Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie

Summary

Dit protocol beschrijft het gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) om de tijdelijke opname volgen van cellen die op een bepaald tijdstip waren in de S-fase mogelijk. Toevoeging van DNA kleurstoffen en antilichamen etikettering bevordert gedetailleerde analyse van het lot van de S-fase cellen op latere tijdstippen.

Abstract

Dit protocol beschrijft een methode om het volgen van cellen door de celcyclus mogelijk te maken zonder dat de cellen gesynchroniseerd hoeven te zijn. Het bereiken van celsynchronisatie kan voor veel celsystemen moeilijk zijn. Standaardpraktijk is om de voortgang van de celcyclus in een specifiek stadium te blokkeren en vervolgens de opgehoopte cellen vrij te geven, waardoor een golf van cellen gezamenlijk door de cyclus gaat. Sommige celtypen vinden deze blokkade echter toxisch, wat resulteert in abnormale celcycli, of zelfs massale celdood. Bromodeoxyuridine (BrdU) opname kan worden gebruikt om het celcyclusstadium van individuele cellen te volgen. Cellen nemen deze synthetische thymidine-analogon op, terwijl ze nieuw DNA synthetiseren tijdens de S-fase. Door BrdU gedurende een korte periode aan te bieden, is het mogelijk om een pool van cellen te markeren die zich in de S-fase bevonden terwijl de BrdU aanwezig was. Deze cellen kunnen vervolgens worden gevolgd door de rest van de celcyclus en in de volgende ronde van replicatie, waardoor de duur van de celcyclusfasen kan worden bepaald zonder dat een potentieel toxische celcyclusblokkering hoeft te worden geïnduceerd. Het is ook mogelijk om de expressie van zowel interne als externe eiwitten te bepalen en te correleren tijdens de volgende stadia van de celcyclus. Deze kunnen worden gebruikt om de toewijzing van het celcyclusstadium verder te verfijnen of effecten op andere cellulaire functies zoals checkpointactivering of celdood te beoordelen.

Introduction

De beoordeling van de celcyclus eigenschappen en veranderingen die optreden in cellen tijdens de celcyclus is essentieel voor het begrijpen van vele aspecten van de biologie, in het bijzonder kanker biologie. Vele middelen in ontwikkeling voor de behandeling van maligne aandoeningen ingrijpende effecten op celcyclusprogressie en celdood induceren via celcyclus afhankelijke mechanismen. Om celcyclus dynamics of cellen te bestuderen in een bepaalde fase van de celcyclus, is het gebruikelijk om cellen te synchroniseren. Echter synchronisatiemethode kunnen nadelige effecten hebben op de cellen bestudeerd, potentieel verwarrende resultaten verkregen. ¹ Onlangs het gebruik van fluorescent gelabelde eiwitten die alleen aanwezig op bepaalde stadia van de cyclus cellen hebben het mogelijk analyse van de celcyclus in individuele cellen in de tijd ^2, maar de cellen te bestuderen moeten genetisch worden gemanipuleerd om deze gemerkte eiwitten tot expressie, beperkt het gebruik ervan tot systemen waarop dit kan worden gelezenily bereikt.

De celcyclus bestaat uit twee actieve fasen: de synthese (S) fase, waarin DNA wordt gerepliceerd en mitose (M), waar de celdeling plaatsvindt. De fasen worden gescheiden door drie spleet fasen G _0, G ₁ en _G2. G ₀ of rust, een rustfase waarin de cel cyclus heeft verlaten, G ₁ is waar de cellen in omvang toenemen voorafgaand aan DNA-replicatie en G ₂ waarbij celgroei verder tussen de voltooiing van DNA-replicatie maar vóór de celdeling. Het doorlopen van de celcyclus wordt geregeld door een aantal checkpoints. De G ₁ checkpoint wordt geactiveerd wanneer milieu-omstandigheden zijn niet ondersteunend van DNA-synthese en voorkomt toegang tot de S-fase. Het intra-S-fase checkpoint of vertraging kan worden veroorzaakt door DNA-schade die kan leiden tot stilstand gekomen replicatie vorken. Tijdens G ₂ de trouw van de gerepliceerde DNA wordt bevestigd en als er schade dan wordt gedetecteerd de G ₂ checkpoint wordt geactiveerd waardoor DNA-reparatie voor celdeling. Een laatste checkpoint tijdens de mitose zorgt ervoor dat chromatids correct zijn uitgelijnd op de mitotische plaat zodat celdeling met succes kan worden afgerond. ³ Activering van deze controleposten wordt vaak gebruikt om celpopulaties te synchroniseren. Celcyclus kan worden geactiveerd door een aantal factoren, maar in kankerbiologie de meest voorkomende is detectie van DNA schade. De DNA schade respons wordt geïnitieerd door de PI3-kinase-kinases ataxia telangiectasia en Rad3 verwante (ATR) en ataxia telangiectasia gemuteerd (ATM) de stroomafwaartse effector kinases Chk1 en Chk2 activeren resp. ³ een reeks gebeurtenissen activeert Chk1 inclusief stilstand replicatievorken, DNA verknopingen en ultraviolette straling beschadiging tijdens Chk2 wordt hoofdzakelijk geactiveerd door dubbelstrengige breuken.

