillende methoden, waaronder elektronenmicroscopie, immunohistochemie of immunofluorescentie met behulp van bacteriespecifieke antilichamen, en fluorescente in situ hybridisatie (FISH) met behulp van een fluorescentie-gelabelde oligonucleïde sonde. Niettemin worden deze methoden niet veel gebruikt vanwege technische beperkingen of moeilijkheden. Hier is een methode geïntroduceerd om bacteriën in paraffine-ingebedde weefsels te lokaliseren met behulp van DIG-gelabelde DNA-sondes. De paraffine-ingebedde weefsels zijn de meest voorkomende vorm van biopsieweefsels die beschikbaar zijn in pathologiebanken. Bacteriën kunnen worden gedetecteerd op een soortspecifieke of universele manier. Bacteriële signalen worden gedetecteerd als discrete vormen (coccus, staaf, fusiforme en harige vorm) van bacteriën of verspreide vormen. De techniek maakt het mogelijk om andere histologische informatie te verkrijgen: de epithelia, bindweefsel, inflammatoire infiltraties en bloedvaten worden goed onderscheiden. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van bacteriën in verschillende ziekten te bestuderen, zoals parodontitis, kanker en inflammatoire immuunziekten.

Inleiding

Bacteriën spelen een rol in de etiologie van diverse orale aandoeningen zoals periodontitis, pulpitis, pericoronitis, cellulitis en osteomyelitis. Om de rol van bacteriën in de pathogenese van de ziekte te begrijpen en het effect van behandeling te controleren, lokalisatie van bacteriën in het weefsel van belang. De aanwezigheid van bacteriën in gingivale weefsel van patiënten met periodontitis is aangetoond met behulp van verschillende methoden, waaronder elektronenmicroscopie ^1,2, immunohistochemie en immunofluorescentie middel van bacteriën antilichamen ^3-7 en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) ⁸ met een fluorescentie- gelabelde oligonucleotideprobe gericht op 16S rRNA. Toch zijn deze methoden niet op grote schaal gebruikt vanwege technische beperking of moeilijkheden. Vergeleken met antilichamen, probes gericht 16S rRNA zijn gemakkelijk te produceren en het bereiken species-specificiteit. FISH heeft bewezen een uitstekend hulpmiddel voor de visualisatie van bact zijneria in hun natuurlijke omgevingen zoals plaque biofilm. De toepassing van FISH weefselmonsters is beperkt door autofluorescentie van verschillende weefselcomponenten. Bijvoorbeeld, de sterke autofluorescentie van rode bloedcellen vaak belemmert de toepassing van fluorescentietechnieken ontstoken weefsel wanneer zij omvatten bloeden ^9.

Om binnen de ontstoken tandvleesweefsels bacteriën lokaliseren derhalve een in situ hybridisatie onder toepassing van een digoxigenine (DIG) -gemerkte DNA-probe is ontwikkeld en succesvol toegepast ^10,11. Hier een gedetailleerd protocol voor de lokalisatie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp P. gingivalis-specifieke en universele eubacteriële probes beschreven. Het is met name gericht op standaardisatie van de werkwijze, zodat vergelijkbare resultaten kunnen worden weergegeven in andere laboratoria. Dit protocol maakt lokalisatie van bacteriën in hun histologische context en de results zijn zeer reproduceerbaar. De beschreven protocol kan worden gebruikt om bacteriën te lokaliseren hetzij een species-specifieke of universele wijze in verschillende weefsels. De universele probe is met name nuttig voor detecteren van bacteriën in polymicrobiële ziekten en een potentiële rol bacteriën bestuderen ziekten waarbij de rol van specifieke bacteriën niet bekend.

