Temporal Tracking van celcyclusprogressie behulp van flowcytometrie zonder de noodzaak voor synchronisatie

Summary

Dit protocol beschrijft het gebruik van broomdeoxyuridine (BrdU) om de tijdelijke opname volgen van cellen die op een bepaald tijdstip waren in de S-fase mogelijk. Toevoeging van DNA kleurstoffen en antilichamen etikettering bevordert gedetailleerde analyse van het lot van de S-fase cellen op latere tijdstippen.

Abstract

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

Introduction

De beoordeling van de celcyclus eigenschappen en veranderingen die optreden in cellen tijdens de celcyclus is essentieel voor het begrijpen van vele aspecten van de biologie, in het bijzonder kanker biologie. Vele middelen in ontwikkeling voor de behandeling van maligne aandoeningen ingrijpende effecten op celcyclusprogressie en celdood induceren via celcyclus afhankelijke mechanismen. Om celcyclus dynamics of cellen te bestuderen in een bepaalde fase van de celcyclus, is het gebruikelijk om cellen te synchroniseren. Echter synchronisatiemethode kunnen nadelige effecten hebben op de cellen bestudeerd, potentieel verwarrende resultaten verkregen. ¹ Onlangs ....

Protocol

De hier beschreven protocol gebruikt de acute lymfoblastische leukemie cellijn NALM6 maar kan worden toegepast op andere celtypen.

1. Oplossingen en reagentia

1. Compleet RPMI
   1. Voeg 56 ml foetaal kalfsserum (FCS) en 5,5 ml van 200 mM L-glutamine om een ​​fles van 500 ml RPMI-1640-medium.
2. BrdU voorraadoplossing
   1. Bereid 32,5 mM BrdU (10 mg / ml) in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS).
3. BrdU complete RPMI
   1. Voeg 6,2 ul van BrdU voorraad oplossing voor 10 ml compleet RPMI.
4. DNase Solution
   1. Bereid 1 mg DNase / ml in DPBS.

Results

Deze methodologie kan worden gebruikt om verschillende informatie te verkrijgen. Enkele toepassingen zijn hier geschetst.

Beoordeling van de duur van de celcyclus

Om de tijd die nodig is voor de cellen om doorvoer door de celcyclus te bepalen, worden de cellen geoogst op verschillende tijdstippen na de BrdU pulse. De intervallen tussen evaluaties kan worden aangepast aan de specifieke cellen geanalyseerd. Hematopoietische cellijnen werden beoordeeld elk uur gedur.......

Discussion

Het vermogen om de celcyclus analyse is belangrijk voor het begrijpen van kankerbiologie en het werkingsmechanisme van beide geneesmiddelen en genen die de celproliferatie en groei beïnvloeden. Hoewel er een groot aantal assays die naar verluidt meten celproliferatie, de meeste geven slechts een maatregel die het aantal cellen aanwezig aangeeft. Deze omvatten testen die het aantal cellen door directe visualisatie en tellen, metabole activiteit of ATP concentratie te meten. Het belangrijkste voordeel van veel van deze we.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC BrdU Flow Kit	BD Biosciences	552598	Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer)
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus	BD Biosciences	561651	Referred to as Permeabilization buffer
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	Referred to as Wash buffer
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA flow cytometer	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Fetal Bovine Serum	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutamine	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150 cm2 vented Flasks	BD Biosciences	355001
Pipettes 25 ml	Greiner	760180
Aersol Pipettes 200 µl	Interpath	24700
Aersol Pipettes 1 ml	Interpath	24800
Centrifuge	Spintron	GT-175R
CO2 incubator	Binder	C 150
AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody	Cell Signalling	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb	Cell Signalling	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb	Cell Signalling	2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128