De gebruikelijke methode voor het bestuderen van het effect van veranderde condities op de lengte van de celcyclus is om de cellen te synchroniseren in een bepaalde fase van de celcyclus. ¹ Dit kan via verscheidene werkwijzen. Cellen kunnen fysisch gescheiden worden op basis van grootte, densiteit, zijwaartse verstrooiing (korreligheid) en expressie aan het celoppervlak markers. Meer praktisch kunnen cellen worden gesynchroniseerd door chemische middelen. Diverse middelen zoals thymidine, hydroxyurea en cytosinearabinoside kan worden gebruikt om DNA-synthese te remmen in de S-fase van de celcyclus resulteert in een accumulatie van cellen in de S fase die cycling voortgezet nadat de middelen worden verwijderd. Cellen behandeld met nocodazole, die de vorming van de mitotische spoel, aanhouding wordt gevormd met een G ₂ - of M-fase DNA gehalte. Verwijdering van serum uit het kweekmedium resulteert in de accumulatie van cellen bij G ₀ fase. De hernieuwde toevoeging van nutriënten in de kweek serum opnieuw start de normale cyclus van de cellen. Echter, al deze synchronisatiemethode hindert tijdens fietsen en de groei van cellen en kan Result in significante celdood.

Synchronisatie van acute lymfatische leukemie cellen is bijzonder uitdagend en deze cellen zijn niet vatbaar voor genetische manipulatie. De hier beschreven methode laat de beoordeling van de celcyclus dynamiek en het onderzoek van cellen in bepaalde fasen van de celcyclus zonder de traditionele synchronisatie of genetische modificatie. Deze werkwijze kan ook nuttig zijn voor andere celtypen indien de genetische modificatie en traditionele synchronisatieprocedures zijn niet gemakkelijk verwezenlijkt. De methode is gebaseerd op de reeds lang bestaande gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) integratie, die zeer weinig invloed op de groei op korte termijn en de proliferatie van cellen heeft. ⁴ Opgericht BrdU protocollen profiteren van de incorporatie van BrdU in nieuw gesynthetiseerde DNA tijdens de S-fase . Dit markeert permanent cellen bij blootstelling BrdU in de S-fase te zijn geweest. Deze populatie kan op latere tijdstippen worden geïdentificeerd door kleuring BrdU incorporatie en daarmee fungeren als een gesynchroniseerde bevolking die kunnen worden gevolgd en beoordeeld in de tijd het toelaat de studie van de effecten van geneesmiddelen op de celcyclus transit. BrdU blootgesteld dient te worden vóór antilichaamkleuring, gewoonlijk bereikt na DNase of zuurbehandeling. ^6,7 behulp van flow cytometrie op te sporen opgenomen BrdU maakt de opneming van bijkomende markers. Het belangrijkste is de toepassing van kleurstoffen om DNA gehalte te meten, waardoor de beoordeling van de celcyclus faseverdeling van de cellen die aan het begin van het onderzoek waren in de S-fase. ⁸ bovendien extra oppervlak of intracellulaire antigenen kunnen ook worden bestudeerd. ⁹ Die kunnen betrekking hebben op celcyclus gebeurtenissen zoals Ki67 of schijnbaar niets cel functies zoals apoptose markers zoals gesplitst caspase-3. De toepassingsmogelijkheden worden beperkt door de verbeelding van de onderzoeker.

Protocol

De hier beschreven protocol gebruikt de acute lymfoblastische leukemie cellijn NALM6 maar kan worden toegepast op andere celtypen.