Protocol

1. Probe Voorbereiding

1. PCR-amplificatie van de probe
   1. Voor P. gingivalis-specifieke sonde, versterken van een 343 bp DNA-fragment van P. gingivalis 16S rRNA met PCR met gebruik van de genomische DNA van P. gingivalis en de volgende primers: 5'-AAC TGC TTG CCT TAC AGA GG-3 'en 5'-ACT CGT CGT TAT ATC GCC TC-3' ^10. Voer amplificaties met de volgende cyclusomstandigheden: 35 cycli bij 95 ° C gedurende 30 sec, 60 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 1 min 20 sec gevolgd door een 5 minuten verlenging bij 72 ° C ^10,11.
   2. Versterken de eubacteriële probe onder toepassing van een 70-bp DNA fragment (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') gesynthetiseerd als een oligonucleotide en de volgende primers: 5'- CTG CAG GTR GGY CMT-3' en 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3 ^'11. Voer amplificaties met de volgende cyclus voorwaarden: 40 cycli9 bij 4 ° C gedurende 30 sec, 60 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 1 min 20 s, gevolgd door een 5 minuten verlenging bij 72 ° C ^11,12.
   3. Precipiteren van de PCR producten (≥500 pl) door toevoeging 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 100% ethanol (bij een 10: 1: 2 verhouding) en incubatie bij -20 ° C gedurende 2 uur.
   4. Centrifugeer het mengsel bij 14.000 xg gedurende 15 min, resuspendeer de pellet in 100 ui TE-buffer, en meet de DNA-concentratie optische dichtheid bij 260 nm.
2. DIG-labelen met een DIG DNA labeling en detectie kit
   1. Meng 3 ug van het probe met water tot een eindvolume van 15 pl.
   2. Denatureren het DNA bij 95 ° C gedurende 10 min en snel koelen op ijs.
   3. Voeg 2 ui 10X hexanucleotide mix, 2 pl dNTP mix-labeling, en 1 pl Klenow enzym 15 pi van het gedenatureerde DNA.
   4. Mengen en incuberen bij 37 ° C gedurende 24 uur tot 48 uur en stop de reactie door verwarming bij 65 ° C.
3. Controleer de gevoeligheid van de met DIG gemerkte probe onder toepassing van een DIG DNA labeling en detectie kit
   1. Handmatig laden 1 pl seriële verdunningen van de positieve controle probe in de kit en 1 ng van het met DIG gemerkte probe op nylon membraan en droog gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Kort geniet het membraan in 2 x SSC-buffer (0,3 M NaCl, 30 mM natriumcitraat, pH 7,0) en incuberen van het membraan bij 80 ° C gedurende 1 uur om het DNA te immobiliseren.
   3. Kort geniet het membraan maleïnezuur buffer (MAB, 0,1 M maleïnezuur, 0,15 M NaCl, pH 7,5) en geïncubeerd met anti-DIG alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd antilichaam verdund (1: 5000) in 6 ml blokoplossing ontvangen in de kit bij KT gedurende 30 min.
   4. Was het membraan met MABT (MAB met 1% Tween 20) en 40 pl van het NBT / BCIP oplossing gemengd met 2 ml detectiebuffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M _MgCl2, pH 9,5) op de toepassing membraan gedurende 1 min. Wanneer de gevoeligheid van de gemerkte probeniet bevredigend, herhaal stappen van 1.1.3 naar 1.3.4.
   5. Meet de DNA concentratie van de gelabelde probe (OD260) en de concentratie aan te passen aan 100 ng gl ^-1.
4. Controleer de specificiteit van de DIG-gelabelde probe
   1. Denatureren genomische DNA-monsters (25 ng 3 gl ^-1 per elk monster) uit verschillende bacteriële species, waaronder de bacterie waarop de specifieke probe bij 95 ° C gedurende 10 min en snel koelen op ijs.
   2. Handmatig laadt het gedenatureerde DNA op het nylon membraan en droog gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Kort geniet het membraan in 2 x SSC-buffer en incubeer het membraan bij 80 ° C gedurende 2 uur om het DNA te immobiliseren.
   4. Blokkeer het membraan met een blokkerende oplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
   5. Verdun de sonde 1 ng gl ^-1 in hybridisatiebuffer, denatureren de verdunde probes en toepassing op het membraan.
   6. Incubeer het membraan bij 45 ° C gedurende 1 uur.
   7. Was het membraan driemaal met 2x SSC buffer.
   8. Kort weken het membraan in MAB.
   9. Incubeer met anti-DIG-AP geconjugeerd antilichaam verdund (1: 2000) in 6 ml blokkeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
   10. Was het membraan met MABT en 40 pl van het NBT / BCIP oplossing gemengd met 2 ml detectiebuffer toepassing.
   11. Indien de probe niet de verwachte specificiteit te bereiken, verhoog de hybridisatietemperatuur tot de specificiteit waargenomen.