1. Oplossingen en reagentia

1. Compleet RPMI
   1. Voeg 56 ml foetaal kalfsserum (FCS) en 5,5 ml van 200 mM L-glutamine om een ​​fles van 500 ml RPMI-1640-medium.
2. BrdU voorraadoplossing
   1. Bereid 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS).
3. BrdU complete RPMI
   1. Voeg 6,2 ul van BrdU voorraad oplossing voor 10 ml compleet RPMI.
4. DNase Solution
   1. Bereid 1 mg DNase / ml in DPBS.
5. Kleuring Buffer
   1. Bereid 3% door warmte geïnactiveerd FCS en 0,09% natriumazide in DPBS.
6. Raadpleeg Materials List voor definities van Fixatie Buffer, Permeabilisatie Buffer en Wash Buffer.

2. Cellen

Neete: Cellen werden gekweekt gedurende niet meer dan 6 maanden. Deze methode is rechtstreeks aanpasbaar aan elke niet-hechtende cellijn met aanpassingen die celdichtheid en cultuurmedia. Met cellen die exponentieel groeien in het begin van het experiment.

1. Handhaaf NALM6 cellen in T-75 kolven in complete RPMI. Voer alle stappen onder steriele omstandigheden met behulp van een klasse II bioveiligheid kabinet.
   1. Handhaaf NALM6 cellen tussen 1-2 x 10 ⁶ cellen per ml door het splitsen van de cultuur driemaal per week.
   2. Incubeer bij 37 ° C in 5% _CO2 in lucht.

3. Pulse Labeling van cellen met BrdU

LET OP: Behandel BrdU met zorg want het is een potentiële mutagene stof en teratogeen.

1. Centrifugeer cellen bij 150 g gedurende 5 min. Opmerking: Overdracht cellen in vers medium verbetert de reproduceerbaarheid van de resultaten.
2. Voer een celgetal en resuspendeer cellen in complete RPMI bij 2 x 10 ⁶ cells / ml.
3. Verdun 1 cellen in 2 met BrdU complete RPMI produceren van een uiteindelijke celconcentratie van 1 x 10 ⁶ cellen / ml.
4. Incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 45 minuten, verdun 1 cellen in 10 met complete RPMI. Centrifugeer cellen bij 150 g gedurende 5 min en gooi zorgvuldig alle supernatant.
5. Resuspendeer cellen in een klein volume (~ 100 ul) volledig RPMI, voert een celtelling en aanpassen aan 1 x 10 ⁶ cellen / ml.
6. Pipetteer 1 ml van cellen in de putjes van een 48 putjesplaat. Pipetteer 1 ml van DPBS in een onbezette putten meer reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
7. Incubeer bij 37 ° C in 5% _CO2 in lucht gedurende de gewenste tijdstippen, hier 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23 en 24 uur. Opmerking: De tijdsduur zal afhangen van wat proefopzet wil meten.
8. Breng alle cellen in FACS buisjes met een pipet. Spoel het goed achtereenvolgens met 1 ml Volumes PBS tot een totaal eindvolume van 5 ml.
9. Centrifugeer bij 150 xg gedurende 5 minuten en verwijder alle supernatant. De cellen zijn klaar voor vlekken, deze (deel 4) onmiddellijk uit te voeren.

4. cel kleuring

Opmerking: Wanneer vlak kleuring van cellen noodzakelijk onderhoud verrichten vóór fixatie, zodat de cellen worden bewaard bij 4 ° C gedurende.