2. In Situ Hybridization

Opmerking: Om het drogen van de monsters en reagentia te voorkomen, voeren alle incubaties in een vochtige kamer bekleed met natte papieren handdoeken.

1. De-paraffinization en rehydratatie van weefselsecties
   1. Bereid 4 pm dikke coupes van in paraffine ingebedde blokken. Formaline, paraformaldehyde, en zink-gebaseerde fixatief zijn compatibel met dit protocol.
   2. Bereid alle reagentia met DEPC-behandeld water.
   3. Verhit objectglaasjes in een droogoven bij 60 ° C gedurende 30 min en incubeer slides bij kamertemperatuur 30 min.
   4. Dompel glaasjes in 100% xyleen gedurende 5 min driemaal; gebruiken verse xyleen per keer.
      Opmerking: Doe dit-de wassende procedure in een chemische zuurkast.
   5. Dompel de glaasjes in 100% ethanol gedurende 5 minuten tweemaal met verse ethanol telkens en hydrateren specimens in serie 90%, 80% en 70% ethanol oplossing gedurende 5 minuten elk.
   6. Dompel slides in DEPC-behandeld water gedurende 1 min en was glaasjes in DEPC-behandeld PBS (pH 7,4) gedurende 6 min.
2. Voorbehandelingen van weefselsecties
   1. Dompel slides in 0,1 N zoutzuur gedurende 20 minuten en was glaasjes in DEPC-behandeld water gedurende 30 sec.
   2. Teken een hydrofobe barrière rondom exemplaren met een wax pen.
      Opmerking: De grootte van de hydrofobe barrière afhankelijk van de grootte van specimens. Daarom is de hoeveelheden reagentia die in de volgende stappen afhankelijk van de grootte van monsters maar moeten de hy vullendrophobic barrière (50 ul voor kleine monsters en 400 ul voor grote exemplaren).
   3. Behandel specimens met 50 tot 400 ul proteinase K (1-10 ug ml ^-1 in DEPC-behandeld PBS) in een droge oven bij 37 ° C gedurende 30 min en was glaasjes in DEPC-behandeld 1x PBS gedurende 1 minuut.
   4. Geniet slides in 4% paraformaldehyde in DEPC-behandeld PBS gedurende 10 minuten, daarna wassen objectglaasjes in DEPC-behandeld PBS gedurende 1 minuut.
   5. Geniet slides in 0,1 M triethanolamine-HCl (pH 8,0) bevattende 0,5% azijnzuuranhydride gedurende 20 min en was glaasjes in DEPC-behandeld water gedurende 30 sec.
3. Hybridisatie met probe en wassen
   1. Dompel dia's in 2x SSC buffer gedurende 20 min.
   2. Verdun de sonde 1 ng gl ^-1 in hybridisatie buffer (4 x SSC, 50% [vol / vol] formamide, 1 x Denhardt's oplossing, 10% [gewicht / volume] dextraansulfaat, 0,1% [gewicht / volume] natriumdodecylsulfaat, 0,4 mg ml ^-1 zalmsperma DNA). Voor negatieve controles, meng de gelabelde probe metEen 10-voudige overmaat van niet-gemerkte probe.
   3. Denatureren de verdunde probes en 50-400 gl toegepast op weefselcoupes. Leg een deksel slip op de dia en afdichting met nagellak.
   4. Heat slides in PCR machine bij 90 ° C gedurende 10 min en incubeer objectglaasjes in een vochtige kamer O / N bij optimale temperatuur 45 ° C of bepaald bij stap 1.4.11.
   5. Koel de objectglaasjes bij 4 ° C gedurende 30 minuten, verwijder dekglaasjes en dompel dia op seriële SSC buffer als volgende: 4 x SSC gedurende 10 min, voorverwarmde (45 ° C) 2 x SSC gedurende 20 minuten, 2 x SSC gedurende 10 min en 0,2 x SSC gedurende 10 minuten.
4. Detectie met anti-DIG-AP geconjugeerd antilichaam
   1. Was de glaasjes in MABT gedurende 5 min.
   2. Blokkeer met 50 tot 400 ul van blokkeeroplossing met 1% Tween 20 gedurende 20 minuten.
   3. Voeg 50 tot 400 gl anti-DIG-AP-antilichaam verdund in blokkerende oplossing (1: 1000) anld incuberen bij 37 ° C gedurende 90 min.
   4. Was de glaasjes in MABT gedurende 10 min.
   5. Dompel slides detectie buffer die 1% Tween 20 gedurende 5 minuten.
   6. Behandelen met 50 tot 400 μ van 1 mM levamisol (detectie buffer die 1% Tween 20) gedurende 5 minuten om endogene alkalische fosfatase te inactiveren.
   7. Verdeel 50 tot 400 ul van de voorgemengde NBT / BCIP oplossing (verdund in detectiebuffer op 1: 100) op elk monster en incubeer objectglaasjes in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende 2-3 uur totdat het ontwikkelde signaal bevredigend.
   8. Spoel slides met gedeïoniseerd water visualisatie stoppen en 50-400 gl 0,05% [gewicht / volume] methyl green als teller beits bij 37 ° C gedurende 10 min.
   9. Spoel de dia's met gedeïoniseerd water, uitdrogen in 100% ethanol, en onder te dompelen in xyleen.
   10. Breng 80 ul van montage oplossing op elke dia en dek af met dekglaasjes.