1. Resuspendeer cellen in 100 pl buffer kleuring (voor optionele oppervlakte kleuring, voeg de aanbevolen hoeveelheid antilichaam tegen antigenen oppervlak en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C).
2. Voeg 1 ml vlekken buffer, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 150 x g en de bovenstaande vloeistof.
   Opmerking: specifieke antilichamen, concentratie, incubatietijd enz varieert afhankelijk van de specifieke experimentele doelen.
3. Fixatie en Permeabilisatie
   1. Resuspendeer cellen in 100 gl fixatie buffer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
   2. Voeg 1 ml of wasbuffer, centrifugeer gedurende 5 minuten bij 150 x g en de bovenstaande vloeistof.
   3. Resuspendeer cellen in 100 gl permeabilisatie buffer en incubeer de cellen gedurende 10 min op ijs.
   4. Voeg 1 ml wasbuffer, centrifugeer 5 min bij 150 xg, de bovenstaande vloeistof.
   5. Resuspendeer cellen in 100 gl fixatie buffer per buis en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
   6. Voeg 1 ml wasbuffer, centrifugeer 5 min bij 150 xg, de bovenstaande vloeistof.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken, indien nodig. De gefixeerde cellen zijn stabiel gedurende verscheidene dagen bij 4 ° C indien geresuspendeerd in kleurbuffer. Verwijder de vlekken buffer volgende centrifugeren voordat u verder gaat.
4. DNase behandeling
   1. Resuspendeer cellen in 100 ul DNase-oplossing (30 ug DNase / 10 ⁶ cellen) cellen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
   2. Voeg 1 ml wasbuffer, centrifugeer bij 150 xg gedurende 5 min en gooi supernatant.
5. Antilichaamkleuring
   Opmerking: Kleuring anders dan BrdU intracellulaire merkers simultaan worden uitgevoerd met BrdU kleuring.
   1. BELANGRIJK: Bereid compensatie controles bestaande uit ongekleurde en cellen gelabeld met elke afzonderlijke fluorochroom. Gebruik bij voorkeur dezelfde antilichamen compensatie controles als die welke in het experimentele tubes. Indien dit niet mogelijk, vervanging antilichamen tegen sterk tot expressie gebrachte antigenen geconjugeerd met hetzelfde fluorochroom.
   2. Resuspendeer de cellen in 50 ui wasbuffer en voeg 1 pl / 10 ⁶ cellen van BrdU antilichaam. Opmerking: Direct geconjugeerde antilichamen tegen andere specifieke intracellulaire antigenen kunnen ook worden toegevoegd.
      NB. Antilichamen tegen histon H3 gefosforyleerd op SER10 kan worden gebruikt om te discrimineren tussen cellen in G2 en M, histon H3 is gefosforyleerd op SER10 tijdens mitose ¹⁰ Antilichamen tegen cdc2 gefosforyleerd op Tyr15 kan worden gebruikt om cellen te detecteren have vastbesloten om mitose. ¹¹
   3. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
   4. Voeg 1 ml wasbuffer, centrifuge cellen bij 150 g gedurende 5 min en gooi supernatant.

6. Stain DNA voor celcyclusanalyse
   1. Maak pellet en voeg 20 ul van de 7-AAD-oplossing (0,25 ug). Opmerking: Het is belangrijk om een ​​constante hoeveelheid 7-AAD / cel gebruiken.
   2. Resuspendeer de cellen in 1 ml buffer kleuring.

5. Het verzamelen van flowcytometrie gegevens

Opmerking: De machine vereiste afhangen van het aantal en de aard van de gebruikte fluorochromen.

1. Verzamel de volgende parameters: A FSC-SSC-A, FSC-H (FSC-W kan worden gebruikt in plaats van FSC-H) en 7-AAD fluorescentie op een lineaire schaal. Verzamel de APC-kanaal op een log schaal. Verzamel alle extra kanalen die nodig zijn voor de beoordeling van de ondergrond of interne labels met een log schaal.
2. Voer comcompensatie van overlappende signalen in emissie spectra waargenomen tussen verschillende fluorochromen vóór de analyse van de monsters. Opmerking: De meeste flowcytometers zal deze automatisch uit te voeren.
3. Verzamel minstens 10.000 events voor elk monster.

6. Analyse van de flowcytometrie gegevens

Opmerking: FlowJo werd gebruikt in deze studie flowcytometrie gegevensanalyse maar andere softwarepakketten kunnen gebruikt worden. De gating strategie is geïllustreerd in figuur 1.

1. Identificeer de levensvatbare celpopulatie met FSC-A en SSC-A parameters.
2. Binnen deze populatie uit te sluiten wambuizen en aggregaten met FSC-A en FSC-H (FSC-W kan ook hier worden gebruikt).
3. Binnen deze populatie set een puntenplot behulp 7-AAD op de x-as en BrdU-APC op de y-as.

Figuur 1: Gating Strategy Links pa.nel: ungated cellen worden getoond op een FCS-A vs. SSC-A dot plot. De levensvatbare celpopulatie wordt geïdentificeerd door de getoonde poort. Center panel: cellen gated uit het linker paneel worden weergegeven op een FSC-A versus FSC-H dot plot (FSC-W kan worden gebruikt in plaats van de hoogte). Wambuizen en aggregaten worden geïdentificeerd en uitgesloten door de getoonde poort. Rechter paneel: cellen gated van het doublet datum uitsluiting in het middenpaneel worden weergegeven op een 7-AAD vs. APC-A dot plot. De BrdU antilichaam wordt gelabeld met APC voor identificatie van cellen die BrdU hebben opgenomen tijdens de puls labeling. 7-AAD geeft informatie over DNA-inhoud. De bovenste poort definieert cellen positief voor BrdU en dus in S-fase op het moment van de BrdU puls, de linker poort, cellen in G _0/1 en de lagere juiste poort die in de _G2 / M. Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur.