Resultaten

Figuur 1 toont dot blotting van DIG-gelabelde probes vergeleken met de positieve controle probe in de kit om de gevoeligheid te bepalen. De 343 bp P. gingivalis-specifieke probe is 25 maal gevoeliger dan 70 bp eubacteriële probe. Figuur 2 toont in situ-hybridisatie van gingivale weefsel van patiënten met chronische periodontitis voor detectie van P. gingivalis en eubacteria. De bacteriële signalen getoond in violet, werden gedetecteerd binnen het epitheel, de ...

Discussie

Hier een protocol bij bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een DIG-gemerkte DNA probe is beschreven lokaliseren. De probe richt de DNA- of RNA-moleculen van bacteriële 16S rRNA-gen en het 16S rRNA-targeting probes worden ontworpen zoals deze species-specifieke of universele. De specifieke hybridisatie van het P. gingivalis -specifieke probe P. gingivalis maar niet met andere orale bacteriën werd aangetoond ^10. In tegenstelling, de eubacteriële probe hybridiseerde met elke...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Azijnzuur-anhydride	Sigma	6404
50% Dextran sulfaat oplossing	Millipore	S4030
50X Denhardt’s oplossing	Sigma	D2532
DEPC	Sigma	P159220
DIG DNA label- en detectiekit	Roche	11 093 657 910
Formamide	Sigma	F9037
ImmEdge™ Pen	Dako	H-400
Levamisol	Vector	SP-5000
Magnesiumchloride	Sigma	246964
Maleïnezuur	Sigma	M0375
Methylgroen	Sigma	M6776
Paraformaldehyde	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Zalmaksperma-DNA-oplossing	Invitrogen	#15632-011
Natriumchloride	Sigma	S9625
Natriumcitraat	Duksan	D1420
Natriumdodecylsulfaat	Amresco	227
Triethanolamine-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Research organics	3098T