4. Celcyclus A NALYSE
   1. Open het eerste gegevensbestand en hek aan de cellen in het doublet uitsluiting gate.
   2. Analyseer deze populatie voor de celcyclus distributie (onder platforms in FloJo software) en het gebruik van de decaan-Jett-Fox model.
   3. Verkrijgen van de posities van de G _0/1 en G ₂ / M pieken gebruik maken gates.
   4. Poort aan de BrdU positieve cellen en onder deze populatie aan dezelfde celcyclusanalyse.
   5. Bepaalt de precieze positie van de G _0/1 en G ₂ / M pieken volgens dezelfde gates van aanmaken gates en die beperkingen (de geschapen gates) van de posities van de G _0/1 en G ₂ / M pieken. Dit wordt geïllustreerd in de eerste panelen 2 van figuur 2.
      Opmerking: andere software kan ook worden gebruikt om de gegevens te analyseren en de instructies zouden dienovereenkomstig.

840 / 52840fig2highres.jpg "width =" 700 "/>
Figuur 2:. Celcyclusprogressie Het eerste paneel (alle cellen) is afgesloten op de celpopulatie bepaald door het doublet uitsluiting gate. Deze populatie werd weergegeven in een histogram met 7-AAD op de X-as. De piek van de G _0/1 piek aangegeven door de pijl onder de as. In daaropvolgende panels BrdU-positieve cellen werden afgesloten als figuur 1. De waarde voor de G _0/1 positie verkregen wanneer het poorten van het doublet uitsluiting gate wordt toegevoerd aan het BrdU positieve gated cellen in FlowJo celcyclus software. Elke volgende panel werd afgesloten op BrdU positieve populatie zoals getoond in figuur 1 en de positie van de G _0/1 piek op basis van de verkregen bij het ​​analyseren van de gehele populatie zoals in de eerste twee panelen waarde. De BrdU negatieve fractie om de locatie van de G _0/1 populatie te identificeren voor BrdU positieve cellen in dezelfde sample bedieningsorganen voor een geringe verschuiving van de intensiteit van de DNA vlek tussen de monsters. Het nummer dat op elk paneel nummer de sinds de BrdU pulse beëindigd. De berekende celcyclus fasen worden weergegeven in schaduwrijke groen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Deze methodologie kan worden gebruikt om verschillende informatie te verkrijgen. Enkele toepassingen zijn hier geschetst.

Beoordeling van de duur van de celcyclus

Om de tijd die nodig is voor de cellen om doorvoer door de celcyclus te bepalen, worden de cellen geoogst op verschillende tijdstippen na de BrdU pulse. De intervallen tussen evaluaties kan worden aangepast aan de specifieke cellen geanalyseerd. Hematopoietische cellijnen werden beoordeeld elk uur gedur...

Discussion

Het vermogen om de celcyclus analyse is belangrijk voor het begrijpen van kankerbiologie en het werkingsmechanisme van beide geneesmiddelen en genen die de celproliferatie en groei beïnvloeden. Hoewel er een groot aantal assays die naar verluidt meten celproliferatie, de meeste geven slechts een maatregel die het aantal cellen aanwezig aangeeft. Deze omvatten testen die het aantal cellen door directe visualisatie en tellen, metabole activiteit of ATP concentratie te meten. Het belangrijkste voordeel van veel van deze we...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC BrdU Flow Kit	BD Biosciences	552598	Bevat BrdU antilichaam, 7-AAD en BD Cytofix/Cytoperm Buffer (aangeduid als Fixatiebuffer)
BD Cytoperm Permeabilisatiebuffer Plus	BD Biosciences	561651	Aangeduid als Permeabilisatiebuffer
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	Aangeduid als Wasbuffer
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75 mm FACS buizen	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA flow cytometer	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 zonder L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Fetaal bovien serum	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutamine	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150 cm2 geventileerde flessen	BD Biosciences	355001
Pipetten 25 ml	Greiner	760180
Aersol Pipetten 200 µl	Interpath	24700
Aersol Pipetten 1 ml	Interpath	24800
Centrifuge	Spintron	GT-175R
CO2 incubator	Binder	C 150
AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antilichaam	Cell Signalling	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Konijn mAb	Cell Signalling	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Konijn mAb	Cell Signalling	2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128